抗p185单克隆抗体的制备及初步应用

抗ｐ１８５单克隆抗体的制备及初步应用许金华杜红杨蔚孙素莲（北京市肿瘤防治研究所，北京１０００３４）ｐ１８５是癌基因ｃ－ｅｒｂＢ－２（或称ＨＥＲ－２／ｎｅｕ）的表达产物，其分子量为１８５ｋＤ，故称ｐ１８５。已知ｐ１８５在腺癌类如乳腺癌、卵巢癌、胃癌及...     

血清p185蛋白与p185糖链测定方法的比较

c-erbB-2基因表达产物p185蛋白的细胞外区域可脱落进入细胞外基质,血清p185水平对于判断乳腺癌的发生发展、预后及复发具有重要意义。实验用BA-ELISA和凝集素ELISA分别检测血清p185蛋白和p185糖链,并对二者进行比较。     

抗人P185^erbB2单克隆抗体的制备及特性分析

制备可特异识别Ｐ１８５＾ｅｒｂＢ２胞外区的单抗，选出亲和力较高并具有抑制瘤作用的克隆。方法以高表达ｅｒｂＢ２的人乳腺癌细胞系ＳＫＢＲ３免疫ＢＡＢＬ／ｃ小鼠，用纯化的重组ＤＮＡ表达的Ｐ１８Ｔ胞外区蛋白作为抗原，以间接ＥＬＩＳＡ方法筛选阳性克隆。结论所获单抗可特异识别Ｐ１８５胞外区抗原，具有肿瘤诊断，判断预后及人源化造造后用于治疗的应用潜力。     

125 I标记的抗p185抗体的体外代谢与体内生物学分布

目的：研究^125Ⅰ标记的抗p185抗体（鼠mAb A21、人鼠嵌合抗体A21 scFv-Fc及单链抗体A21 seFv）在体外的细胞代谢和在体内的生物学分布，为其在诊断和治疗高表达p185肿瘤的临床应用提供依据。方法：通过FACS检测抗体是否与高表达膜表面抗原p185的SKOV，特异结合。采用氯胺T法进行碘标记抗体，用细胞放射免疫分析实验，检测抗体在SKOV、细胞中的代谢。建立荷SKOV，裸鼠模型，以观察抗体的体内生物学分布。结果：体外细胞代谢实验表明，抗体在与细胞膜表面结合后，进而被内吞入细胞，在细胞内降解和脱碘，最后被分泌出细胞外。体内药物代谢实验表明，抗体在动物体内肿瘤部位出现选择性放射性浓聚，而无关抗体未出现放射性浓聚，呈全身分布。结论：mAb A21，A21 seFv-Fc和A21 scFv对于高表达p185的卵巢癌在体内和体外都具有亲和力，可单用作高表挟D185肿瘤的诊断和治疗。     

抗c-erbB-2p185蛋白胞内区多肽单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的 研制抗c-erbB-2胞内区多肽单克隆抗体,用于乳腺癌等c-erbB-2过量表达的诊断及指导治疗。方法 合成p185蛋白胞内区多肽作为抗原,免疫BALB／C小鼠建立了一组分泌抗该多肽的特异性高亲和力单克隆抗体杂交瘤细胞系,并对该单抗的生化特性及其免疫学反应性进行了研究和测定,并与美国食品药品管理局（FDA）批准的抗c-erbB-2多克隆抗体进行了比较。结果 共获得3株稳定分泌抗p185胞内区单抗的杂交瘤细胞株。其中035－E61株单抗经过39例（T1－2N0M0）乳腺癌患者组织病理切片进行免疫组织化学染色,c-erbB2-2过量表达阳性率为26％,而乳腺纤维腺瘤组织切片没有非特异染色;流产正常胎儿器官组织切片除甲状腺、肾上腺和肾小管上皮表达外,其余均不表达。与FDA批准的DAKO公司多抗的阳性染色符合率为74％。结论 035－E61单抗可特异识别乳腺癌细胞内p185胞内区抗原。对判断乳腺癌预后及指导治疗可能具有应用价值。     

抗人P185~(erbB_2)单克隆抗体的制备及特性分析

目的制备可特异识别 P185 erb B2 胞外区的单抗 ,选出亲和力较高并具有抑瘤作用的克隆。方法以高表达 erb B2 的人乳腺癌细胞系 SKBR3免疫 BABL / c小鼠 ,用纯化的重组 DNA表达的 P185胞外区蛋白作为抗原 ,以间接 EL ISA方法筛选阳性克隆。结果获得 10株稳定分泌抗 P185胞外区单抗的杂交瘤细胞株。 4株为 Ig G1、1株为 Ig G3、5株为 Ig M,分别可识别 P185胞外区 3个不同表位 ,且只与天然形式的 P185胞外区特异结合。其中 4株 Ig G1类抗体可明显抑制 SKBR3及 SKOV3细胞增殖。免疫组化实验可使 SKBR3及 SKOV3细胞膜特异性染色 ,且可检出乳腺癌、卵巢癌等石蜡切片标本中 erb B2 高表达的阳性细胞。结论所获单抗可特异识别 P185胞外区抗原 ,具有肿瘤诊断、判断预后及人源化改造后用于治疗的应用潜力。     

