肝癌HSV-tk/ACV基因治疗的实验研究

目的：观察单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV－tk基因,自杀基因）与阿昔洛韦（ＡＣＶ）系统对人肝癌细胞的体外杀伤效果。方法：体外培养已感染含ＨＳＶ-tk基因的重组逆转录病毒的PA317-tk细胞,获取含HSV－tk基因的重组逆转录病毒颗粒。用后者感染人肝癌细胞株SMMC－7721,G418培养基筛选抗性克降SMMC-7721-tk,并以PCR技术检测HSV-tk基因判断转染成功与否。用形态学方法和MTT法检测ACV对SMMC－7721－tk细胞的杀伤作用。结果：SMMC－7721－tk细胞经PCR证实含PCR－tk基因。形态学观察显示,ACV浓度在0.01-1μg/ml时,SMMC－7721－tk细胞小部分死亡,在浓度自1μg-1000μg/ml时,细胞大部分死亡;HE染色可见细胞凋亡。MTT法测定显示,ACV浓度自1μg/ml开始即对SMMC－7721－tk细胞产生明显抑制作用,抑制率自49％到78％,作用强度呈ACV浓度依赖性。各种浓度的ACV对SMMC－7721细胞没有或只有轻度抑制作用。结论：HSV－tk/ACV系统体外对肝癌细胞有明显的杀伤作用,有可能成为临床基因治疗方案。     

单纯疱诊病毒胸苷激酶基因转染联合药物对卵巢上皮癌细胞杀伤作用的研究

目的：探讨逆转录病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV1-tk）基因转染,联合抗病毒药物羟甲基无环鸟苷（ganciclovir,GCV）和无环鸟苷（acyclovir,ACV）对人卵巢上皮癌（OEC）细胞系TYK的杀伤作用。方法：用lipofection reagent介导法将PLNTK5质粒转移入包装细胞PA317中,用滴度最高的PA317病毒上清液转染TYK细胞,运用MTT法及光镜、电镜检测GCV、ACV对目的细胞的体外杀伤效应。结果：将PLNTK5质粒转入PA317细胞后,得到了稳定的产病毒细胞株。TYK细胞可被病毒上清液转染,转导HSV1-tk基因可显著增强ACV、GCV对TYK细胞的杀伤作用。结论：逆转录病毒可介导HSV1-tk基因转染TYK细胞并获稳定表达,ACV、GCV对携有HSV1-tk基因的卵巢癌细胞有明显的体外杀伤作用。     

HSV-tk/GCV系统对人宫颈癌细胞株ME180旁观者效应的研究

目的：研究以逆转录病毒载体介导的HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞株的旁观者效应。方法：应用脂质体及ploybrene转染技术，将重组逆转录病毒载体PLXSN－HSV－tk，导入PA317包装细胞，以其分泌的逆转录病毒感染宫颈癌ME180细胞（ME），建立ME／TK转化细胞株。观察GCV对ME、ME／TK细胞的存活率及旁观者效应。结果：从病毒滴度、电镜及PCR检查，证实tk基因随病毒的感染已成功地导入PA317及ME180细胞。ME／TK细胞对GCV的敏感性显著高于亲代ME细胞。ME／TK及ME＋ME／TK混合细胞还随GCV浓度的增加受到明显的抑制。ME＋ME／TK混合细胞的存活率，随ME／TK细胞比例的增加而降低，说明TK／GCV系统不但能杀伤tk^ 细胞，也能杀伤未导入tk的细胞，存在明显的旁观者效应。结论：HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞具有明显的杀伤及旁观者效应。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因转染联合药物对卵巢上皮癌细胞杀伤作用的研究

目的:探讨逆转录病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1-tk)基因转染,联合抗病毒药物羟甲基无环鸟苷(ganciclovir,GCV)和无环鸟苷(acyclovir,ACV)对人卵巢上皮癌(OEC)细胞系TYK的杀伤作用.方法:用lipofectionreagent介导法将PINTK5质粒转移入包装细胞PA317中,用滴度最高的PA317病毒上清液转染TYK细胞,运用MTT法及光镜、电镜检测GCV、ACV对目的细胞的体外杀伤效应.结果:将PLNTK5质粒转入PA317细胞后,得到了稳定的产病毒细胞株.TYK细胞可被病毒上清液转染,转导HSV1-tk基因可显著增强ACV、GCV对TYK细胞的杀伤作用.结论:逆转录病毒可介导HSV1-tk基因转染TYK细胞并获稳定表达,ACV、GCV对携有HSV1-tk基因的卵巢癌细胞有明显的体外杀伤作用.     

