重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-EGFP的构建与鉴定

目的人血管内皮生长因子（的hVEGF165）为靶基因,增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因构建体的复制缺陷型腺病毒载体,为基因治疗牙周进一步再生奠定了基础。方法质粒的pDC316-的VEGF165为模板,PCR扩增基因片段进行消化,获得的hVEGF165用于连接到含有绿色荧光蛋白标记基因重组质粒的消化方法的pDC316-MCMV-EGFP质粒载体,PCR鉴定和双酶切证实成功构建重组质粒;使用ADMAX包装系统,改造的质粒共转染用质粒骨架293包装细胞系和重组病毒的扩增;扩增病毒的离子交换纯化;TCID50测定病毒粒子和效价的数目;的荧光的荧光显微镜重组腺病毒表达。结果 PCR鉴定,酶切分析和测序证实成功构建人VEGF基因的携带绿色荧光蛋白标记（的hVEGF165）重组质粒的pDC316-的hVEGF165-MCMV-EGFP和同源重组腺病毒Ad5的-的hVEGF165-EGFP的成功。扩增和纯化后,腺病毒颗粒的数量测量5.4×1011VP/mL,约2.0,为1.8×1010CCID50/mL的滴度OD260/OD280值。结论成功构建携带hVEGF165基因重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-EGFP并获得高滴度病毒颗粒,为hVEGF165基因功能研究以及细胞移植、基因治疗提供有效的工具。     

人Toll样受体2胞外区基因重组腺病毒的制备及鉴定

目的 构建含有人Toll样受体2(TLR2)胞外区基因的重组腺病毒载体并进行鉴定.方法 应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞(PBMC)中扩增TLR2胞外区全长基因,克隆人pMD18-T载体并经测序验证后,通过KpnⅠ和HindⅢ双酶切将目的 片段定向克隆至经相同处理的pAdTrack-CMV腺病毒穿梭质粒中.将构建止确的重组质粒pAdTrack-CMV-TLR2用Pme Ⅰ酶切线性化后转化感受态AdEasier-1细菌,在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒.将鉴定正确的重组质粒pAd-TLR2经PacⅠ酶切线性化后,以脂质体法转染至293细胞中进行包装并扩增病毒.观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达并测定病毒滴度,用PCR法鉴定重组腺病毒.结果 RT-PCR扩增得到的目的 基因片段与GenBank中的序列一致,经酶切鉴定及PCR检测证实携带人TLR2胞外区全长基因的重组腺病毒制备成功,获得高滴度(3×109pfu/ml)的重组腺病毒.结论 成功制备了表达人TLR2胞外区基因的重组腺病毒,为后续研究奠定了基础.     

人Survivin基因重组腺病毒载体的构建及其表达

目的　构建含有人Survivin基因的重组腺病毒载体,为转染树突状细胞(DC)构建DC疫苗和基因治疗奠定基础。方法　自行设计一对分别含有KpnⅠ和XholⅠ酶切位点的Survivin基因上下游引物,以质粒pCITE/Survivin为模板,通过PCR扩增获得Survivin基因全序列。片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack CMV,获得重组质粒pAdTrack CMV Survivin。通过KpnⅠ和XholⅠ双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体pAdTrack Survivin转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy 1 的BJ5183菌。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。同时将病毒上清转染成纤维细胞,通过观察GFP的表达以及Western blot分析观察Survivin蛋白表达。结果　成功构建了含有人Survivin基因的重组腺病毒,病毒滴度为1 65×108pfu/L。Western blot检测可见16 5kD的Survivin蛋白表达。结论　该重组腺病毒载体的构建及成功转染到成纤维细胞内表达为下一步以人Survivin作为靶抗原的基因治疗奠定了基础。     

