应用生物反应器体外构建组织工程化血管平滑肌层

目的探讨生物反应器内构建具有一定强度的组织工程化血管的可行性。方法将体外培养扩增的猪血管平滑肌细胞接种于聚羟基乙酸(PGA)上,形成细胞材料复合物,将其置于生物反应器内培养。实验组(n=5)为动态力学刺激培养(搏动频率:75次/分;扩张量:<5%);对照组(n=5)为静态培养。3周后行大体观察及组织学检测。结果血管样组织直径5mm,长10mm,厚1mm。实验组具有良好的弹性,管腔圆;平滑肌纤维与弹力纤维较多,排列有层次。对照组弹性欠佳,管腔塌陷;平滑肌纤维与弹力纤维较少且排列紊乱。结论应用生物反应器可构建具有良好弹性的血管平滑肌层组织。     

反应器内构建组织工程血管平滑肌层的实验研究

目的 探讨生物反应器内构建组织工程血管的可行性.方法 于6个月龄犬颈总动脉血管获取平滑肌细胞,经体外培养扩增后接种于聚羟基乙酸(PGA)上,形成细胞-材料复合物,并将其置于生物反应器内培养.实验组模拟成年哺乳动物循环系统的参数予以动态力学刺激培养(搏动频率:75次/分;扩张量＜5%);对照组为静态培养,其余与实验组相同,分别于3与6周后取材检测.结果 生物反应器内培养的血管大体观察具有良好的弹性,管腔圆,色泽光亮;HE染色显示平滑肌纤维成分排列较规则,有层次感;弹力纤维染色显示弹力纤维成分较多而密;免疫组织化学检测显示为棕黄色层状排列的平滑肌纤维.对照组弹性欠佳,管腔塌陷,色泽暗淡;平滑肌纤维与弹力纤维成分较少且排列紊乱,层次感差.结论 应用生物反应器可构建具有良好结构的血管样结构的平滑肌层组织.     

应用脂肪干细胞构建组织工程化小口径血管平滑肌层的实验研究

目的探索利用脂肪干细胞在生物反应器内构建组织工程血管平滑肌层的可行性。方法用抽吸的脂肪获取脂肪干细胞,在生长因子TGF-β1和BMP4作用下诱导成平滑肌细胞,然后将诱导的平滑肌细胞接种于PGA上,将细胞-材料复合物置于生物反应器内进行培养,在模拟胚胎发育血流动力学的刺激下(搏动频率:75次/分;扩展量<5%),构建小口径的血管平滑肌组织。培养8周后,取材行组织学和生物力学检测并与正常血管对比。结果脂肪干细胞在TGF-β1和BMP4的诱导下,细胞呈现平滑肌细胞特有的"波峰-波谷"样生长特点,并表达平滑肌细胞的特异性标记物α-SMA、SM22α、calponin和SM-MHC;反应器内培养8周后,构建的管状组织胶原分泌旺盛,具有一定的力学强度和弹性。结论利用脂肪干细胞可在体外生物反应器内构建组织工程化小口径血管平滑肌层,为临床上小血管病变的修复提供了一种新的可能的途径。     

组织工程技术构建小口径血管的实验研究

目的 探讨运用组织工程技术构建血管组织的方法。方法 将体外培养、扩增的新生婴儿脐静脉血管内皮细胞与平滑肌细胞接种于片状聚羟基乙酸材料上,形成细胞-材料复合物,将该复合物包绕于硅胶管使成管状结构后移植于裸鼠皮下,第2及第6周后行大体及组织学检测。结果 组织工程技术构建的血管组织大体结构与天然血管相似,免疫组化显示组织工程化血管最内层有Ⅷ因子阳性细胞覆盖,管壁内有大量细胞外基质及散在的α-平滑肌肌动蛋白阳性细胞存在。结论 运用组织工程技术可形成具有与正常血管组织学结构相似的血管。     

组织工程技术修复犬腹主动脉缺损的初步研究

目的 探讨应用组织工程学技术修复犬腹主动脉缺损的可行性.方法 将体外培养、扩增的犬自体血管平滑肌细胞与内皮细胞接种于管型PGA支架上,形成细胞-材料复合物,将该复合物回植修复自体犬腹主动脉缺损,术后螺旋CT等检测血流通畅情况.结果 对照组血管在回植后24小时内即发生了栓塞,而实验组则维持血流通畅至少达术后1周.结论 应在组织工程化血管体外培养过程中加入适当力学刺激促使其成熟后再回植修复缺损.     

