间日疟原虫红内期SSUrRNA基因片段的扩增、测序及诊断应用

目的：体外扩增间日疟原虫（深圳株）红内期小亚单位核糖体核糖核酸编码基因（SSUrDNA）片段，克隆测序分析，并探讨其诊断应用。方法：设计1对特异性引物，采用聚合酶链反应（PCR）从间日疟患血样中扩增出间日疟原虫SSUrDNA片段；用PUC19质粒T载体构建重组子导入大肠杆菌JM109；阳性克隆双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列；以SSUrDNA为靶基因，PCR诊断间日疟，双盲法检测40份血样（28份镜检阳性的血样，12份健康血）。结果：间日疟原虫SSUrDNA扩增片段大小约为341bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；序列测定插入片段为341bp，与SalI株顺序相比，仅在第151位处缺失1个碱基C；以SSUrDNA为靶基因，双盲法检测镜检阳性及健康人血样，结果完全正确。结论：所克隆的间日疟原虫SSUrDNA片段序列在间日疟原虫虫株间高度保守，以其为靶基因建立的PCR检测方法适用于间日疟的诊断。     

恶性疟原虫红内期SSUrRNA编码基因的克隆与序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株红内期小亚单位核糖体核糖核酸SSUrRNA编码基因(SSUrDNA)片段，并进行序列分析。方法根据献报道恶性疟原虫基因序列设计1对特异性引物，采用聚合酶链反应(PCR)方法从海南恶性疟患血样核酸提取物中扩增出恶性疟原虫SSUrDNA目的基因片段，纯化后与PUC19m-T质粒载体连接构建重组子，并导入大肠杆茵JM109；阳性克隆经双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列，并采用ExPASy Proteomicstools软件分析。结果 恶性疟原虫SSUrDNA扩增片段大小约为431bp；阳性克隆重组质粒作双酶切及PCR扩增均得到预期大小的基因片段；测定的SSUrDNA插入片段核酸序列与巴西恶性疟原虫IMTM／7G8相同基因序列对比。未发现碱基的插入或缺失去，同源性为99．3％；第353位碱基由C取代了G，第371位碱基由T取代了C，其余序列相同。结论 成功克隆了恶性疟原虫海南株红内期SSUrDNA基因片段，该序列在不同恶性疟原虫虫株间相对保守。     

间日疟原虫深圳株红内期SSUrDNA基因片段的克隆与序列分析

目的 体外扩增间日疟原虫深圳株红内期小亚单位核糖体核糖核酸编码基因(SSUrDNA)片段，研究其结构与功能。方法 设计一对特异性引物，采用聚合酶链反应(PCR)从间日疟原虫患者血样中扩增出间日疟原虫SSUrDNA片段，以PUC19质粒T载体构建重组子导入大肠杆菌JM109；阳性克隆双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列。结果 间日疟原虫SSUrDNA扩增片段大小为341bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；序列测定插入片段为341bp，与Sal I株顺序相比，仅在第151位处缺失一个碱基C。结论 成功克隆了间日疟原虫SSUrDNA片段．该序列在间日疟原虫虫株间高度保守。     

间日疟原虫海南株SSUrRNA编码基因的克隆及其序列分析

目的克隆间日疟原虫海南株红内期小亚基核糖体核糖核酸（SSUrRNA）编码基因片段,并进行序列特征分析。方法采用聚合酶链反应技术从海南间日疟患者血样DNA中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段,纯化后与pGEM-Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆以双酶切和PCR鉴定后,进行序列测定,采用BLAST软件分析其特征。结果 PCR扩增出间日疟原虫红内期SSUrRNA基因特异性片段大小约为998 bp;阳性克隆重组质粒经双酶切及PCR鉴定与预期结果一致;核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段,含有998个核苷酸,与GenBank中的间日疟原虫Sal 1株、Pv2008/TR/DEL株及El Salvador株相同序列进行比对,其同源性均大于99%。结论成功克隆间日疟原虫海南株红内期SSUrRNA编码基因序列,该序列在不同地理株间相对稳定保守。     

不同地理株间日疟原虫SSUrRNA基因序列比较

目的测定我国间日疟原虫不同地理株红内期SSUrRNA基因序列,比较分析其分子特征。方法收集深圳、海南、湖北和河南四地间日疟患者血样5份（其中海南2份）,并提取核酸DNA,采用PCR从核酸提取物中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段,纯化后分别与pGEM—Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆以双酶切鉴定后,双脱氧末端终止法测定序列,采用BLAsT和MEGA4软件分析序列相互关系特征。结果5株间日疟原虫SSUrRNA基因扩增片段大小一致,约为998bp;核酸序列测定结果显示,所克隆的SSUrRNA基因片段均含有998个核苷酸,不同地理株间SSUrRNA基因序列有9个位点存在变异的可能,两两比对的同源性均高于99．5％,其中河南与湖北株序列的同源性为100．0％;与GenBank中报道的国外6株间日疟原虫相同序列作分子系统进化分析。国内5株间日疟原虫SSUrRNA基因序列与Sa11株遗传距离小,亲缘关系接近。结论测定的国内间日疟原虫SSUrRNA基因序列在不同地理株间相对保守．其间存在的单核苷酸多态性与地理变化有一定程度的关系。     

