结核分支杆菌耐乙胺丁醇分离株embB基因测序

目的 探讨结核分支杆菌对乙胺丁醇(EMB)产生耐药性的分子机制，建立直接快速检测结核分支杆菌EMB药物敏感性的实验方法。方法 采用PCR扩增技术对5株耐乙胺丁醇结核分支杆菌进行PCR扩增，扩增产物经纯化后，直接在ABI 377型全自动测序仪上进行DNA测序分析。结果 5株EMB耐药株的embB基因测序有4株发现点突变，其中Met(ATG)→Lle(ATA)1例，Met(ATG)→Lle(ATC)1例，Met(ATC)→Lle(ATT)1例，Met(ATG)→Val(GTG)1例，另外1株EMB耐药株的embB基因测序未发现突变位点。结论 embB 306位氨基酸Met被置换是结核分支杆菌对乙胺丁醇产生耐药性的重要机制，测序分析可确认耐药基因的突变位点，是快速检测耐乙胺丁醇结核菌的有效方法。     

结核分支杆菌rpoB基因突变与耐利福平的临床应用

目的：研究结核分支杆菌耐利福平（RFP）分离株rpoB基因突变情况并评价其应用价值。方法：采用聚合酶链反应一单链构象多态性（PCR—SSCP）方法对355株结核分支杆菌临床分离株（其中敏感株109株，耐RFP或含耐RFP株246株）rpoB基因进行检测，并对其中17株耐药株用双氧末端终止法进行测序分析。结果：以结核分支杆菌H37RV为对照，109株药物敏感株的rpoB基因均无突变，特异性100％；246株耐药株中，225株rpoB基因SSCP图谱异常，其敏感性91．5％。17株耐药株（其中SSCP异常11株，正常6株）PCR扩增产物经测序证实，11株在531位密码子TCG-TTG，4株在526位密码子CAC-TAC，1株在516位密码子GAC—GTC，1株未改变。结论：rpoB基因突变是耐RFP结核分支杆菌耐药性的主要分子机制；其最常见的突变位点是531位色氨酸和526位组氨酸，应用PCR—SSCP技术可快速检测结核分支杆菌对RFP的耐药性。     

应用单链探针反向杂交试验检测结核分枝杆菌耐药性分析

目的探讨单链探针反向杂交试验检测结核分枝杆菌耐药性,评价此方法在耐药性检测中的临床应用价值。方法采用聚合酶链反应-单链探针反向杂交试验技术,PCR扩增50株结核分枝杆菌rpoB、katG、rpsL、rrs、embB耐药基因,将标记生物素的基因扩增产物与固定在硝酸纤维膜上的核酸探针杂交,通过链亲和素碱性磷酸酶,BICP/NBT显色系统检测分析基因突变,同时与传统药物敏感实验比对分析。结果 PCR-LiPA方法分析50株结核分枝杆菌临床分离株,耐RFP菌株中检出4株,耐INH菌株中检出5株,耐SM菌株中检出7株,SM敏感株检出1株,50株rrs基因均未检测到相应位点的突变;耐EMB菌株1株、EMB敏感株1株检测到embB基因突变。结论应用PCR-LiPA可快速、简便地检出部分结核分枝杆菌耐药株,可作为临床辅助诊断手段。     

结核分支杆菌耐喹诺酮分子机制的研究

目的了解结核分支杆菌耐喹诺酮药物的分子机制，建立快速的药敏的方法。方法通过16S rRNA聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR—SSCP)技术分析77株分支杆菌临床分离株；通过PCR—SSCP和直接测序技术(PCR—DS)分析结核分支杆菌的gyrA基因突变的情况。结果75株为结核分支杆菌复合群。以结核分支杆菌标准菌株H37Rv和卡介苗为对照．30株喹诺酮敏感株的gyrA基因的SSCP图谱均泳动正常，测序分析与对照株相同。45株耐喹诺酮的菌株中，34株(75．6％)gyrA基因SSCP图谱泳动异常；测序证实10株为90位密码子的突变，24株为94位密码子突变，所有gyrA突变株的氧氟沙星4μg／ml≤MICs≤32vg／ml，左氧氟沙星2μg／ml≤MICs≤16vg／ml。结论gyrA基因突变，尤其90位和94位密码子突变是结核分支杆菌耐喹诺酮的主要分子机制，PCR—SSCP可能成为测定部分结核分支杆菌喹诺酮耐药基因型的简便、快速的方法，并有望直接用于临床标本喹诺酮敏感性试验。     

