转染IL-2基因的膀胱癌瘤苗诱导的抗肿瘤作用

为了探讨以白细胞介素2(IL-2)基因修饰的肿瘤细胞作为瘤苗治疗膀胱癌的应用价值,采用脂质体介导法将携带IL-2基因的逆转录病毒载体转染入膀胱癌细胞系BTT_(739)中,流式细胞仪行细胞DNA周期分析,动物实验观察放射线灭活后基因瘤苗(BTT_(739)/IL-2细胞)的抗肿瘤免疫作用。建立能分泌IL-2的膀胱癌瘤苗BTT_(739)/IL-2细胞、DNA周期分析表明IL-2基因的导入及表达对BTT_(739)细胞的增殖无影响。放射线灭活后BTT_(739)/IL-2细胞丧失增殖能力,但仍能维持一定水平的IL-2分泌活性达2周左右。先用灭活的瘤苗免疫小鼠,可诱导免疫保护,3周后接种BTT_(739)时不形成肿瘤;用灭活的瘤苗治疗荷瘤小鼠,可使50％小鼠肿瘤消退并长期存活;对治愈后长期存活的小鼠再次接种高剂量BTT_(739)细胞,仍无肿瘤形成。结果提示转染IL-2基因的膀胱癌瘤苗诱导的抗肿瘤作用对预防肿瘤的发生、抑制和清除微小瘤灶,防止膀胱癌复发具有重要的应用价值。     

转人白细胞介素—2基因瘤苗诱导大鼠的抗肿瘤作用

经逆转录病毒载体将ｈＩＬ２基因导入大鼠Ｗａｌｋｅｒ瘤细胞ＷＴ２５６中，ＰＣＲ－ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ检测证实ｈＩＬ２基因已整合到ＷＴ２５６细胞基因组中，检测细胞培养上清证实转基因细胞具有分泌ｈＩＬ２活性。     

膀胱肿瘤基因瘤苗诱导抗肿瘤作用的形态学研究

转染白细胞介素２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ制备膀胱肿瘤基因瘤苗，在同基因鼠观察基因瘤苗致瘤和抗肿瘤作用的形态学改变，并结合这些改变探讨基因瘤苗的抗肿瘤作用机制。发现接种基因瘤苗所形成的肿瘤和经基因瘤苗治疗后的肿瘤生长缓慢，瘤内大量淋巴细胞浸润，并和瘤细胞粘附，瘤细胞的特征性改变是膜的孔形损害。提示基因瘤苗诱导的抗肿瘤作用主要是激活机体的抗肿瘤免疫反应。     

转人白细胞介素-12基因膀胱癌瘤苗的抗肿瘤作用

目的 制备人白细胞介素—12(hIL-l2)转基因膀胱癌瘤苗，观察其特异性抗肿瘤免疫作用。方法 经逆转录病毒载体将hIL—12编码基因导入膀胱癌细胞株MBT—2中，用聚合酶链反应(PCR)技术检测目的基因是否整合入MBT—2基因组中，用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测hIL—12活性，将转基因细胞接种到36只荷瘤小鼠，检测细胞毒T细胞杀伤活性。结果 hIL—12 cDNA经逆转录病毒载体导入MTT—2细胞中后，hIL—12基因已完整、稳定地整合到MBT—2基因组中，使MBT—2细胞具有分泌hIL—12活性，每24h达32．8mol/L以上。转基因细胞接种荷瘤小鼠后，可见瘤体变小(P＜0．01)，细胞毒T细胞杀伤活性增强。结论 转hIL—12基因瘤苗，能够诱导小鼠的特异性抗肿瘤免疫反应。     