同源异形盒Gax基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的:构建同源异形盒Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,并对其是否重组成功进行鉴定。方法:采用两步CaC l2转化法的DNA细菌内同源重组技术,PCR扩增小鼠Gax基因,将Gax基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,转染含有5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1(33.5 kb)的B J5183细菌,经细菌内同源重组产生携带Gax基因的重组腺病毒载体pAd-Gax,经限制性内切酶BstⅨ和PacⅠ鉴定正确后,用脂质体法转染293细胞,包装产生携带Gax基因的重组腺病毒Ad-Gax。利用GFP的表达鉴定Ad-Gax。结果:构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1010pfu/L。结论:成功地构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。     

携载人基质金属蛋白酶组织抑制剂-2基因重组腺病毒载体的构建

目的　构建携载人基质金属蛋白酶组织抑制剂 2 (hTIMP 2 )基因的重组腺病毒载体 ,为基因治疗提供实验基础。方法　利用基因重组技术将腺病毒骨架质粒 pAdEasy 1以及线性化的重组穿梭质粒 pTrack CMV hTIMP 2共转化BJ5 183受体菌并在其中发生同源重组 ,利用重组前后抗性的改变筛选出重组子 ,重组腺病毒质粒AdhTIMP 2经过 2 93细胞的包装 ,扩增和纯化后 ,测定病毒滴度。一步法提取细胞总RNA ,RT PCR检测hTIMP 2的mRNA。收集细胞上清 ,进行Western杂交检测TIMP 2蛋白。结果　得到了携带hTIMP 2基因的重组腺病毒 ,纯化后滴度为 4× 10 11pfu/ml,应用RT PCR和Westernblot方法 ,在转染 2 93细胞后 2 4h即可检测到hTIMP 2的表达。结论　成功地构建了携带hTIMP 2的重组腺病毒载体 ,为下一步的基因治疗提供了基础。     

红色荧光-VEGF165融合蛋白载体在细胞内的定位和表达

目的 构建在哺乳动物细胞中表达人VEGF165(hVEGF165)红色荧光蛋白(RFP)的融合表达载体。方法 根据已知的人VEGF165序列,用PCR方法,从质粒pUC18／VEGF165中扩增出去除终止密码子的VEGF165片段,定向克隆至pDsRed1-N1质粒中。重组质粒经限制性内切酶和DNA序列测定鉴定。以DOTAP为介导,将pDsVEGF165Red1-N1转染293-T细胞,48小时后用RT-PCR、激光共聚焦显微镜检测VEGF165在细胞内表达和分布情况。结果 重组的融合蛋白表达载体经酶切、PCR和DNA序列测定证明构建正确,并在293-T细胞中表达。报告基因-红色荧光蛋白在细胞质、细胞核中都有一定的分布。结论 成功构建了pDsVEGF165Red1-N1红色荧光蛋白融合表达载体,该载体能在哺乳动物细胞中表达,为研究VEGF的细胞内定位提供了一个重要而方便的工具。     

重组腺病毒Ad-huVEGF121的制备

目的：构建能够用于骨缺血研究的能表达huVEGF121的重组腺病毒载体。方法：将huVEGF121克隆至穿梭质粒，线性化后转染含骨架质粒的BJ5183菌，构建重组腺病毒质粒。酶切及PCR法鉴定；将其线性化后转染293细胞，通过观察绿色荧光监测病毒产生，免疫组化检测VEGF121表达。结果：成功的将hu—VEGF121克隆至穿梭质粒pTrack—CMV，正确构建了重组腺病毒质粒，感染293细胞得到大量病毒。结论：成功构建了huVEGF121重组腺病毒，为缺血性骨病的进一步研究奠定了基础。     