~(125)I标记的抗p185抗体的体外代谢与体内生物学分布

目的:研究125I标记的抗p185抗体(鼠mAbA21、人鼠嵌合抗体A21scFv-Fc及单链抗体A21scFv)在体外的细胞代谢和在体内的生物学分布,为其在诊断和治疗高表达p185肿瘤的临床应用提供依据。方法:通过FACS检测抗体是否与高表达膜表面抗原p185的SKOV3特异结合。采用氯胺T法进行碘标记抗体,用细胞放射免疫分析实验,检测抗体在SKOV3细胞中的代谢。建立荷SKOV3裸鼠模型,以观察抗体的体内生物学分布。结果:体外细胞代谢实验表明,抗体在与细胞膜表面结合后,进而被内吞入细胞,在细胞内降解和脱碘,最后被分泌出细胞外。体内药物代谢实验表明,抗体在动物体内肿瘤部位出现选择性放射性浓聚,而无关抗体未出现放射性浓聚,呈全身分布。结论:mAbA21,A21scFv-Fc和A21scFv对于高表达p185的卵巢癌在体内和体外都具有亲和力,可望用作高表达p185肿瘤的诊断和治疗。     

血清p185蛋白和CA153对乳腺癌患者的临床应用价值研究

目的检测乳腺癌患者血清p185蛋白表达及肿瘤标志物CA153水平,分析血清p185蛋白与肿瘤标志物CA153的相关性,探讨二者检测在乳腺癌患者中的临床应用价值。方法收集2010年至2012年间在我院住院治疗的乳腺癌55例患者术前、手术后一周血清各一份,应用免疫PCR法检测血清p185蛋白表达,化学发光法检测血清CA153水平。结果乳腺癌患者血清p185蛋白表达和血清CA153水平与临床分期均显著相关(P<0.05),血清p185蛋白表达与淋巴结转移情况无关系(P﹥0.05),血清CA153水平与淋巴结转移情况相关(P<0.05);乳腺癌患者血清p185表达与手术无关(P>0.05),手术前后血清p185蛋白表达无差异,乳腺癌患者血清CA153水平和手术相关(P<0.05),手术前血清CA153水平明显高于术后;乳腺癌患者术前血清CA153水平和p185蛋白表达相关(P<0.05),乳腺癌血清p185蛋白表达阳性患者,血清CA153水平高于阴性患者;乳腺癌患者复发或转移与血清p185蛋白表达及患者术前血清CA153水平相关(P<0.05),血清p185蛋白阳性患者复发或转移率明显高于阴性患者,术前CA153水平高的患者,复发或转移率高。结论乳腺癌患者血清p185蛋白表达与肿瘤标志物CA153水平有相关性,肿瘤标志物CA153可用于术后随访,术前检测乳腺癌患者血清p185蛋白表达与肿瘤标志物CA153水平可用于乳腺癌的预后判断。     

分泌抗p185合成多肽McAb杂交瘤细胞系的建立

用多肽固相合成仪合成人癌基因产物ｐ１８５ＨＥＲ－２（即ｐ１８５）胞内区的肽段，以之与沙门氏裸菌偶联制成免疫原，经脾内、腹腔、静脉途径免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，获得具有高抗体活性的脾细胞，后者与ＳＰ２／０融合，筛选出５株杂交瘤细胞系并对其分泌的单克隆抗体（ＭｃＡｂ）特性进行了初步分析，ＥＬＩＳＡ检测腹水效价为１０－４～１０－６，用多肽和沙门氏裸菌分别进行中和试验，多肽抑制率在５０％以上，而沙门氏裸菌则不能中和抗体反应。测定其中两株ＭｃＡｂ亲和常数（Ｋａ）分别为２．５×１０７Ｍ－１，５．０×１０８Ｍ－１。表位分析结果表明这两株ＭｃＡｂ针对同一抗原表位     

抗p185单抗5E12Fab段基因的克隆及表达

目的：克隆抗p185单抗5E12的Fab段基因并在原核细胞进行表达。方法：用逆转录．聚合酶链反应技术（RT-PER），以可变区第一骨架区的通用引物从分泌抗p185单抗的杂交瘤细胞系5E12中克隆Fd段和K链的基因，重组到Fab表达载体中，在大肠杆菌中表达噬菌体抗体和可溶性Fab；根据前导肽序列设计引物，通过PER介导的定点突变将V区基因氨基端序列恢复为5E12的原始序列；以NIH3T3／erbB-2细胞ELISA法、免疫组化法等进行特异性鉴定。结果：以第一骨架区的通用引物从小鼠杂交瘤细胞5E12中克隆到Fd段和k链的基因，在大肠杆菌中表达出Fab段抗体但无特异性抗原结合活性，分别将Fd段和k链V区基因的氨基端序列矫正为亲本单抗的原始序列后，恢复了Fab段的抗原结合活性。单独恢复Fd段可变区氨基端序列可恢复抗原结合活性。但同时恢复k链后活性却有所下降。结论：成功构建了抗p185小分子抗体Fab并进行功能性表达，为进一步构建抗p185鼠单抗其他小分子抗体及其人源化改造打下基础；进一步证实抗体氨基端序列对抗体活性的重要性，为今后以PER方法构建小分子抗体的工作提供了有益的借鉴。     