组织工程化血管构建的初步实验研究

目的探讨组织工程化血管构建的初步实验方法。方法预构具有三维结构的胶原蛋白-几丁聚糖骨架,以人血管内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞作为种子细胞,培育后二步法种植并行工程化血管成熟培养。经生物学检测,补片修补实验鼠腹主动脉人为缺损。结果人血管内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞可作为种子细胞应用;预制的三维骨架具有良好的组织和细胞兼容性,种植种子细胞后可形成良好的细胞黏附、生长;体外静态及生物反应器培养,工程组织中细胞数及细胞外基质含量明显增加（P〈0．05）;血小板凝集试验表明该工程组织具有一定的抗凝特性;修补大鼠腹主动脉缺损,术后10d可维持通畅。结论胶原蛋白-几丁聚糖预构的三维骨架可应用于血管组织工程研究,细胞种植后经成熟培养,可初步构建具有一定强度和抗凝特性的组织工程化血管。     

组织工程血管模型体外构建的实验研究

目的：在体外环境下，探索构建分别含内皮细胞，平滑肌细胞及成纤维细胞的三层结构的组织工程化血管，三种细胞相互作用，相互支持，形成一个在形态和功能与正常血管近似的组织工程化血管。方法：通过用胶原分别包埋处理的三个管径大小不同，但能相互嵌套的聚羟基乙酸（PGA）管形支架，并种植人脐静脉内皮细胞，人血管平滑肌细胞，人成纤维细胞进行三维立体生长培养，观察细胞生长分化情况。采用酶消化法和组织块法分离培养人脐静脉内皮细胞，人血管平滑肌细胞，人成纤维细胞并传代，纯化，将聚羟基乙酸（PGA）无纺网用胶原溶液包埋，真空冷冻干燥，形成多孔状PGA＋胶原管型支架；接种3代－7代人脐静脉内皮细胞，人血管平滑肌细胞及人成纤维细胞与其内腔面，采用动脉旋转培养技术体外培养3周，行扫描电镜观察。结果：构建后的血管模型，层与层结构紧密，内皮细胞，平滑肌细胞及成纤维细胞分泌细胞外基质，相互进行物质交换，类似于生理条件。结论：该支架具有一定弹性和韧性，在培养液中，能较长时间保持形状。此方法的进一步应用组织工程方法构筑具有分层结构的人造血管打下基础。     

兔阴囊原位构建组织工程化睾丸假体的实验研究

目的探讨以HDPE-PGA复合支架接种兔耳软骨细胞后,于兔阴囊原位内构建组织工程化睾丸假体的可能性。方法取成年兔耳软骨分离培养软骨细胞,制备HDPE-PGA复合支架,细胞-支架复合物体外培养2w。摘除单侧兔睾丸后即时将经体外培养的细胞-支架复合物植入阴囊原位,术后3m将兔处死取材。单纯支架植入为对照组。标本行大体观察、组织学、组织化学、免疫组化、GAG含量检测。结果实验组取材标本经检测具有预制形态与体积,有新生软骨组织产生,软骨组织呈岛状分布,其间有不同程度的纤维组织长入及炎性细胞浸润。对照组无软骨形成。结论兔阴囊原位内构建组织工程化睾丸假体具有预制形态与体积、结构与组织学形态良好。     

生物组织工程化气管的研究进展

生物组织工程化气管是利用组织工程学的原理和技术在体外构建出具有气管主要生理功能的一种具有生物活性的人工气管，作为气管缺损外科修复的气管替代物。它的构建过程是，首先选取一定数量的经体外培养扩增种子细胞，把它们种植在生物相容性好、可降解的支架材料上；然后将此细胞材料复合物置于生物反应器当中或自体皮下，经过一段时间的诱导分化和培养即形成组织工程化气管。与其它种类的气管替代物相比，组织工程化气管具有无免疫原性、无排斥反应、有生物活性等优点，这将为寻找一种适合机体内环境的气管移植材料带来一条有希望的途径。但是该领域的研究工作还面临着诸如组织工程化气管的血管化、体外培养和植入后的感染等难题，要将组织工程化气管真正应用到临床，还有很长的路要走。我们从细胞支架的研究、种子细胞的选择和组织工程化气管的构建这三方面对组织工程化气管的研究进行综述。     