结核病临床分离株及痰标本中embB基因型的快速测定

目的建立快速测定结核病耐乙胺丁醇(EMB)分离株和痰标本中结核分枝杆菌EMB耐药基因型的方法，以期为患者提供及时、有效地化验结果。方法应用16S rDNA聚合酶链反应(PCR)-单链构象多态性(SSCP)和PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)对11株耐EMB分离株和46例结核病痰标本进行分子菌种鉴定和embB基因突变的部位与性质分析。结果以结核分枝杆菌H37Rv标准株为对照，11株耐EMB分离株和46例临床痰标本经16S rDNA PCR-SSCP分析电泳图谱均与结核分枝杆菌标准株相同；限制性内切酶NlaⅢ消化embB基因扩增产物显示，11株耐EMB分离株中4株(36．4％)不被NlaⅡ消化；46例结核病痰标本中10例(21．7％)不被NlaⅡ消化。结论部分结核分枝杆菌耐EMB是由于embB基因突变所致。采用PCR-SSCP和PCR-RFLP方法可直接快速测定结核病耐EMB分离株和痰标本中结核分枝杆菌耐EMB基因型。     

耐多药结核分支杆菌临床分离株吡嗪酰胺耐药基因pncA的检测

本文对95株耐多药结核分支杆菌（MTB）临床分离株应用BACTEC--460培养系统进行结核分支杆菌常规培养和药敏检测，聚合酶链反应-单链构象多态性技术（PCR—SS—CP）检测其pncA基因，旨在了解耐多药结核分支杆菌PZA耐药基因pncA的突变情况，探讨其与耐吡嗪酰胺（PZA）之间的关系。从而探讨建立新的、快速、有效的结核分支杆菌药敏检测方法，以弥补常规药敏试验的不足。     

结核分支杆菌耐药基因检测结果分析

目的 分析肺结核患者结核分支杆菌获得性耐药情况,比较两种耐药性检测方法的检测效果.方法 用药敏试验(绝对浓度法)检测结核分支杆菌株对利福平(RFP)、异烟肼(INH)、链霉素(SM)、吡嗪酰胺(PZA)和乙胺丁醇(EMB)的耐药情况,采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测结核分支杆菌耐药rpoB、katG、rpsL、pncA和embB基因突变.结果:400例肺结核耐药患者常规药敏试验耐药316例(79.8%);耐药基因检测耐药株288株,突变率72.0%.RFP耐药例数和耐药率明显高于SM、PZA和EMB(耐药例数:F=2.45,2.56,2.69,P＜0.05;耐药率:F=2.55,2.66,2.79,P＜0.05),rpoB突变株和突变率明显高于katG、rpsL、pncA和embB(突变株:F=2.28,2.46,3.19,3.33,P＜0.05～0.01;突变率:F=2.36,2.61,3.25,3.45,P＜0.05～0.01),高浓度药物耐药菌株的突变株和突变率显著高于低浓度药物耐药菌株,随着不规律用药时间的延长,耐药率和突变率均逐渐上升(耐药率:F=2.77,2.88,P＜0.05;突变率:F=2.72,2.85,P＜0.05).结论 PCR-SSCP是一种快速检测结核杆菌rpoB、katG、rpsL、pncA和embB基因突变敏感、特异的方法.     