疟原虫核酸检测技术建立及在献血员筛查应用的研究

目的建立血液中疟原虫检测的核酸技术，探讨应用于献血员筛查的效果。方法根据红细胞内期疟原虫ssurRNA编码基因序列，设计合成三条扩增引物。将5份待检血样混合，采用蛋白酶K消化裂解法制备模板，在同一反应体系中扩增恶性疟原虫和间日疟原虫DNA，诊断鉴别恶性疟和间日疟。与厚血膜镜检法比较评价其灵敏度及特异性。结果将3份恶性疟原虫及10份间日疟原虫感染者的血样随机混入5000份无偿献血者血样中，每5份为一个检测单元，采用PCR方法从感染血样中扩增出分别为436bp和341bp的恶性疟原虫及间日疟原虫特异性的DNA片段，并经序列测定证实扩增片段的正确性；10份间日疟患者血样以及3份恶性疟患者血样均被检出，献血者血样PCR检测结果均为阴性，结果与厚血膜方法完全一致。结论所建立的疟原虫核酸检测技术灵敏度高、特异性好，且可以批量处理，提高了检测的效率，能有效降低疟原虫的输血传播，具有很好的推广使用价值。     

逆转录聚合酶链反应检测恶性疟原虫的应用研究

目的 建立逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测恶性疟原虫的新方法,并用于检测现场采集血样。方法 以恶性疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计一对特异引物,采用RT—PCR技术,恶性疟原虫预期被扩增出359bp特定扩增带。结果 从培养的恶性疟血样和现场采集的恶性疟血样中扩增出359bp特定扩增带,而间日疟和健康人血样均未见扩增带。经限制性内切酶分析证实扩增产物为目的片段。本检测系统初步显示可检出0．34个疟原虫／出血样,37份现场采集经镜检确诊的恶性疟血样中,36份RT—PCR检测为阳性,1份RT—PCR检测为阴性,阳性符合率为97．35％。结论 RT—PCR检测恶性疟原虫方法具有敏感性高、特异性强的特点,对疟疾诊断、镜检质量控制和流行病学研究具有较大的实用价值。     

应用双重PCR检测海南疟区发热病人的效果

目的 评价双重PCR检测疟区发热病人的效果。方法 对疟区求诊发热病人，手指取血分别制作厚薄血膜片和滤纸血斑作为检测血样。参照献用恶性疟原虫PF1－2和间日疟原虫PV3－5为特异性引物，同在一个反应体系常规进行PCR，扩增片段分别为206bp和431bp。同时镜检厚血膜作对照。结果 该反应体系最低可检出原虫血症为1个恶性疟原虫／μl血和10个间日疟原虫／μl血的感染；检测132例疟区发热病人血样的阳性率为65．1％，而镜检法为64．4％，且有1例漏诊和3例误诊，两法符合率为97％。结论 双重PCR用于疟区发热病人检测，较镜检敏感、特异，适合我国恶性疟与间日疟混合流行区的疟疾诊断，还可用于血检质量的监控。     

应用套式PCR技术检测我国西南部分疟区疟原虫的感染状况

目的 建立鉴别人体四种疟原虫的套式PCR技术，检测我国西南部分疟区疟原虫的感染情况。方法 选用两组疟原虫引物，扩增SSUrDNA特定片段，经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色，紫外检测凝胶分析仪观察并摄像。结果 采用上述方法扩增出间日疟、恶性疟和三日疟分别为104bp、102bp和115bp特异片段。所检测的138份疟疾患者血样中，四川名山县95份均为间日疟单纯感染，筠连县37份中10份为与间日疟和/或恶性疟呈混合感染的三日疟，云南金平县的6份均为合并恶性疟的两种或两种以上疟原虫混合感染。结论 所建立的套式PCR检测系统具有敏感性高、特异性好和稳定可靠等优点，在疟疾诊断、虫种鉴别、混合感染的判定、大规模流行病学研究和疫情监控预测等方面具有实际应用价值。     

云南省1例输入性三日疟实验室检测分析

目的对云南省1例输入性疟疾患者的血样进行实验室检测分析。方法采用疟原虫属特异性引物和种特异性引物对该样本进行巢式PCR检测,将PCR扩增结果进行序列测定,并对获得的序列进行Blast比对,分析其分子性状。结果使用疟原虫属特异性引物r PLU5和r PLU6对血样进行PCR检测,第一轮未扩增出预期条带;使用疟原虫种特异性引物对血样进行PCR检测,扩增出预期大小约141bp的三日疟条带,无对应大小的恶性疟、间日疟和卵形疟扩增条带产生。序列分析表明,扩增片段长度为115bp,进行Blast比对发现,与Genbank中注册编号为gb|KJ934253.1的三日疟对应部分的基因序列同源性为96%。结论通过使用巢式PCR、序列测定分析等方法,基本证实该病例为三日疟原虫感染。     