卡介苗,白细胞介素—2膀胱内灌注防治膀胱肿瘤的初步报告

报告经尿道电切加膀胱内灌注BCG、IL-2治疗膀胱癌33例的满意疗效。单纯BCG组25例,随访23例,复发率17.39％;BCG加IL-2组8例,全部随访,复发率12.5％。并就两药的作用机理及疗效对比结果进行了讨论,认为:BCG加IL-2较单纯BCG灌注疗效好;术后监测T细胞亚群有一定价值,膀胱粘膜活检也有意义。     

逆转录病毒载体介导的人IL－2基因在膀胱肿瘤细胞T_（24）中的表达

报道逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ在人源性膀胱肿瘤细胞Ｔ２４中的表述，ＩＬ－２ｃＤＮＡ插入到真核表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ中，构建成ＩＬ－２ｃＤＮＡ的表达载体ｐＤＯＲＩＬ－２，磷酸钙沉淀法将其导入Ｔ２４细胞中，经Ｇ４１８选择，转染阳性率约为２０％；原位杂交技术检测ＩＬ－２ｃＤＮＡ可转录ＩＬ－２ｍＲＮＡ，细胞培养上清中ＩＬ－２活性２４小时每１０５细胞为８～３４Ｕ／ｍ１。表明ＩＬ－２基因在Ｔ２４细胞中已表达，为研制膀胱肿瘤转基因瘤苗及开展膀胱肿瘤基因治疗打下了基础。     

IFN—γ基因转染膀胱癌瘤苗诱导的特性抗肿瘤免疫反应

探讨转ＩＦＮ－γ基因膀胱癌瘤苗的可行性。采用脂质体介导法将携带鼠ＩＦＮ－γ基因的逆转录病毒载体转染入鼠膀胱癌细胞系ＢＴＴ７３９中，免疫荧光法检测转基因细胞ＭＨＣⅠ类抗原表达；动物实验观察其致瘤性和抗肿瘤免疫功能。     

IL—2膀胱灌注防治膀胱肿瘤复发的临床研究

术后早期采用小剂量白细胞介素－２（ＩＬ－２）２～３周后采用ＩＬ－２加卡介苗进行膀胱灌注防治膀胱肿瘤复发，并与单纯灌注卡介苗的患者进行对照，结果表明术后早期膀胱灌注ＩＬ－２，患者血中环磷酸腺苷（ｃＡＭＰ）肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）含量升高，１年及１～４年总复发率降低，效果较单纯灌注卡介苗优越，提示ＩＬ－２膀胱灌注可调节免疫功能，通过ｃＡＭＰ下调癌基因表达及诱导分化，防治肿瘤复发，是防治膀胱肿瘤复发的安全     

切缘注射加术后灌注预防膀胱肿瘤复发

为降低膀胱癌术后复发率，对２４例患者采用术中切缘注射白细胞介素２（ＩＬ２）和术后膀胱灌注卡介苗（ＢＣＧ）及ＩＬ２治疗。随访６～６６个月，复发率为１２．５％。认为此方法预防膀胱肿瘤术后复发安全有效。     

转人白细胞介素2基因人膀胱癌细胞株的建立及体外生物学特性

探讨转基因膀胱癌瘤苗的可行性。采用逆转录病毒载体Ｚｉｐ／ｈＩＬ－２将ｈＩＬ－２基因导入人膀胱癌细胞系ＥＪ细胞中，在体外建立了具有分泌ｈＩＬ－２活性的细胞株ＥＪ／ＩＬ－２。经ＰＣＲ－ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ检测证实ｈＩＬ－２基因已整合到ＥＪ／ＩＬ－２基因组中。流式细胞仪行细胞ＤＮＡ周期分析表明ｈＩＬ－２基因的导入及表达对ＥＪ细胞的增殖无影响。免疫荧光检测发现ｈＩＬ－２基因的导入及表达不能促进ＥＪ细胞表面ＨＬＡ抗原的表达。放射线灭活后ＥＪ／ＩＬ－２细胞丧失增殖能力，但仍能维持一定水平的ｈＩＬ－２分泌活性达２周左右。从而为制备灭活的转基因瘤苗提供了初步经验。     