单管半套式PCR-SSCP用于结核分支杆菌rpoB基因突变的研究

目的 ①证明单管半套式聚合酶链反应(PCR)是检测结核分支杆菌的特异性方法;②研究结核分支杆菌rpoB基因突变与利福平耐药性的关系。方法 设计三条针对结核分支杆菌的特异性引物,采用单管半套式PCR-单链构象多态性(SSCP)方法对结核分支杆菌、其它分支杆菌和富含GC碱基的细菌进行分析。结果 ①结核分支杆菌标准菌株H_(37)Rv和55株临床分离株均扩增出一条193bp片段,其特异性为100％,敏感性约为10pgDNA;15株非结核分支杆菌和8株富含GC的细菌均未得到扩增;②55株结核分支杆菌临床分离株193bp扩增片段SSCP图谱特点:以H_(37)Rv为对照,15株利福平敏感株均无区别;40株耐药株除6株外其余34株SSCP图谱有明显区别,检测阳性率为85％。结论 单管半套式PCR检测结核分支杆菌简便、敏感、特异,结合SSCP可检出耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变,此突变与利福平耐药关系密切。     

用DNA芯片检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇基因突变的研究

目的利用DNA芯片快速检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇embB基因突变。方法根据结核分枝杆菌embB基因序列设计探针并制作DNA芯片。根据结核从分枝杆菌embB基因突变的热点片段设计引物，该片段用TAMRA荧光标记PCR扩增增后与DNA芯片杂交，同时以PCR-SSCP和DNA测序法为对照。结果120株结核分枝杆菌临床分离株中，35株敏感株DNA芯片杂交结果与标准株完全相同；85株耐乙胺丁醇临床分离株中有50株检测到embB基因突变[58．8％（50／85）]，均为306位密码子突变，该突变与PCR．SSCP和测序结果完全一致；85株耐药株中后有35株未检测到突变，占41．2％（35／85）。结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分离株的embB基因突变，可协助临床医生制定合理的治疗方案，特别是复治患者，可帮助选择有效药物。     

细胞壁缺陷结核分枝杆菌耐药性的基因研究

目的检测与分析细胞壁缺陷结核分枝杆菌的耐药性相关基因，探讨细胞壁缺陷结核分枝杆菌耐药性的基因基础。方法分别分离16株自发形成和用利福平、异烟肼、乙胺丁醇诱导形成的结核分枝杆菌的染色体DNA，PCR扩增IS986序列以及rpoB、katG和embB基因后进行凝胶电泳和序列分析。结果自发形成及抗结核药物诱导形成的结核分枝杆菌稳定L型可在含利福平（4μg／ml）、异烟肼（0．2μg／ml）、乙胺丁醇（7．5μg／ml）的培养基内生长与传代培养。基因检测与分析显示，结核分枝杆菌稳定L型仍然保留IS986基因，rpoB、katG、embB基因也未见突变。结论结核分枝杆菌稳定L型可自发形成，也可被利福平、异烟肼和乙胺丁醇诱导形成。结核分枝杆菌稳定L型对利福平、异烟肼、乙胺丁醇形成耐药性，但其染色体上耐药相关基因并没有发生突变。除染色体耐药相关基因突变可造成结核分枝杆菌形成耐药性外，细胞壁缺陷也是造成结核分枝杆菌形成耐药性的一个重要机制。     

应用PCR—直接测序法测定结核分支杆菌rpsL基因突变的研究

目的：了解我国结核分支杆菌耐链霉素（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ,ＳＭ）分离株ｒｐｓＬ基因突变情况,建立快速检测结核分支杆菌耐药基因型的分子药敏试验方法。方法：通过聚合酶链反应（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ,ＰＣＲ）－单链构象多态性（Ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ,ＳＳＣＰ）、ＰＣＲ－限制性片段长度多态性（ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ,ＲＦＬＰ）和ＰＣＲ－直接测序法（ＤｉｒｅｃｔＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ,ＤＳ）分析３８株结核分支杆菌耐ＳＭ分离株的ｒｐｓＬ基因。结果３８株耐ＳＭ分离株中,２５株ＳＳＣＰ异常、不被ＭｂｏⅡ消化、ＤＳ分析４３位密码子ＡＡＧ→ＡＧＧ突变;１株ＳＳＣＰ异常、可被ＭｂｏⅡ消化、ＤＳ分析３３位密码子ＧＴＡ→ＡＴＡ突变;１２株ＳＳＣＰ正常、可被ＭｂｏⅡ消化、ＤＳ分析未见异常;未发现８８位密码子突变。结论：大多数结核分支杆菌耐ＳＭ是由于其ｒｐｓＬ基因４３位密码子突变所致,采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ和ＰＣＲ－ＤＳ方法可快速测定部分结核分支杆菌ＳＭ耐药基因型。     