腺病毒介导的HSV—tk体外抗喉癌作用

目的：观察HSV－tk/GCV系统对喉癌细胞的杀伤作用。方法：将带有报告基因LacZ的5型缺陷性腺病毒载体AdCMVLacZ感染喉癌细胞Hep-2,X-gal染色，测定腺病毒的转染率。利用同源重组技术构建含HSV－tk基因的重组腺病毒载体AcCMVtk。AdCMVtk感染Hep-2细胞后，加入10mg/LGCV,佼 活率及旁观者效应。结果：随着腺病毒感染复数量（multiplicity of infection,MOI)增加，对Hep-2细胞转染率亦增加，100％转染所需的MOI为200。AdCMVtk/GCV对Hep-2细胞的杀伤强度与AdCMVtk量呈正向关系，即有浓度依赖性。此杀伤作用存在旁观者效应，但较弱。结论：腺病毒介导的HSV－tk/GCV具有杀伤喉癌细胞作用。     

HSV1-tk自杀基因系统对小鼠黑色素瘤的杀伤和抑制效应

【目的】检测自杀基因系统单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV1-tk/GCV)对小鼠黑色素瘤的杀伤和抑制效应。【方法】将B16/tk(tk+)细胞和未经修饰的B16(tk-)细胞按tk+细胞占总细胞数的0%、10%、20%、40%、80%比例分别进行混合,各组细胞于96孔板中培养,加入丙氧鸟苷(GCV)至15.7μmol/L,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同tk+细胞比例的HSV1-tk/GCV系统在体外对肿瘤细胞的杀伤率。各组混合细胞分别接种于小鼠腋下,以GCV注射液按100 mg.kg-1.d-1进行治疗,检测瘤体体积、湿质量,测定抑瘤效应。【结果】tk+比例10%以上治疗组,HSV1-tk/GCV系统对黑色素瘤B16细胞均有明显杀伤效应,但旁杀伤作用不明显;从移植瘤体积看,20%以上tk/GCV治疗组肿瘤呈现明显生长抑制状态(P0.05),以80%tk/GCV治疗组作用最显著(P0.01);从移植瘤质量看,80%tk/GCV治疗组肿瘤呈现明显生长抑制状态(P0.01),其他组虽随着tk+细胞比例的增高瘤体平均质量下降,但差异无显著性意义。【结论】HSV1-tk/GCV系统对小鼠黑色素瘤的杀伤和抑制效应均随着B16/tk细胞比例的增高而增强,已建立显示出体外杀伤效应和体内抑瘤活性的小鼠黑色素瘤自杀基因系统。     

HSV-tk/GCV系统对高转移性粘液表皮样癌细胞系M3SP2的抑制作用

目的 :探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (HSV tk) /丙氧鸟苷 (GCV)自杀基因系统对高转移性粘液表皮样癌细胞系M3SP2的作用 .方法 :采用阳离子脂质体介导法将含HSV tk基因复制缺陷型逆转录病毒载体 (pBabe/tk)导入M3SP2细胞 ,嘌呤霉素筛选抗性克隆 .用MTT比色法测定HSV tk/GCV对tk阳性M3SP2细胞 (M 3SP2 /tk)生长的影响及旁观者效应 ;用流式细胞术分析HSV -tk/GCV对M3SP2 /tk细胞周期的影响 .结果 :M3SP2 /tk细胞对GCV的敏感性显著增加 ,细胞生长受到抑制 ,在GCV(0 .1～ 10 0 0mg·L-1)作用 6d时 ,M3SP2 /tk细胞存活率为 6 2 .3%- 14 .5 %,IC50 值为 0 .6 8mg·L-1,而转空载体细胞和亲本细胞IC50 值大于 10 0 0mg·L-1.M3SP2 /tk细胞在GCV(1～ 10mg·L-1)作用 4 8h时 ,明显阻滞于S期 .10 %tk阳性的M 3SP2 /tk细胞与 90 %tk阴性的亲本细胞M3SP2混合培养 ,10mg·L-1的GCV仍可杀伤 5 4 .4 %的细胞 .M3SP2 /tk细胞含GCV (1,10mg·L-1)培养上清液仍能影响tk阴性的舌癌细胞系TbpTL的生长 .结论 :HSV tk/GCV具有显著抑制涎腺粘液表皮样癌细胞体外生长的作用 ,其作用机制与细胞周期进程停滞和旁观者效应有关     