体外转染小鼠白细胞介素12基因抑制膀胱癌EJ细胞的实验研究

目的将含有小鼠白细胞介素12（mIL-12）全长基因的质粒转染到膀胱癌EJ细胞中,观察脾细胞对转染mIL-12膀胱癌细胞的杀伤作用。方法用脂质体转染法将含有mIL-12全长基因质粒转染到EJ细胞中,ELISA法检测IL-12表达水平。在脾细胞作用0～2 d时ELISA法连续检测上清干扰素γ（INF-γ）水平变化。转染后40 h加入制备好的小鼠脾细胞悬液约1×10^6作用24 h后,MTT法检测对膀胱癌细胞的抑制率。结果转染后40、60 h检测到IL-12的高表达（375±15） pg／ml和（400±50）pg／ml,较未转染组9～15 pg／ml明显增高;在EJ细胞表面可以检测到IL-12的表达,而对照组则无;加入脾细胞悬液1 d后,脾细胞加转染后的EJ细胞组的抑制率为58．7％（P〈 0．025）,而脾细胞加未转染EJ细胞组、单纯EJ细胞组以及转染的EJ细胞组差异无统计学意义（P〉 0．05）。脾细胞加入转染后EJ细胞上清24 h的。INF-γ为（155±21）pg／ml,与未转染组（65±8）pg／ml比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论体外转染mIL-12基因到膀胱癌EJ细胞中能够表达IL-12,在小鼠脾细胞存在的条件下,通过一系列的免疫调节作用,诱导T细胞、NK细胞等产生INF-γ等细胞因子从而杀伤膀胱癌细胞。     

白细胞介素2基因工程人大肠癌细胞瘤苗的建立及鉴定

目的 建立高表达白细胞介素2的基因工程人大肠癌细胞瘤苗，并完成相关的实验室鉴定。方法 采用重组逆转录病毒将人白细胞介素2基因转导至三株人大肠癌细胞，G418筛选并挑选单克隆，ELISA检测各单克隆24h白细胞介素2表达量，用Student Newman Keuls检验三株细胞白细胞介素2的表达差异，PCR、Southern blot检测白细胞介素2基因整合，RT-PCR、Northern blot检测白细胞介素2基因转录水平。结果 获得72株G418抗性单克隆，其中表达量最高者为COL0205达138.01ng/L×10^7/24h，统计显示COLO205与SW1116、HT-29组间相比差异有统计学意义（P〈0.05），白细胞介素2基因整合至细胞基因组中，未发生重组或部分缺失，且获得成功表达。结论 本研究成功建立了高表达白细胞介素2的基因工程人大肠癌细胞瘤苗。     

野生型p53基因导入对膀胱癌细胞生长抑制和H－ras基因表达调控

通过逆转录病毒载体将外源野生型ｐ５３基因导入膀胱癌细胞ＢＩＵ－８７和ＥＪ，使细胞在体外标准培养条件下生长速率降低，丧失裸鼠致瘤性。细胞周期分析显示Ｇ０＋Ｇ１细胞比率明显增高，已证明，ＢＩＵ－８７和ＥＪ细胞都有ｒａｓ基因突变和表达扩增。进一步研究发现，转染的细胞内Ｈ－ｒａｓｍＲＮＡ表达低于非转染细胞。结果提示，增加细胞内野生型ｐ５３基因表达量能抑制突变的ｒａｓ基因表达，从而抑制膀胱癌细胞的恶性增殖。     