耐多药结核分枝杆菌三种基因的快速检测

目的 :探讨耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变与耐药性的关系。方法 :采用 PCR和 PCR- DS技术对 5 7例耐多药结核临床分离株进行 kat G、rpo B和 emb B基因检测和序列分析。结果 :耐 INH(kat G)、RFP(rpo B)、EMB(emb B)基因突变率分别为 6 3.8%、90 .7%、37.1% ,其中同时耐 INH(kat G)和 RFP(rpo B)基因突变率为 5 4 .1% ,同时耐三种药的基因突变率为 6 5 .6 %。结论 :PCR- DS法对耐两种或两种以上药物的结核检出率较高 ,与传统药敏试验互相弥补 ,对临床用药有指导意义。     

用分子生物学技术快速检测耐多药结核分枝杆菌

目的：用PCR—SSCP技术检测耐INH、RFP、SM结核分枝杆菌分离株KatG、rpoB、rpsL基因突变，评价其在快速检测结核分枝杆菌耐药性方面的临床价值。方法：以结核分枝杆菌H；vRv为对照，20株耐多药菌株和20株敏感株，分别用PCR—SSCP方法检测KatG、rpoB、rpsL基因突变，并将SSCP结果与药敏试验结果作对照分析。结果：PCR—SSCP方法检测20株敏感株SSCP带语均与H37RV标准株相同，而20株耐多药结核分枝杆菌KatG、rpoB、rpsL基因突变的阳性率分别为70％，100％和75％。发现20株耐多药菌株中有11株(55％)共INH、RFP、SM3种耐药遗传标志均发生突变，7株(35％)有2种耐药遗传标志突变，2株(10％)只有RFP耐药标志突变。结论：PCR—SSCP方法敏感、特异，可快速检测结核分枝杆菌KatG、rpoB、rpsL耐药基因突变，有利于耐多药结核分枝杆菌耐药性的快速检测。     

The 500-base-pair fragment of the putative gene RvD1-Rv2031c is also present in the genome of Mycobacterium tuberculosis

BACKGROUND: It has been proposed that differentiation between M. bovis and M. tuberculosis is possible by using a PCR assay for the 500bp fragment present only in the M. bovis genome. MATERIALS AND METHODS: Forty clinical samples and 16 clinical isolates from the Department of Microbiology, as well as 4 clinical isolates obtained from another laboratory, were tested for the purpose of this study. As controls we tested 2 M. bovis (M. bovis BCG Pasteur TMC1011 and M. bovis BCG Copenhagen), 1 H37Rv M. tuberculosis strain, 2 M. avium (ATCC15765 and ATCC1975, respectively) and 1 M. paratuberculosis (ATCC19698) strains. RESULTS: None of the mtp40- negative clinical isolates amplified the 500bp fragment, whereas 4 out of 17 mtp40-positive clinical isolates scored positive for the 500bp fragment. All clinical isolates scored positive for IS6110, mtp40, the pncA and oxyR PCR's. All but one of the clinical isolates amplified the 500bp fragment. Sequence analysis of the pncA and oxyR PCR products revealed the presence of nucleotide C at position 169 and G at position 285 respectively, suggesting M. tuberculosis as the causative agent. CONCLUSION: Our data suggest that the 500bp PCR fragment is present not only in M. bovis but also in M. tuberculosis.     