逆转录病毒载体介导HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建

【目的】 探讨自杀基因抗肿瘤系统构建的方法。【方法】 用DNA重组技术将单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1-tk)定向克隆入逆转录病毒载体pLXSN,并用限制性内切酶进行酶切及测序鉴定;用PolyFect Transfection试剂介导重组逆转录病毒转染入包装细胞系PT67,通过G418筛选建立稳定产病毒的细胞株,将病毒感染人胃癌细胞,检测HSV1-tk自杀基因治疗系统在体外的抗肿瘤效应。【结果】 经酶切鉴定和DNA序列测定,证明HSV1-tk基因成功定向插入到pLXSN载体中;重组病毒DNA转染包装细胞,筛选出对G418具稳定抗性的克隆PT67/tk,扩大培养,获取病毒滴度为4×10~4 cfu/mL的重组逆转录病毒培养液;感染胃癌细胞SGC-7901后再筛选出G418抗性克隆株SGC-7901/tk。丙氧鸟苷(GCV)对SGC-7901/tk有明显杀伤作用,对SGC-7901无明显毒性,证明该病毒表达HSV1-tk基因,表达产物具有生物活性。【结论】 将HSV1-tk定向克隆入逆转录病毒载体的方法可成功获取表达HSV1-tk(基因的逆转录病毒,成功建立了肿瘤自杀基因治疗系统,这将为进一步研究中医药对自杀基因抗肿瘤的增效作用奠定基础。     

hTERT启动子调控下HSV-tk/GCV系统对人卵巢癌细胞系Skov3的杀伤作用

目的 探讨hTERT启动子驱动下的HSV-tk／GCV系统对人卵巢癌细胞系Skov3的体外杀伤作用。方法 应用分子生物学方法构建hTERT启动子调控下的tk基因真核表达载体pBTdel-279-tk,并应用脂质体转染法将之转入Skov3、正常人卵巢上皮细胞(NOEC)和人胚肺成纤维细胞中,加入GCV,用MTT法和流式细胞术检测pBTdel-279-tk／GCV系统对各种细胞的杀伤作用;应用RT-PCR法检测pcDNA3-tk和pBTdel-279-tk转染前后卵巢癌细胞和正常细胞中tk基因的表达情况。结果 pBTdel-279-tk／GCV对端粒酶阳性的卵巢癌细胞有明显的杀伤作用,而对端粒酶阴性的正常细胞则无;hTERT启动子系统诱导卵巢癌细胞凋亡的效能与CMV启动子近似,两者差别无显著性意义。pcDNA3-tk转染后,在Skov3细胞和NOEC中均可探测到tk基因;而pBTdel-279-tk转染后只有Skov3可探测到tk基因,NOEC中则无。结论 hTERT启动子调控下的tk基因治疗是一种新的卵巢癌靶向治疗方法,具有更高的特异性和高效性。     

HSV-tk基因表达载体的构建及其对A549细胞的杀伤作用

目的构建自杀基因HSV-tk表达质粒,研究自杀基因疗法对人肺癌细胞的杀伤作用,探讨其治疗肺癌的可行性。方法PCR扩增tk基因带EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位点,然后构成建到pcDNA3.0载体中成pcDNA3.0-tk;将pcDNA3.0-tk转染A549肺癌细胞,应用细胞生长曲线和MTT法测定前药GCV对A549细胞的杀伤作用。结果成功获得pcDNA3.0-tk克隆,RT-PCR、Western印迹法证明A549细胞转染pcDNA3.0-tk后可表达自杀基因,GCV能特异性地杀伤A549/tk细胞。结论HSV-tk基因表达质粒构建成功;HSV-tK/GCV系统对肺癌A549细胞有一定的杀伤作用。     

