损伤肝脏条件培养液体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为肝细胞

目的探索损伤肝脏条件培养液体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为肝细胞的可行性及方法。方法培养注射CCl4所致的损伤小鼠肝脏组织块,收集条件培养液,进行MSCs诱导分化。通过形态学观察、RT-PCR、免疫荧光反应和过碘酸Schiff反应鉴定分化细胞。结果诱导组细胞呈肝细胞样变化。RT-PCR检测显示：AFP基因第5天开始表达,第10天表达增强,此后表达减弱；细胞角蛋白18和Alb基因第10天开始表达,持续到第20天；第20天检测到酪氨酸氨基转移酶基因表达。免疫荧光反应显示诱导20 d的细胞AFP、细胞角蛋白18、Alb表达阳性,诱导20 d细胞过碘酸Schiff反应呈阳性。结论MSCs在损伤肝脏条件培养液诱导下可分化为肝细胞。     

生物反应器内EBs来源细胞的肝细胞分化与成熟

目的 观察微重力生物反应器内拟胚体(EBs)来源细胞的肝细胞分化与成熟.方法 将未分化鼠胚胎干细胞(ES细胞)以1×106/mL移入微重力反应器内,在DMSO、地塞米松、FGF4、HGF等刺激作用下,进行15 d的旋转培养.采用ELISA法动态检测培养液中鼠白蛋白的产生量.培养结束时转移EBs于载玻片和培养板,分别检测EBs来源细胞的糖原储存和对靛青绿(ICG)、荧光素标记低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL)的摄取能力.结果 在生物反应器旋转培养的第5、10 d,未从培养液中检出特异的鼠白蛋白,而在第15 d的培养液中检出一定量的鼠白蛋白.与原代培养的成熟肝细胞一样,转种的EBs来源细胞periodic acid-Schiff(PAS)糖原染色阳性,ICG摄取试验阳性,DiI-Ac-LDL摄取试验阳性.未分化的ES细胞均呈阴性.结论 微重力生物反应器不仅能加快EBs的形成与肝细胞分化,而且能促进分化肝细胞的成熟.     

ES细胞的三维培养与肝细胞分化的初步研究

目的 探索用生物材料三维培养胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)并向肝细胞分化的可行性.方法 胰酶消化悬滴法形成5 d的鼠拟胚胎,将1×106/mL鼠ES细胞与细胞外基质MatrigelTM1:1混合接种于聚乳酸(poly-L-lactic acid,PLLA)和聚乙醇酸(polyglycolic acid,PGA)共聚合三维支架内,用DMSO、地塞米松、HGF、FGF4、胰岛素等诱导ES细胞向肝细胞分化,动态观察ES细胞的培育和生长情况,并用RT-PCR、免疫荧光染色检测其肝细胞标志物白蛋白(ALB)和甲胎蛋白(AFP)的表达.结果 立体显微镜见ES细胞及分化细胞在聚合支架材料上呈三维立体状态生长,并保持细胞活力,随培养时间延长不断增殖.RT-PCR检出分化细胞表达ALB mRNA和AFP mRNA,同样免疫荧光染色也证实表达ALB和AFP.结论 ES细胞可在生物材料聚合三维可降解支架及MatrigelTM上生长,并在诱导剂的作用下向肝细胞分化.     

肝脏干细胞与肝脏再生

肝脏损伤与再生是传染病研究领域的重要课题。对肝脏损伤与修复中干细胞作用的研究进展很快,主要归纳为肝脏内源性和外源性干细胞两大部分。本文主要回顾和介绍了参与肝脏修复和再生的主要干细胞,并结合临床的进展,探讨对肝脏干细胞更深入的基础研究和临床应用的可能性。     

人肝脏祖细胞研究进展

2004年美国肝脏病研究协会就正常肝脏结构和疾病状态下肝脏病理变化的命名达成一致意见，认为不再将卵圆细胞或卵圆样细胞用于人肝脏组织，同时也建议不使用干细胞这一术语。干细胞具有多向分化潜能，能自我更新并且通过分化产生多种特定的成熟分化细胞，而在人肝脏中很难证实某个细胞符合这一标准。对于人肝脏中与啮齿类动物卵圆细胞相似的这群细胞建议命名为肝脏祖细胞 （hepatic progenitor cells,HPCs）.     