结核分枝杆菌katG和inhA基因突变的研究

为了解结核分枝杆菌耐异烟肼（ＩＮＨ）分离株ｋａｔＧ基因和ｉｎｈＡ调节序列的突变情况，探讨其在ＩＮＨ耐药性中的可能作用。应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和ＰＣＲ－单链构象多态性（ＳＳＣＰ）方法对６２株结核分枝杆菌临床分离株的ｋａｔＧ基因和ｉｎｈＡ调节序列进行分析。ＰＣＲ分析结果显示：ｋａｔＧ基因和ｉｎｈＡ调节序列的敏感性为１～１０ｐｇＤＮＡ；其引物ＰＣＲ扩增都具有较高的特异性。以Ｈ３７Ｒｖ标准株为对照，１３株敏感株中，１２株ｋａｔＧ基因扩增产物ＳＳＣＰ泳动正常，１株ｋａｔＧ异常；２４株耐非ＩＮＨ抗结核药物株中，８株ｋａｔＧＳＳＣＰ异常；上述２７株的ｉｎｈＡ调节序列ＳＳＣＰ均泳动正常。２５株耐ＩＮＨ株中，３株ｋａｔＧ基因ＰＣＲ扩增阴性，２２株ｋａｔＧ扩增阳性，其中１６株ＳＳＣＰ泳动异常；４株ｉｎｈＡ调节序列ＳＳＣＰ泳动异常，其ｋａｔＧ基因ＳＳＣＰ也异常。结果表明，某些结核分枝杆菌ＩＮＨ耐药性可能是由于其ｋａｔＧ基因完全缺失、ｋａｔＧ基因或ｉｎｈＡ调节序列突变所致，但某些菌株也可能与其无关，是其它耐药基因所致或存在多种机制，尚需进一步探讨。     

耐氟喹诺酮类铜绿假单胞菌gyrA及parC基因突变研究

目的　研究临床分离的耐氟喹诺酮类铜绿假单胞菌gyrA及parC基因突变情况。方法　测定临床分离的 5 5株铜绿假单胞菌MIC值 ,从中筛选出 1株敏感菌和 8株耐药菌 ,以标准敏感菌株ATCC2 785 3作为质控菌株。用聚合酶链反应 (PCR)扩增gyrA及parC基因的喹诺酮耐药决定区 (QR DR) ,扩增产物片段长度分别为 35 1bp、397bp。用限制性内切酶SacⅡ消化gyrAPCR产物 ,同时对上述 10株菌的gyrA及parC基因的喹诺酮决定区 (QRDR)进行PCR DNA直接测序分析。结果　有 8株耐菌株的gyrA基因在 83位 (ACC→ATC)有突变 ,导致氨基酸Thr→Ile的改变 ;有 3株高度耐药菌gyrA基因同时在 87位 (GAC→GGC)有突变 ,导致氨基酸Asp→Gly的改变 ;有 4株耐药菌株的parC基因在 87位有TCG→TTG突变 ,导致氨基酸由Ser→Leu的改变。同时具gy rA和parC突变MIC值是仅具gyrA突变菌株MIC值的 2～ 16倍。未发现parC突变单独存在。另外 ,有 6株耐药菌gyrA的 132位有CAC→CAT的突变 ;所有耐药菌株parC基因 115位有GCT→GCG的突变 ,该突变未引起氨基酸的改变。结论　gyrA83、87位突变及parC基因 87位突变都可引起铜绿假单胞菌对氟喹诺酮类药物产生耐药 ,但以gyrA基因 83位突变为主 ,合并gyrA基因 87位及parC基因 87位突变可增加耐药程度。     

The vitro efficacy of beta-lactam and beta-lactamase inhibitors against multidrug resistant clinical strains of Mycobacterium tuberculosis

In vitro activity of beta-lactam antibiotics and their beta-lactamase inhibitor combinations were evaluated for their activity against clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis and M. tuberculosis H37Ra. Agar dilution, the BACTEC 460 system and beta-lactamase activity tests were used. Results using the BACTEC 460 and enzyme activity tests showed the best beta-lactamase inhibitor for M. tuberculosis H37Ra to be clavulanic acid. Cefazolin-clavulanic acid gave the lowest minimal inhibitory concentration (MIC) values using dilution tests and M. tuberculosis H37Ra. beta-Lactam antibiotics were combined with clavulanic acid and tested for in vitro activity against 50 selected multidrug-resistant (MDR) and 50 susceptible clinical isolates. Seventy-four percent of the isolates were inhibited by cefazolin-clavulanic acid combination. These results suggested that an appropriate combination of beta-lactam and beta-lactamase inhibitors might be useful in the treatment of tuberculosis due to multidrug-resistant strains.