靶向非病毒载体一次及持续介导Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因转导卵巢癌细胞的比较

目的比较靶向非病毒载体GE7系统介导Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(HSV1-tk)基因一次及持续转导卵巢癌细胞的转导效率及杀伤效应。方法靶向非病毒载体系统GE7分别与标志基因β-半乳糖苷酶(β-gal)基因和治疗基因HSV1-tk基因构成载体复合物,一次及持续体外转导卵巢癌细胞CaOV3,通过5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖吡喃糖甙(X-gaI)染色比较GE7系统一次及持续转导外源基因的转导效率。将丙氧鸟苷(GCV)加入一次及持续转导HSV1-tk基因的卵巢癌细胞,通过细胞生长抑制曲线、流式细胞分析等,观察GCV对一次及持续转导GE7/HSV1-tk的卵巢癌细胞的杀伤作用。结果X-gal染色显示,GE7-次转导外源基因的平均转导效率可达80%,持续转导达85%。当GCV为1μg/mL时,GE7/HSV1-tk一次转导的生长抑制率达82%,凋亡指数为15,而持续转导可达90%,凋亡指数为30。在相同的GCV浓度下,持续转导GE7/pCMV-tk卵巢癌细胞生长抑制率显著高于一次转导(P<0.05)。结论GE7载体系统持续转导卵巢癌细胞较一次转导的平均转导效率高,持续转导的GE7/HSV1-tk/GCV基因治疗系统杀伤作用更大。     

HRE增强hTERT启动子-tk/GCV基因系统对缺氧环境肿瘤细胞的杀伤作用

目的：探讨缺氧反应元件(HRE)增强hTERT启动子-tk/GCV逆转录病毒基因系统对缺氧环境肿瘤细胞的体外杀伤作用。 方法：构建由HRE缺氧反应元件修饰的hTERT杂合启动子和hTERT单一启动子引导单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因表达的重组逆转录病毒载体,在脂质体介导下分别转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆。将重组病毒感染人肺癌细胞SPC-A1和人肝癌细胞Bel-7402,G418筛选出抗性克隆肿瘤细胞。实验分为对照组、SPC-A1/tk组和Bel-7402/tk组。在缺氧处理条件下,MTT法检测前体药物丙氧鸟苷(GCV)对SPC-A1/tk和Bel-7402/tk细胞的杀伤效应,流式细胞仪检测其细胞凋亡率和细胞周期的变化。 结果:与对照组比较,缺氧环境培养的SPC-A1/tk和Bel-7402/tk细胞对GCV的敏感性明显增强,其中细胞凋亡率明显升高（P<0.001）,细胞周期各期细胞数有所减少（P<0.05）。与hTERT启动子引导的tk基因系统组细胞比较,［HRE］hTERT杂合启动子引导的tk基因系统组肿瘤细胞存活率更低（P<0.01）,诱导肿瘤细胞凋亡率明显升高（P<0.01）,G₁期和^G0期细胞数有所增高（P<0.05）,S期细胞数减少（P<0.05）。结论：HRE能增强hTERT启动子-tk/GCV自杀基因系统对缺氧环境中肿瘤细胞的体外杀伤作用。     

CD、TK双自杀基因对消化道肿瘤细胞的体外抑制作用

目的 用粘粒法构建含有胞嘧啶脱氨酶（CD）、单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－tk)双自杀基因的腺病毒载体，检测双自杀基因对不同消化道恶性肿瘤细胞的体外抑制作用。方法 利用重组腺病毒载体介导的CD、HSV－tk融合基因感染人结肠腺癌细胞系LoVo、胃癌细胞系SGC－7901、肝癌细胞系BEL－7402，通过MTT法测定细胞存活率，通过细胞集落形成实验分析GCV（丙氧鸟苷）、5－FC（5－氟胞嘧啶）双前药（double prodrugs)对肿瘤细胞的杀伤作用和旁观效应的大小。结果 Western blot检测分析融合基因的表达，显示重组腺病毒介导的双自杀基因可以在3种肿瘤细胞中高效表达。使用前药GCV和5－FC后，各组肿瘤细胞的集落形成和细胞存活率显低于对照组。感染细胞在混合细胞中比例较低时，就能获得明显的旁观效应。联合两种前药能获得最大的细胞抑制作用，并且CD／5－FC系统对于消化道肿瘤细胞的杀伤作用强于HSV－tk/GCV系统。结论 CD、TK融合基因联合双前药治疗对消化道肿瘤有显的体外抑制作用。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对肺腺癌细胞杀伤作用探讨

目的：探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因转染联合抗病毒药物更昔洛韦（GCV）对人肺腺癌细胞系的杀伤作用。方法：应用基因工程技术构建了携带单纯疮疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）基因的逆转录病毒重组体pLXSN-tk，通过脂质体法转染PA317细胞，G418筛选出产重组病毒颗粒的生产细胞PA317-tk细胞。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测HSV-tk/GCV系统对人肺腺部细胞系GLC-82的生长抑制率。结果：重组逆转录病毒载体能有效地将HSV-tk基因导入GLC-82细胞系内并使其获得对GCV的敏感性。结论：肺腺癌细胞转染HSV-tk基因后，能有效地被GCV杀死。     