恶性疟原虫核糖体小亚基rRNA部分基因片段的克隆及序列分析

目的了解我国恶性疟原虫云南地理株核糖体小亚基rDNA的核苷酸序列。方法根据已知恶性疟原虫核糖体小亚基rDNA序列．在其基因的中下游分别设计引物,采用聚合酶链式反应（PCR）技术,从云南省来源的恶性疟体外培养原虫的基因组DNA中扩增出的基因片段酶切后将其插入pUC118／119载体,用Biosystems373ADNA序列分析仪测定。结果我国恶性疟原虫云南地理株核糖体小亚基rDNA核苷酸序列,与巴西IMTM22／7G8株的序列比较,在该基困的第1563位有一个A被T替换。结论该突变点位于真核生物核糖作小亚基rRNA基因已知序列种类的第三个可变区域内。     

聚合酶链反应检测疟疾的研究

目的 建立能鉴别诊断恶性疟原虫间和日疟原虫的PCR检测方法。方法 根据红内期疟原虫SSUr-RNA基因序列,设计合成两对引物,采用PCR技术,检测89份门诊“四热”病人血样,并与镜检法进行比较研究。结果 恶性疟原虫血样能扩增出205bp的特异带,间日疟原虫血样能扩增出120bp的特异带,PCR检测的阳性率为74.16%,镜检法为68.54%,PCR法与镜检法的符合率为94.38%。结论 PCR检测的敏感性和特异性均优于镜检法,对于诊断恶性疟原虫和间日疟原虫以及恶性疟原虫的间日疟原虫的混合感染具有一定的应用价值。     

应用套式PCR技术检测我国西南部分疟区疟原虫的感染状况

目的　建立鉴别人体四种疟原虫的套式 PCR技术 ,检测我国西南部分疟区疟原虫的感染情况。方法　选用两组疟原虫引物 ,扩增 SSU r DNA特定片段 ,经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色 ,紫外检测凝胶分析仪观察并摄像。结果　采用上述方法扩增出间日疟、恶性疟和三日疟分别为 10 4bp、10 2 bp和 115 bp特异片段。所检测的 138份疟疾患者血样中 ,四川名山县 95份均为间日疟单纯感染 ,筠连县 37份中 10份为与间日疟和 /或恶性疟呈混合感染的三日疟 ,云南金平县的 6份均为合并恶性疟的两种或两种以上疟原虫混合感染。结论　所建立的套式PCR检测系统具有敏感性高、特异性好和稳定可靠等优点 ,在疟疾诊断、虫种鉴别、混合感染的判定、大规模流行病学研究和疫情监控预测等方面具有实际应用价值。     

干血滤纸片试剂盒和水煮法提取间日疟原虫DNA用于PCR检测的比较

目的：比较水煮法和干血滤纸片基因组DNA分离试剂盒提取间日疟原虫DNA用于PCR检测及克隆研究的差异。方法：采集间日疟患者末梢血制备干血滤纸片,分别用水煮法和QIAamp DNAmini kit试剂盒提取间日疟原虫基因组DNA10份。PCR扩增LDH基因,并克隆质粒pGEM-PvLDH。分析比较2种提取方法的差异。结果：水煮法和试剂盒法提取的间日疟原虫gDNA,均扩增出LDH基因特异条带,但试剂盒提取的gDNA目的条带亮于水煮法。结论：水煮法操作简便、快速、经济,在等量血源条件下,所得DNA量较少、纯度较低;试剂盒提取可获得较高的得率,在定量检测和复合扩增时受到的影响因素较少,成功率较高。     

疟疾双重PCR检测方法的建立和初步应用研究

目的 建立一种适合于我国恶性疟、间日疟和两混合感染地区,一次性检测人体内或蚊体内的恶性疟原虫(P.f.)和间日疟原虫(P.v,)的双重聚合酶链反应(PCR)法。方法 根据疟原虫红内期SSUrRNA基因特定片段,设计合成3条寡核苷酸特异引物,在一个反应体系中,同时检测P.f．与P．v.的双重PCR技术,操作方法按PCR常规。结果 从P.f.和P．v．感染血样中,分别扩增出274bp和412bp的特异片段,检出水平达1-5个虫／μl血,而人基因组DNA、约氏疟原虫、伯氏疟原虫均未见扩增条带;但食蟹猴疟原虫(P．c,)与P.v．相似,在412bp可见扩增条带。经对采自不同疟区发热待查病人的滤纸干血滴和确诊疟疾病人的静脉血检测,344例血样中,检出阴性112例、P.f．109例、P.v.l114例、P．f. P.v.9例,阳性率67．4％;比常规镜检的阳性率66．3％稍高,尤以检出P．f． P．v．感染病例高。分别检测人工感染P.f．与P.v.各10只大劣按蚊的阳性唾腺,均被检出同种的阳性结果。结论一次性检测P．f.DNA与P.v.DNA的双重PCR法,敏感性高,特异性强,稳定性好,具有简化操作、提高工效、降低耗费的优点。对发热待查病人诊断和蚊媒感染疟原虫调查,以及疟疾病原学的检测质控方面,均有实用价值。