LRIG1基因对膀胱癌细胞侵袭力的影响

目的探讨抑癌基因LRIG1对膀胱癌细胞BIU87侵袭能力的影响。方法用脂质体介导的基因转染技术,将pLRIG1-GFP质粒转染人膀胱癌细胞BIU87,用G418筛选出抗性克隆。用Boyden小室观察转染前后细胞侵袭能力的变化,并用逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）法和Western—blot检测转染前后LRIG1和表皮生长因子受体（EGFR）的mRNA和蛋白表达水平。结果转染pLRIG1-GFP后的BIU87细胞侵袭能力显著降低,LRIG1的mRNA和蛋白表达水平明显升高,而EGFR的mRNA和蛋白表达水平则显著降低（P〈0．01）。结论LRIG1对膀胱癌细胞BIU87的侵袭能力有显著的抑制作用。     

CD44v和nm23-H1产物在复发性膀胱癌表达的意义

目的探讨ＣＤ４４ｖ和ｎｍ２３－Ｈ１产物对诊断膀胱癌恶性程度和复发的意义。方法应用流式免疫法对４５例膀胱癌标本的ＣＤ４４ｖ和ｎｍ２３－Ｈ１基因产物的表达进行研究。结果ＣＤ４４ｖ产物的高表达和ｎｍ２３－Ｈ１产物的低表达与膀胱癌的浸润程度和复发均有关（Ｐ＜０．０５）。在膀胱癌中ＣＤ４４ｖ和ｎｍ２３－Ｈ１基因产物表达呈负相关（ｒ＝－０．２８７６）,在复发性膀胱癌中两者表达亦呈负相关（ｒ＝－０．４２３８）。结论ＣＤ４４ｖ和ｎｍ２３－Ｈ１表达在膀胱癌发生发展和预后中起协同作用,同时检测ＣＤ４４ｖ和ｎｍ２３－Ｈ１基因产物的表达能为判断膀胱癌的恶性程度和复发提供依据     

腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦系统杀伤膀胱癌细胞的研究

目的：探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶基因／更昔洛韦（HSV－tk/GCV)系统杀伤膀胱癌细胞的作用。方法;采用人巨细胞病毒早期蛋白启动子驱动HSV－tk基因重组腺病毒（Ad)载体,体外转染HTB9和Scan BER细胞,MTT法测定杀伤率,PCR检测Ad-tk转染细胞中tk基因及腺病毒E1区基因。结果：GCV对转染的癌细胞有杀伤作用,感染复数（MOI）100时,10mg/L GCV杀伤80％的tk^ 细胞,而对未转染的细胞无杀伤作用。不同MOI的Ad-tk转染两种细胞,其毒性与Ad-tk MOI正相关,MOI100时,15mg/L GCV杀伤100％的细胞,无GCV组未受到抑制。PCR证实Ad-tk转染细胞有tk基因,腺病毒E1区基因阴性。Annexin V法证实杀伤效应与凋亡有关。结论：HSV-tk/GCV系统是一种有效,安全治疗膀胱癌的新方法。     

胞嘧啶脱氨酶基因修饰的结肠癌细胞瘤苗抗肿瘤研究

目的 研究胞嘧啶脱氨酶（EC—CD）自杀基因修饰的结肠癌细胞瘤苗的抗肿瘤作用。方法 用含EC-CD基因的逆转录病毒质粒pLCDSN将人EC—CD基因转导入鼠结肠癌细胞株CT26，用G418进行筛选，得到抗性克隆CT26／CD，比较CT26／CD与野生型CT26的成瘤性，评价CT26／CD对野生型CT26细胞肝转移模型的治疗作用。结果 CT26／CD能在含0．6g／LG418的培养液中稳定生长；RT—PCR证实EC—CD基因在CT26／CD中表达；CT26／CD细胞对5-氟胞嘧啶（5-FC）的敏感性明显增加（P=0．000），且具有良好的旁观者效应；CT26／CD的成瘤性与野生型CT26相似（P=0．892）；CT26／CD联合5-FC对野生型CT26的肝转移有明显抑制作用，明显延长了荷瘤小鼠存活期（P=0．000）。结论 EC—CD基因修饰的结肠癌细胞瘤苗有一定的抗肿瘤作用。