逆转录病毒介导HyTK基因对肾癌细胞株GRC－1的杀伤作用

目的：了解逆转录病毒介导的HyTK基因转移联合更昔洛韦（GCV）对肾癌细胞的杀伤作用。方法：利用逆转录病毒介导将HyTK基因导入入肾癌细胞株GRC－1，经用潮霉素筛选，获得稳定表达HyTK基因的GRC－1／HyTK细胞；应用PCR、RNA、Dot blot分子杂交及MTT等方法检测，在DNA、RNA水平的表达以及HyTK联合GCV对GRC－1／HyTK细胞的杀伤作用。结果：PCR、Dot blot检测证明，HyTK基因的整合及mRNA水平的表达；MTT法测定示GCV对GRC－1／HyTK细胞有明显的杀伤作用。其IC50值为3．49μg/ml，而对其亲代GRC－1细胞无明显杀伤作用。结论：逆转录病毒介导的HyTK基因转移联合GCV可作为肾癌基因治疗的一种有效方法。     

HSV-tk/GCV自杀基因系统对骨肉瘤细胞体外杀伤效应

目的：观察：HSV—tk／GCV系统对骨肉瘤细胞SAOS-2的体外杀伤作用．方法：构建tk基因逆转录表达载体pL(tk)SN,在lipofectamine2000介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将重组病毒感染人骨肉瘤细胞SAOS-2,G418筛选出抗性克隆命名为SAOS／tk,以RT—PCR及Southern blot检测tk基因的整合及表达．观察tk基因修饰细胞生长状况及MTT法观察前药对tk基因修饰骨肉瘤细胞的杀伤效应．结果：RT—PCR及Southern blot分析证明tk基因在人骨肉瘤细胞系SAOS-2中有整合及表达;SAOS／tk与未转基因的原肿瘤细胞相比,两者生长速度及形态结构无明显差别;在前药敏感性试验中,GCV对SAOS／tk细胞的杀伤作用十分明显,半数致死量约为1mg／L,而亲本细胞SAOS-2和空白质粒转染SAOS／0细胞,半数致死量大于100mg／L．tk基因修饰细胞与不同比例亲本细胞混合后经GCV治疗,SAOS／tk占混合细胞总数的20％时即可杀伤约50％的混合培养细胞.结论：人骨肉瘤细胞系SAOS-2对HSV—tk／GCV系统高度敏感,并且有明显的旁观者效应,可望成为骨肉瘤基因治疗的新途径．     

腺病毒介导的HSV—tk／GCV自杀基因系统靶向性治疗前列腺癌的实验研究

目的：观察腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,丙氧鸟苷（HSV—tk／GCV）自杀基因系统在人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控下对人前列腺癌细胞的靶向性体外杀伤效应。方法：利用不同感染复数（MOI）的重组腺病毒携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因感染前列腺癌细胞LNCaP和人成纤维细胞MRC-5,荧光显微镜下观察其感染效率：利用携带不同启动子的重组腺病毒Ad—hTERT-HSV／TK以及Ad—CMV—HSV／TK感染LNCaP和MRC-5细胞,加入不同浓度GCV,MTY法观察受转染细胞的存活率。结果：重组腺病毒Ad—hTERT—EGFP能特异地转染LNCaP,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高（P〈0．01）,MOI为1时转染率为8．3％,MOI为1000时转染率达100％;应用GCV处理后,Ad—CMV—HSV／TK对LNCaP和MRC-5细胞均有杀伤作用,而Ad—hTERTp—HSV／TK只杀伤LNCaP（P〈0．001）,随着MOI和GCV浓度的增加,LNCaP细胞存活率明显降低（P〈0．01）,MOI为1和GCV浓度为1μmol/L时存活率为95．4％。MOI为100和GCV浓度为1000μmol／L时存活率仅为6．1％,并有旁观者效应。结论：重组腺病毒携带EGFP报告基因可准确、简便地确定转染效率;hTERT启动子调控的重组腺病毒介导的HSV—tk／GCV自杀基因系统对人前列腺癌细胞有靶向杀伤作用。     