表面表位包埋法制备肿瘤表面抗原P185neu/c-erbB-2单克隆抗体及其性质研究

目的 :细胞表面表位包埋法 (SEM)是一种选择细胞表面特定的表达分子制备单克隆抗体的新途径。由于P185 neu c erbB 2 是乳腺癌及其他肿瘤的一个重要表面标志 ,这个研究旨在应用SEM法制备特异性好 ,灵敏度高的P185单克隆抗体并分析其特性以便于临床。方法 :采用细胞表面表位包埋法免疫BALB C小鼠 ,常规杂交瘤技术进行细胞融合 ,ELISA法测定 ,有限稀释法克隆化。结果 :筛选得到 3株能稳定分泌抗人癌基因erbB 2产物P185蛋白的McAb杂交瘤细胞。经间接免疫过氧化物酶染色和流式细胞术分析证明该McAb特异性与P185阳性细胞膜结合 ,而不与结构类似的EGFR膜阳性细胞结合。免疫印迹实验证明这些McAb特异地与P185蛋白结合 ,病理切片免疫组化结果证明该单抗对乳腺癌组织呈特异膜阳性反应。结论 :SEM法制备的肿瘤表面抗原P185的McAb杂交瘤具有很好的用于临床诊断肿瘤抗原P185的价值及工程化改造的前景。     

bFGF单抗的抗血管新生作用

目的在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)以及鸡胚中来研究抗碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)单抗对血管新生的作用。方法制备3种腹水型bFGF单抗MabF7,MabF10,MabF12。CCK-8法检测bFGF单抗对HUVECs细胞增殖的影响;Transwell小室研究bFGF单抗对HUVECs迁移的影响;ECM gel检测其对HUVEC体外成管的影响;并研究其体内对鸡胚尿囊膜(CAM)血管新生作用。结果 MabF7,MabF10,MabF12均可中和bFGF的活性;3株单抗均可抑制内皮细胞迁移过程,无抗体组,对照抗体组,MabF7,MabF10,MabF12组细胞迁移率分别为100%,106.25%±7.89%,69.50%±6.86%,74.00%±4.16%,67.75%±3.30%;3株单抗均可抑制内皮细胞成管过程,无抗体组,对照抗体组,MabF7,MabF10,MabF12组管状结构形成率分别为:100%,105.93%±3.85%,56.53%±4.35%,29.23%±6.45%,12.77%±2.67%;计数尿囊膜上加药滤纸周围呈放射状的血管条数,bFGF组,bFGF+MabF7组,bFGF+MabF10组,bFGF+MabF12呈放射状的血管条数分别为15±0.82,7.5±1.29,13.5±3.10,8.5±0.58。结论 bFGF单抗对HUVECs的增殖、迁移、成管以及鸡胚尿囊膜血管新生均有抑制作用,从而为具有抗肿瘤作用的抗体药物的研发奠定基础。     

抗重组人血管生长素单克隆抗体的制备及鉴定

制备不同类型抗重组人血管生长素的单克隆抗体,为进一步研究抗ｒｈＡＮＧ抗体对ＡＮＧ的中和作用以及对ＡＮＧ依赖型肿瘤的抑瘤实验打下基础。方法：利用杂交瘤技术以ｒｈＡＮＧ免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,制备二株,能够稳定分泌抗ｒｈＡＮＧ抗体的杂交,并对上清进行、双扩散,免疫印迹等鉴定。     

Assessment of novel anti-p185HER-2 monoclonal antibodies for internalization-dependent therapies

Novel therapies that require internalization of effector domains may be improved by assessing the efficacy of postbinding receptor-mediated endocytosis. To achieve targeted gene therapy of immunotoxin therapy, natural vector-host tropisms must be altered. Recent improvements in monoclonal antibody (MAb) engineering have expanded the potential range of host cells that can be targeted for therapeutic intervention. However, relatively little is known about cellular responses after binding of a vector construct. We have tested the utility of four novel MAbs recognizing the extracellular domain of p185HER-2, a membrane receptor protein, for use in internalization-dependent therapies. All four antibodies bound to p185HER-2 in a number of immunoassays. Two antibodies recognized accessible epitopes of p185HER-2 on viable cells. Radioimmunoassay demonstrated that antibody-membrane receptor complexes formed by two antibodies were internalized and trafficked through an endolysosomal degradative pathway. Two of the four antibodies evaluated were found to have favorable internalization characteristics suitable for incorporation in a targeting vector. This analytical approach could be applied to antibodies prior to and after fusion with various vectors or toxins to determine the potential utility of the antibodies for targeted therapy.