聚羟基乙酸作为支架材料体外构建复层膀胱壁结构的探讨

目的：探讨聚羟基乙酸（polyglycolic acid,PGA）作为支架材料并复合成年猪膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞,体外构建复层膀胱壁结构的可行性。方法：采用PGA作为支架材料。并以聚乳酸（polylact acid,PLA）塑形。以酶消化法分别获得猪膀胱尿路上皮细胞和平滑肌细胞,并体外扩增。以MTT法分别检测P3代膀胱平滑肌细胞（SMC）和尿路上皮细胞（UC）的体外增殖能力。将P3代膀胱平滑肌细胞先接种在支架上,再接种尿路上皮细胞。将细胞一材料复合物体外培养1～2周并行组织学鉴定。结果：酶消化法获得的膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞经过体外培养仍具有较强的体外增殖能力。细胞材料复合物体外培养1周后形成分层排列结构,包括黏膜上皮层和膀胱平滑肌层。免疫组织化学显示平滑肌层α-Smooth Muscle Actin表达阳性,黏膜上皮层广谱角蛋白表达阳性。而细胞材料复合物继续体外培养至2周,细胞从支架上大量脱落。结论：PGA适合作为复层膀胱壁结构体外构建的支架材料。采用PGA作为支架材料并复合膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞,可以体外构建出类似复层膀胱壁结构。细胞材料复合物体外培养1周左右较适合进行体内回植修复。     

小口径组织工程血管体外构建的研究

目的 探讨间充质干细胞体外构建组织工程血管的可行性.方法 将体外培养扩增的犬骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化为平滑肌样细胞和内皮样细胞,接种于ε-己内酯/L-丙交酯(PCLA)支架上,将其置于生物反应器内,在搏动性力学(100±20/55±20)mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)刺激条件下培养.3 d后行血管组织学检测.结果 血管支架拉伸强度6.1 MPa;骨髓间充质干细胞成功定向分化为平滑肌样细胞和内皮样细胞;血管腔内表面完全为细胞覆盖,表面的细胞沿液体流动的方向分布;种植的部分细胞已经渗透入血管壁内.结论 骨髓间充质干细胞可作为种子细胞,与PCLA支架在生物反应器内构建组织工程血管.     

Mesenchymal stem cell-based tissue engineering of small-diameter blood vessels

The aim of the study was to construct small-diameter vascular grafts using canine mesenchymal stem cells (cMSCs) and a pulsatile flow bioreactor. cMSCs were isolated from canine bone marrow and expanded ex vivo. cMSCs were then seeded onto the luminal surface of decellularized arterial matrices, which were further cultured in a pulsatile flow bioreactor for four days. Immunohistochemical staining and scanning electron microscopy was performed to characterize the tissue-engineered blood vessels. cMSCs were successfully seeded onto the luminal surface of porcine decellularized matrices. After four-day culture in the pulsatile flow bioreactor, the cells were highly elongated and oriented to the flow direction. Immunohistochemistry demonstrated that the cells cultured under pulsatile flow expressed Von Willebrand factor, an endothelial cell marker. In conclusion, cMSCs seeded onto decellularized arterial matrices could differentiate into endothelial lineage after culturing in a pulsatile flow bioreactor, which provides a novel approach for tissue engineering of small-diameter blood vessels.     

骨髓间充质干细胞体外构建组织工程化半月板

目的探索以骨髓间充质干细胞（BMSCs）为种子细胞,在体外构建具有完整内侧半月板形态的软骨样组织的方法。方法运用模具制备内侧半月板形的PGA/PLA支架。抽取犬骨髓,分离培养BMSCs,将其接种于支架材料上,5 d后使用软骨诱导液培养。体外培养6周后,行大体观察、组织学检测及生物力学检测。结果细胞材料复合物能够较好地维持半月板三维立体结构,形成了表面光滑、触之有弹性的瓷白色软骨样组织。 HE染色可见典型的软骨陷窝出现,说明成熟软骨组织的形成。Safranine O染色证实有蛋白聚糖基质产生。生物力学检测显示,新生组织弹性模量达正常半月板组织的12.7%。结论 BMSCs通过体外诱导,可在体外分化为较成熟的软骨组织,并构建出组织工程化半月板。     