人骨形态发生蛋白12基因重组腺病毒载体的构建

目的:构建及制备人骨形态发生蛋白12(BMP12)基因重组腺病毒,证明其可感染脂肪组织来源干细胞并表达蛋白。方法:将包含有BMP12cDNA全长序列的BMP12-pED6质粒用限制性内切酶EcoRI进行酶切,得到一个1260bp大小的含有BMP12cDNA的目的基因片段。将目的基因片段插入质粒pcDNA3.1后,用KpnI和PmeI进行双酶切,插入pAdtrack-CMV。插入目的基因片段的穿梭质粒pAdtrack-CMV-BMP12用PmeI进行酶切线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1一起电转化入感受态BJ5183菌株。用PCR及多种酶切方法鉴定重组体。最终将线性化的重组质粒利用脂质体转入293A细胞中进行病毒包装。BMP12基因随着重组腺病毒在感染的293A细胞中扩增而得到复制,并通过CsCl梯度离心法得以纯化。Elisa法检测Ad-BMP12感染脂肪组织来源干细胞后BMP12的蛋白表达。结果:pAdtrack-CMV-BMP12经酶切证实有1260bp的插入片段。酶切及PCR鉴定证实BMP12基因重组腺病毒载体构建成功。GFP(green fluorescent protein)表明重组腺病毒扩增成功并制备出高滴度重组病毒。该重组病毒可成功感染脂肪来源组织干细胞并表达BMP12蛋白。结论:BMP12基因能够重组于腺病毒载体,可以进行有效扩增,产生高浓度的重组腺病毒,从而用于BMP12基因治疗的研究。     

含人血红素氧化酶-1重组11P型腺病毒的构建及体外表达

目的构建含人血红素氧化酶-1重组11P型腺病毒,并使之转染人BJ细胞,测定其转染效率及目的蛋白表达情况。方法PCR目的基因序列,克隆成穿梭载体后转化大肠杆菌,扩增提取质粒,鉴定正确后与骨架载体重组,鉴定重组质粒正确并无野毒后在293细胞中扩增,CsCl密度梯度离心法纯化腺病毒。按不同梯度MOI值感染成纤维细胞,根据绿色荧光强度检测其转染效率。1周后用免疫组化方法检测目的蛋白HO-1表达情况。结果对重组腺病毒进行酶切和PCR鉴定,证实含人血红素氧化酶-1(HO-1)的11P型重组腺病毒构建成功,纯化后病毒滴度达到1.0×1010pfu/ml。通过免疫组化检测可在成纤维细胞中观察到胞浆内有棕褐色目的蛋白阳性颗粒表达。结论可以成功构建含人血红素氧化酶-1(HO-1)的11P型重组腺病毒并表达目的蛋白。     

红色荧光-VEGF_(165)融合蛋白载体在细胞内的定位和表达

目的　构建在哺乳动物细胞中表达人VEGF1 65(hVEGF1 65)红色荧光蛋白 (RFP)的融合表达载体。方法　根据已知的人VEGF1 65序列 ,用PCR方法 ,从质粒pUC1 8/VEGF1 65中扩增出去除终止密码子的VEGF1 65片段 ,定向克隆至pDsRed1 N1质粒中。重组质粒经限制性内切酶和DNA序列测定鉴定。以DOTAP为介导 ,将pDsVEGF1 65Red1 N1转染 2 93 T细胞 ,4 8小时后用RT PCR、激光共聚焦显微镜检测VEGF1 65在细胞内表达和分布情况。结果　重组的融合蛋白表达载体经酶切、PCR和DNA序列测定证明构建正确 ,并在2 93 T细胞中表达。报告基因 -红色荧光蛋白在细胞质、细胞核中都有一定的分布。结论　成功构建了pDsVEGF1 65Red1 N1红色荧光蛋白融合表达载体 ,该载体能在哺乳动物细胞中表达 ,为研究VEGF的细胞内定位提供了一个重要而方便的工具     

Optimization of the system of medical service of students of Cadet Schools of the Ministry of Defense of the Russian Federation

One of the factors of the successful military career guidance Cadet schools students is preserving and promoting their health. Medical support of children and adolescents aged 10-17 years should include the full range of medical and preventive measures defined for this group. The state of providing outpatient care for pupils at the Cadet School in St. Petersburg was studied. These results show that full medical care in accordance with the standards can be based only on children's health clinics. It is important that the organization of medical support pupils cadet schools should be cooperate with civilian health care.     