鼠拟胚体来源细胞向肝细胞及心肌细胞分化的初步观察

目的观察微重力生物反应器内拟胚体（EBs）的形成及其EBs来源细胞的肝细胞与心肌细胞分化。方法将未分化鼠胚胎干细胞（Es细胞）以1×10^6／mL移人微重力反应器内旋转培养，6d后取出反应器内形成的EBs接种于培养板培养，使用含DMSO、地塞米松等IMDM培养液继续培养10d。动态观察EBs形成和EBs来源细胞分化细胞形态特征，采用Western blot、免疫荧光染色方法检测EBs来源细胞肝细胞及心肌细胞标志物的表达。结果生物反应器旋转培养6d形成均一的拟胚体，接种后移行细胞中出现肝细胞特征样细胞和自发性搏动细胞，Western blot检测到EBs来源细胞肝细胞标志物Alb表达，免疫荧光染色分别检测出肝细胞标志物Alb、AFP和心肌细胞标志物GATA4的表达。结论微重力生物反应器可加快EBs的形成。EBs来源细胞可有效地向肝细胞及心肌细胞分化，两种细胞之间可能存在相互作用。     

脂肪间充质干细胞向肝细胞横向分化的研究

目的探讨脂肪源性间充质干细胞（AMSC）向肝细胞横向分化的可能性。方法胶原酶消化脂肪组织,贴壁培养,体外扩增后以流式细胞仪鉴定其表面标志。取扩增3代的AMSC分为2组,诱导分化组在含有2％FBS的DMEM-F12培养基中加入肝细胞生长因子20 ng/ml和成纤维细胞生长因子4 10 ng/ml、1×ITS和地塞米松0．1μmol/L,培养14 d；空白对照组则不加任何细胞因子。RT-PCR检测诱导分化过程中肝细胞核因子1、GATA4等基因转录水平的变化。2周后,采用流式细胞术检测AFP和Alb阳性细胞在两组细胞中的比例,检测肝细胞特异性细胞角蛋白（CK） 18、CK19的表达。结果分离、培养的AMSC呈成纤维细胞样生长,可以稳定传代。流式细胞术检测结果显示第3代脂肪间充质干细胞高表达表面CD29、CD44；不表达CD34、CD45。RT-PCR检测诱导5、8、11、14 d的细胞,显示有肝细胞特异性转录因子GATA4和肝细胞核因子1A基因的表达,并随时间延长而逐渐增多。流式细胞术检测诱导14 d的细胞,发现30．0％的细胞表达Alb,17．8％细胞表达AFP,双阳性的细胞为6．9％；免疫荧光检测发现诱导细胞表达CK18、CK19。空白对照组脂肪间充质干细胞则未见上述各项变化。结论在低血清培养体系中,采用细胞因子联合诱导,显示脂肪间充质细胞在体外能定向分化为肝细胞样细胞。     

肝脏干细胞

干细胞为机体进化过程中高度保守的细胞族 ,在机体细胞再生调控中具有特殊的作用。目前认为以肝内胆管系统源性为主的潜能肝脏干细胞分化群 ,既可向胆管细胞分化 ,又可向肝细胞分化。根据肝脏干细胞起源的不同 ,可将其分为肝源性肝干细胞和非肝源性肝干细胞 ,前者主要来源于分化的肝细胞和胆管上皮细胞 ,后者主要来源于骨髓造血干细胞及胰腺上皮细胞等。不同来源的肝脏干细胞虽然在形态、表面标志、功能及分化等诸方面有所差异 ,但均具有多向性演变的特性。近年来 ,在现代细胞生物学、分子生物学及分子遗传学研究推动下 ,有关肝脏干细胞定位…     