组织工程学方法体外构建血管的研究

目的 探讨用组织工程学方法构建血管的可行性。方法 实验组：将体外培养、扩增的人脐带动脉平滑肌细胞与用可降解的生物材料聚乙醇酸(PGA)制成的管状结构结合，体外培养1周后植入裸鼠背部皮下。分别于2、4、5、6、11周取材进行大体及组织学检测；对照组：将没有细胞的单纯管状PGA植入裸鼠背部皮下，于相同时间点进行检测。结果 实验组在观测点均形成一内壁光滑的管状结构，组织学检测表明，该结构随观测时间的延长组织学成分也有明显的变化，从开始以PGA为主向平滑肌细胞及其分泌的胶原为主要成分过渡。而对照组则随着PGA的降解管状结构逐渐丧失。结论 组织工程学方法可形成具有一定张力及组织成分的管状结构。该方法用于构建血管是可行的。     

MSCs与CD34~+单核细胞共培养联合脱细胞支架植入体内构建兔阴茎海绵体

目的研究将异体骨髓间充质干细胞(MSCs)和CD34~+单核细胞(MNCs)共培养体系种植于脱细胞海绵体支架上在兔体内构建阴茎海绵体组织的可行性。方法分别从兔骨髓与兔外周血中提取并鉴定MSCs与CD34~+MNCs,将两种细胞组分以107/mL的密度种植于制备好的兔阴茎海绵体脱细胞胶原支架上,同时将相同密度的MSCs、CD34~+MNCs分别种植于支架上,培养4天后植入一种兔阴茎海绵体缺损模型中。3个月后对工程化组织进行取材,行HE及Masson三色染色等组织学检测。结果 MSCs和CD34~+MNCs共培养组近白膜处的海绵体保留了正常海绵体结构,而MSCs组、CD34+单核细胞组及空白支架组以疤痕增生为主,尽管较之CD34~+单核细胞组及空白支架组,间充质干细胞组疤痕组织中的血管数目较多(P0.05)。结论我们的研究证明了将MSCs和CD34~+MNCs的共培养体系种植于脱细胞支架上植入兔体内可以构建出一段组织学上与原生海绵体相似的组织;CD34~+MNCs在体内主要通过协同MSCs而非单独发挥其促血管化的生物学效应。     

毛囊干细胞结合电纺纳米丝素纤维构建组织工程尿道膜片的体外研究

目的：探索毛囊干细胞结合电纺纳米丝素纤维,构建组织工程尿道膜片的可行性。方法使用酶消化法分离兔毛囊细胞,利用流式细胞仪分选毛囊干细胞,体外原代培养扩增,计算细胞的最大扩增倍数及克隆形成率;使用流式细胞仪检测细胞K19、p63、CD29的阳性表达率。将毛囊干细胞接种在电纺纳米丝素纤维支架上,构建组织工程尿道。应用组织学、荧光染色法观察组织工程尿道的体外构建情况。结果兔毛囊干细胞与兔毛囊细胞的最大扩增倍数分别为（5.92±0.77）×10^4倍和（6.61±3.62）×10^3倍;兔毛囊干细胞与兔毛囊细胞的克隆形成率分别为（9.07±1.18）%和（3.95±1.01）%。K19、p63、CD29在毛囊干细胞中表达率分别为（89.36±6.69）%、（92.10±5.49）%和（89.98±6.89）%;在兔毛囊细胞中分别为（39.38±2.20）%、（40.78±2.61）%和（40.57±2.79）%;毛囊干细胞在支架上能形成复层上皮样结构,AE1/AE3染色阳性。结论兔毛囊干细胞结合电纺纳米丝素纤维,能成功构建组织工程尿道,可用于体内修复的进一步研究。     

血管内皮细胞与平滑肌细胞复合构建组织工程人工血管的实验研究

目的：构建既具有活性血管平滑肌细胞（VSMC）中膜层，又有血管内皮细胞（VEC）内皮化的复层结构组织工程血管支架材料。方法（1）将聚羟基乙俊（PGA）纤维无纺网，VSMC和胶原纤维相混合，设计构建VSMC活性的组织工程血支架材料。（2）采用酶消化法从兔主动脉中分离培养兔VEC并传代，纯化，接种于组织工程人工血管支架的内腔，体外培养，并行电镜观察。结果：构建的支架材料具有一定弹性和韧性，VEC在其内表达形成较完整内皮细胞层，且VSMC能够保持活性，生长状况良好。结论：经胶原包埋处理的PGA支架可作为组织工程化人工血管研究较理想支架材料，为组织工程方法构建具有分层结构的组织工程血管奠定实验基础