带状疱疹83例误诊原因分析

带状疱疹是由水痘—带状疱疾病毒引起的皮肤科常见疾病。其主要的病理损害,一是受累神经的严重炎症性浸润,继而导致受侵犯神经节内神经细胞变性、坏死;二是皮肤的水泡。迅速抑制神经节和相应的感觉神经纤维的充血、水肿和坏死,防止粘连形成,达到迅速镇痛、改善皮损,缩短病程及防止后遗症的发生是治疗的关键。因而,尽早明确诊断,     

Estimation of accumulated dose of radiation by method of ESR-spectrometry of dental enamel of mammals

ESR-spectrometry was used to investigate radiation-induced paramagnetic centers in enamel of mammals: carnivores (polar bear and fox), ungulates (reindeer, European bison, moose), and man. Values at half the microwave power saturation of the radiation signal, P_1/2, evaluated at room temperature, was found to range from 16 to 26 mW for animals and man. A new approach to discrimination of the radiation induced signal from the total ESR spectrum of reindeer enamel is proposed. ‘Dose-response’ dependencies of enamel of different species mammals were measured within the dose range from 0.48 up to 10.08 Gy. Estimations of ‘radiosensitivity’ enamel of carnivores and ungulates showed good agreement with radiosensitivity enamel of man by ESR method.     

Analysis of the results of the international comparison of activity measurements of a solution of Fe

The results of an international comparison of activity measurements of a solution of ⁵⁵Fe organized by the BIPM in 2005 are reported and analysed. This exercise, which follows the procedures of the CIPM mutual recognition arrangement to update older comparisons, is a renewal of the comparison organized by the BIPM that took place in 1978. A EUROMET comparison was organized in 1996 specifically to compare activity measurements of a ⁵⁵Fe solution by means of liquid-scintillation techniques. Results of these three comparisons are presented and discussed in this paper.

The radionuclide solution was provided by the NPL, which also distributed the samples to the participants. The activity of the ampoules was measured by 16 laboratories using 12 methods producing 25 results. Some general considerations on uncertainty assessments pertaining to the different techniques used are drawn. The outcome of four different estimators is compared from which the presence of at least one outlier can be confirmed. Further measurements should be made to try to reduce the discrepancy between the results. To date the outcome of the present comparison does not show an improvement to that of the 1996 comparison.     

Evaluation of the results of various technics of non-surgical therapy of varicocele

A new method of non-surgical treatment of varicocele syndrome is described: it consists in sclerotherapy of spermatic vein by trans-femoral percutaneous catheterization with balloon-catheters. In 8 cases venous thrombosis has been induced by direct electric clotting. The techniques and a 6 months follow-up are discussed. It is pointed out that this procedure should be considered as the method of choice for tubular lesions and sub-fertility prophylaxis in young people and in childhood.     

延迟性脾破裂误漏诊原因分析

目的探讨延迟性脾破裂误漏诊原因和预防措施.方法回顾性分析总结12例延迟性脾破裂中的诊断和误漏诊的经验与教训.结果本组延迟性脾破裂的误漏诊5例(41.66%).对多发伤与脾破裂并存可能认识不足,外伤史轻微或伤员隐瞒外伤史,缺乏腹痛-缓解-突然再腹痛的典型病史,缺乏“对冲性脾破裂”力学分析和整体化诊断思路等为其误漏诊的主要原因.结论详细的外伤史和全面系统检查,重视腹以外多发伤掩盖腹内脏器伤及延迟性脾破裂可能.确立外伤-腹内脏器伤-脾破裂整体化诊断思路.不间断地辅以B超检查脾形态学变化和腹内有无积液,腹腔穿刺确定有无血腹、X线胸腹部检查观察左侧胸肋角和膈肌运动情况、必要时CT检查以尽早发现脾包膜下血肿,降低延迟性脾破裂误漏诊率.