HSV-TK/GCV系统联合多柔比星对SK-OV-3的杀伤作用

目的 :探讨HSV TK/GCV(单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶 /丙氧鸟苷 (substrateⅠofherpessimplexvirusthymidinekinase/ ganciclovir)系统及其与普通化疗联合用于治疗卵巢癌的可行性 ,研究分子化疗药物GCV与普通化疗药多柔比星 (阿霉素 )联合应用对卵巢癌SK OV 3/TK细胞的杀伤作用。这对于缺乏有效的早期诊断和治疗手段的卵巢癌具有特殊的意义。方法 :将携带HSV TK基因的逆转录病毒重组体 (XM 6 /TK)以磷酸钙共沉淀法导入包装细胞 ,经G4 18筛选获得产病毒的阳性克隆细胞。继而以包装好的复制缺陷型逆转录病毒为运载体将HSV TK基因导入SK OV 3卵巢癌细胞。再经G4 18筛选 ,确定目的基因在靶细胞内稳定表达后 ,观察GCV对细胞的杀伤作用。进一步观察GCV与多柔比星联合应用对SK OV 3/TK细胞的杀伤作用。结果 :HSV TK基因可由重组逆转录病毒导入卵巢癌细胞并能获得稳定表达 ;GCV(10mg·L-1)可明显抑制被转化的卵巢癌细胞 (SK OV 3/TK)的生长 ,对于SK OV 3/TK细胞 ,在单独应用GCV时 ,其最低有效 (质量 )浓度为 10mg·L-1;单独应用多柔比星时 ,其最低有效 (质量 )浓度为 1mg·L-1;而联合应用时 ,GCV 5mg·L-1、多柔比星 0 .2 5mg·L-1对SK OV 3/TK细胞即可产生明显的杀伤作用。结论 :逆转录病毒介导的HSV TK/GCV系统可     

转铁蛋白受体介导的肝癌靶向性HSV-tk/GCV系统的构建及体外效应研究

目的：构建肝癌靶向性HSV—tk／GCV基因转移系统，并研究其在体外对肝癌细胞的杀伤效应。方法：体外培养通过基因重组技术构建和表达抗转铁蛋白受体(TfR)人—鼠嵌合抗体的转染瘤细胞D2C5．6，诱导裸鼠(Balb／c，nu／nu)产生腹水并纯化；以蛋白质连接因子—水溶性碳二亚胺(EDC)介导TfR的抗体与多聚左旋赖氨酸的连接(Ab—PLL)，与pEBAF／tk按比例混匀，得到Ab—PLL—pETAF／tk基因转移系统；分别转染不同的细胞株进行体外效应研究：人肝癌细胞株HepG2、SMMC7721，人肺癌细胞株549，观察给予不同浓度的更昔洛韦(GCV)随时间延长的细胞改变情况，用MTT法检测GCV对不同细胞的杀伤作用。结果：分析型酸性尿素凝胶电泳证实抗TfR的抗体与PLL成功连接；体外杀伤实验显示：经Ab—PLL—pETAF／tk基因转移系统处理的3种细胞对GCV表现出不同的敏感性。HepG2细胞(CD71 ，AFP )对GCV很敏感，低浓度的GCV(1mg／L)处理3d，即可使细胞生长抑制率达到74．8％，SMMC7721细胞(CD71 ，AFP )对GCV低度敏感，A549(CD71-，AFP-)对GCV不敏感。结论：TfR介导的肝癌靶向性HSV—tk／GCV基因转移系统构建成功；有可能用以肝癌细胞为靶细胞的基因治疗的研究。     

HSV-tk/GCV自杀基因系统治疗小鼠喉癌的实验研究

目的 :研究逆转录病毒介导的 HSV- tk/GCV系统对荷人喉癌小鼠的抑瘤作用及体内旁观者效应。方法 :将含 HSV- tk基因的重组逆转录病毒感染人喉癌细胞 Hep- 2 ,G41 8筛选出抗性克隆 ,命名为 Hep- 2 /tk。将 Hep- 2 /tk细胞单独或 Hep- 2 /tk细胞与未经基因修饰的 Hep- 2细胞等比例混合接种小鼠皮下 ,联合应用 GCV,观察其抑瘤作用及体内旁观者效应。结果 :GCV治疗后 ,Hep- 2 /tk细胞或 Hep- 2 /tk细胞与 Hep- 2细胞等比例混合所致荷瘤鼠与对照组相比 ,肿瘤的生长明显受到抑制 ( P<0 .0 1 )。结论 :逆转录病毒介导的HSV- tk/GCV系统对荷人喉癌小鼠具有明显的抑瘤作用及体内旁观者效应。该系统有望成为喉癌的有效治疗途径。