预防PCR检测中的污染初探

作为一种新的检测技术，PCR具有其它传统方法无与伦比的优点：灵敏度高、特异性强、操作简便等。也存在着严重的不足，极微量的污染即可导致假阳性结果。因此，PCR污染问题已引起人们极大的关注，如何防止PCR污染已成为整个实验成功的关键，现就我院PCR实验室二年来采取的预防污染办法介绍如下：PCR检测过程中的污染来源有三：一是标本间的交叉污染；二是实验室中克隆质粒的污染；三是扩增产物的污染，其中以第三种为最主要，因此冠以“残留污染”（Carryover）。PCR污染可能来自标本处理过程中所伴随的阳性质粒，通过空气和气溶胶…     

PCR试验污染原因分析与对策

PCR反应具有较大扩增能力与极高的灵敏性等优点,在操作过程中,极其微量的污染即可造成假阳性结果的产生。1污染原因1.1标本间交叉污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染。1.2PCR试剂的污染在PCR试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。1.3PCR扩增产物污染这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。…     

实时荧光定量聚合酶链反应技术开始用于临床常规基因诊断

聚合酶链反应（PCR）技术问世20年来，已经成为致病基因分析的重要手段。但是，多年来PCR一直很难直接用于临床疾病的常规诊断，其原因主要是PCR常规实验中存在的污染问题难以解决。常规PCR是将样品和实验反应剂加入小试管进行基因扩增，PCR后汲取反应产物行琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳．用PCR产物是否出现特异性条带来判断样本中有无疾病中发生变异的基因片段。     

PCR实验室的污染及控制措施

目的分析PCR实验室污染途径。方法针对PCR实验室不同的污染途径采取不同的控制措施。结果通过一系列控制措施,达到了有效预防和控制污染的发生。结论 PCR实验由于具有高灵敏度,容易产生污染,必须针对不同污染途径采取不同控制措施,以避免污染产生的风险。     

清除聚合酶链反应扩增产物污染的方法探讨

聚合酶链反应(PCR)具有操作简便、灵敏度高和特异性强等优点。但也常因标本受PCR扩增产物污染而产生假阳性结果。因此，控制外源性DNA污染已成为各实验室非常关注的问题。近年来，人们采用了许多方法消毒处理不同的污染环境和污染物，但结果报导不一。为选择一种消除实验室DNA污染的最佳方法，我们选用六种传统的消毒法进行对比研究。现将结果报告如下。     

dUTP/UDG反应体系在荧光定量PCR中抗污染能力评价

目的 探讨dUTP／UDG反应体系在荧光定量PCR中抗PCR产物污染的能力。方法 用TaqMan荧光定量PCR检测方法进行定量检测。将一系列不同浓度的含dUTP的HBV—DNA PCR扩增产物作为污染源，分别加至含dUTP／UDG的PCR反应体系和普通荧光定量PCR反应体系中，在荧光定量PCR仪上进行定量检测，从而得出含dUTP／UDG的PCR反应体系的抗污染能力。结果 1．最佳抗污染实验条件：UDG酶含量0．05U，消化时间37℃5min，灭活时间92℃1min；dUTPl00％代替dITP，四种底物浓度相等。2．含0．05U的UDG抗污染反应体系对每管浓度为10^3拷贝／ml的污染物可完全消化，并随UDG含量的增高及消化时间的延长，抗污染能力增强。结论 dUTP／UDG反应体系的应用能有效防止PCR产物污染，但抗污染能力是有一定限度的，尚需加强实验室标准化管理，才能真正达到抗污染效果。     

实时荧光PCR实验过程污染的监测与防范

正实时荧光PCR 技术是一种实时监测PCR扩增产物,通过CT值和标准曲线的关系对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。其优点是扩增量大、特异性强、灵敏度高、精确定量,但易污染,一直是困扰各实验室的大问题,极微量的污染就可能造成假阳性反应,导致实验结果失败。为了保证实验过程稳定、结果可靠,验证整个操作流程中是否存在污染的可能,必须进行污染的监测。通过有效地监测,采取正确的应对措施,防止或消除污染。1 对照实验是监测PCR污染的重     

应用PBL教学法实例讲解如何发现引物污染

目的 验证以问题为基础(PBL)教学法在提高学生处理聚合酶链反应(PCR)污染能力方面的作用。方法 以PCR假阳性为实例,采用PBL教学法引导学员合理设立空白对照,通过重复试验探究污染来源。结果 学员在思维引导帮助下逐步发现PCR污染来源于引物污染,并对试验方法及理论有了清晰的认识。结论 以实例讲解为基础的PBL教学法可有效提高学生认识和处理PCR污染的能力。     