Stem cells for liver tissue repair：Current knowledge and perspectives

Stem cells from extra-or intrahepatic sources have been recently characterized and their usefulness for the generation of hepatocyte-like lineages has been demonstrated. Therefore, they are being increasingly considered for future applications in liver cell therapy. In that field, liver cell transplantation is currently regarded as a possible alternative to whole organ transplantation, while stem cells possess theoretical advantages on hepatocytes as they display higher in vitro culture performances and could be used in autologous transplant procedures. However, the current research on the hepatic fate of stem cells is still facing difficulties to demonstrate the acquisition of a full mature hepatocyte phenotype, both in vitro and in vivo. Furthermore, the lack of obvious demonstration of in vivo hepatocyte-like cell functionality remains associated to low repopulation rates obtained after current transplantation procedures. The present review focuses on the current knowledge of the stem cell potential for liver therapy. We discuss the characteristics of the principal cell candidates and the methods to demonstrate their hepatic potential in vitro and in vivo. We finally address the question of the future clinical applications of stem cells for liver tissue repair and the technical aspects that remain to be investigated.     

人胎肝非实质间充质干细胞体外诱导分化为类肝细胞

目的体外诱导人胎肝非实质间充质干细胞(NPMSCs)分化为类肝细胞,对类肝细胞进行分子生物学及功能鉴定。方法采用体外细胞培养技术,分离培养人胎肝NPMSCs,在1%基质胶作基质,2.5 mmol/L氮胞苷预处理10～12 h,肝细胞生长因子10μg/L加成纤维细胞生长因子4 10μg/L加肝细胞生长培养基中诱导。用显微摄像和四甲基偶氮唑盐研究细胞增殖及生长特征,用流式细胞仪、免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应鉴定细胞表型。采用酶联免疫吸附法检测培养上清液中人Alb水平,过碘酸希夫试验进行糖原染色。结果从人胎肝获得贴壁细胞种植后生长分裂良好,连续传10代后,每份人胎肝NPMSCs可扩增达109个细胞。NPMSCs表型为CD166阳性,CD34阴性。在添加成纤维细胞生长因子4和肝细胞生长因子的基质胶上诱导培养的NPMSCs在21～28 d时,形态由长梭形变为三角形、多角形或类圆形。细胞转圆率为40%,双核细胞比率5%。免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应检测显示未诱导培养的NPMSCs中,有较少的细胞表达甲胎蛋白及其mRNA,未见其他肝脏特有的转录因子或者细胞质蛋白标志。诱导早期可见较多细胞表达GATA4、甲胎蛋白和CK18及其mRNA,至诱导后期表达下降,而Alb、CK18、谷胱甘肽S转移酶-π和肝细胞核因子1α表达逐渐上升。Alb、CK18阳性细胞比例达60%。未诱导分化的NPMSCs不分泌Alb,诱导分化的NPMSCs以时间依赖方式产生Alb。NPMSCs诱导14d时首先见到部分细胞出现红紫色染色的糖原积聚物,28 d后阳性染色细胞数量增多。结论在本实验诱导条件下可获得在复制及翻译各环节肝细胞标志阳性的类肝细胞。诱导后NPMSCs已具备肝细胞特有的功能性特征。     

小鼠胎肝中胎肝激酶-1阳性细胞具有血管祖细胞的功能特性

目的 探讨胎肝中胎肝激酶-1(fetla liver kinase 1,FLK-1)阳性细胞的特征和功能.方法 免疫磁珠分离胎肝FLK-1阳性细胞,流式细胞术(又称荧光活化细胞分类计数,fluorescence activated cell sorter,FACS)检测胎肝FLK-1阳性细胞.体外生长因子诱导培养、测定FLK-1阳性细胞的分化、增殖活性.FLK-1阳性细胞植入75%肝切除的小鼠肝脏模型中,借助荧光解剖显微镜及免疫组织化学方法观察血管形成及细胞分化的情况.结果 FLK-1阳性细胞经生长因子诱导后,可表达典型的血管内皮细胞、平滑肌细胞的标志.75%肝切除的小鼠肝脏模型中,植入的FLK-1阳性细胞在肝脏的纤维囊中分化成血管细胞并形成血管.结论 胎鼠肝脏FLK-1阳性细胞具有血管祖细胞的功能,具有潜在的临床应用价值.     

Kinetics and functional assay of liver repopulation after human cord blood transplantation

BACKGROUND AND AIMS: To evaluate donor cell engraftment and the kinetics of cell repopulation in the injured mouse liver following human umbilical cord blood cell transplantation. METHODS: Nonobese diabetic/severe immunodeficient mice were treated with allyl alcohol to induce liver injury. Twenty-four hours later, umbilical cord blood derived mononuclear cells were transplanted by intra-splenic injection. Mice were sacrificed from 1 to 180 days after transplantation. Temporal changes in the ratio of human cells and fluorescence counts of human sex-determining region Y alleles in mouse liver were determined to evaluate the kinetics of cell repopulation. Mouse liver and sera were examined for the presence of human albumin. RESULTS: Human cell repopulation was extremely rapid in the first week following transplantation, with a doubling time of 1.16-1.39 days apparent. Thereafter cell doubling rate slowed significantly. Cells displaying characteristics of human hepatocytes were still evident at 180 days. Human albumin was detected in mouse liver and sera. CONCLUSION: These findings confirm those from previous studies demonstrating that cells derived from human umbilical cord blood have the capacity to differentiate into cells with human hepatocyte characteristics in mouse liver following injury. Moreover, the detailed information collected regarding the kinetics of human cell repopulation in mouse liver will be of relevance to future studies examining the use of umbilical cord blood cells in liver transplantation therapy.     

Stem Cell Plasticity,Beyond Alchemy

Cell plasticity is a central issue in stem cell biology. Differentiated somatic nuclei have the flexibility to dedifferentiate when transferred into oocytes or when fused to pluripotent embryonic stem cells. Recent publications also claim that somatic stem cells can convert into developmentally unrelated cell types both in vivo and ex vivo without such drastic cell manipulations. Some of these claims are still controversial, making it difficult for us to determine the reality of somatic stem cell plasticity. Indeed, we have heard enough about the “potentials” of cell plasticity; how much do we know about mechanisms? A fundamental issue in current stem cell biology is to understand the mechanisms underlying cell plasticity. In this short review, we overview three research fields related to cell plasticity: nuclear transfer, transdifferentiation, and cell fusion, with an emphasis on studies of molecular mechanisms underlying cell plasticity.     

在心血管领域关于诱导性多能干细胞的研究

诱导性多能干细胞（iPSCs）是人类和动物的体细胞通过转导特定转录因子重编程序而获得与胚胎干细胞（ESC）相似的多潜能干细胞。iPSCs细胞具有无限增殖,自我更新,多向分化的特点。本文主要总结iPSCs在心血管领域的研究现状,应用价值及前景,以及iPSCs现阶段应用的缺陷。     

生物型人工肝的新种子细胞来源-诱导性多潜能干细胞

生物型人工肝在严重广泛肝细胞功能受损特别是急性肝衰竭的临床应用方面获得了一致认可,而肝细胞的获取是生物型人工肝的根本所在,无论是何种来源的肝细胞,获取后其功能正常高效发挥是所有工作的导向。因此,获取良好状态的人工肝种子细胞是一切工作的前提。由于分化、培养和增殖等方面的限制,获取人工肝种子细胞的常规途径并不能满足临床对种子细胞的需求。2006年日本学者通过重编程体细胞成功诱导成具有多分化潜能的iPS细胞,这为生物型人工肝在获取安全有效种子细胞来源方面带来了新的曙光,本文主要论述iPS细胞的来源、分化及其特性,以及将其应用于临床特别是生物型人工肝所面临的主要问题,并对其前景进行探讨。     

干细胞、肿瘤干细胞与肿瘤发生

肿瘤干细胞是肿瘤研究的一个新热点,指出肿瘤可能是由肿瘤干细胞产生,肿瘤干细胞则由正常干细胞恶变形成.正常干细胞的特有性状,使其较成体细胞更易成为肿瘤发生的靶细胞.干细胞可能经基因突变、异常不对称分裂和细胞融合转化为肿瘤干细胞.利用不同的蛋白标志物或荧光探针,通过流式细胞仪分选是发现肿瘤干细胞的主要方法.已证实的肿瘤干细胞皆具有强大的自我更新和增殖能力,以及细胞分化潜能.针对肿瘤干细胞的检测和杀伤,可能为肿瘤早期诊断和治疗带来希望.