真菌PCR中的污染问题

近年来从临床标本中扩增真菌DNA的技术已经成功地建立。有五个欧州的研究机构,联合对真菌PCR中由气溶胶和试剂携带污染的危险性和频度作了分析。发现在150次PCR实验中有12次,共2800价标本被真菌污染（3．3％的阴性对照在提取DNA时被污染;4．7％在PCR扩增过程中被污染）,其污染的真菌种类有：烟曲霉菌、酿酒酵母菌以及支顶孢属菌。进一步分析表明,像酵解酶粉或10倍浓缩的缓衡液等市售产品中,可能也含有真菌DNA。总之,如果注意操作,真菌PCR中的污染危险性并不会比其他PCR诊断更高的。真菌PCR中的污染问题…     

聚合酶链反应中污染环节的分析

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术,该技术通过重复94℃～95℃变性、37℃～55℃复性、72℃延伸等简单的3个温度,能将靶DNA扩增数百万倍,获得极高的检测敏感性,操作者稍不注意就会造成污染,极微量的污染便可导致假阳性结果,现分别对污染和如何判断污染及污染源的追踪等3个部分进行阐述。1污染为了使读者重视操作堆积化及其重要性,我们将PCR整体绘制成PCR污染示意图,并分别叙述各区的相互关系,图中分为4个区,即污染1区、清洁区、污染2区、交叉污染区等。见图1。     

一管巢式聚合酶链反应用于禽流感病毒核酸检测

禽流感病毒(AIV)不仅对禽类有较高的易感性，现对人也有感染性。快速诊断是对AI的防治的首要步骤。巢式聚合酶链反应(PCR)检测方法比鸡胚分离法方法快速、敏感。本研究对巢式PCR技术进行优化，较好地解决了操作中相对繁琐和易引起交叉污染的问题。     

PCR试验污染原因分析与对策

PCR反应具有较大扩增能力与极高的灵敏性的特点,但令人头痛的问题是易污染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生。1污染原因1.1标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污     

实时荧光PCR技术的研究及其应用进展

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是一敏感特异的检测核酸分子的定性方法,在疾病的基因诊断中起重要作用,但传统的PCR技术在临床应用中遇到些难以克服的问题,如PCR后处理需手工操作、难以实现定量、PCR产物的污染等。近年,实时PCR(real-time PCR)技术实现了PCR从定     

PCR技术中避免污染的措施

PCR的问世为临床诊断提供了一项行之有效的方法,其灵敏度和特异性是其它生化、酶免、放免方法无法比拟的,正是由于这些特征,其技术要求有很高的严密性,污染将会是该技术的一项敌害。本文介绍近年来对PCR技术污染采取的措施,并着重介绍方法学的改进,一种新的方法—DIAPOPS法,大大减少了污染。     

Wipe Test在HLA组织配型实验室污染监测及预防管理中的应用

目的建立人类白细胞抗原(HLA)组织配型实验室常规DNA污染监测试验体系,预防和消除可能会干扰检测准确性的PCR产物或基因组DNA的污染。方法设计含多种阴阳性对照和各关键监测点的完整反应链,针对HLA-Ⅰ类和Ⅱ类基因扩增区域内的非多态区进行引物特异性PCR,琼脂糖凝胶电泳测定扩增产物;对被污染监测点进行局部灭活处理后对相应监测点重新采样进行灭活验证;同时采取不定期抽查监测与定期全面监测相结合的方式确保实验过程零污染。结果灭活处理及整改后,所监测HLA基因分型实验过程中的核酸抽提区、PCR加样区、PCR扩增区、下游产物处理区4个区域的主要监测点污染监测结果均合格。结论该研究建立的以Wipe Test为核心的DNA防污染监测实验体系能够有效监测和灭活验证可能会干扰检测准确性的PCR产物或基因组DNA的污染,是HLA组织配型实验室质量控制管理程序的重要组成部分。     

医院供水系统中军团菌污染状况调查

目的对我院各病区供水系统（水嘴）进行军团菌的分离培养，了解供水受军团菌的污染状况。方法1．对我院27个病房的共52个水嘴进行采样，分离培养军团菌。2．分别用军团菌属特异性引物5srRNA和嗜肺军团菌感染力增强因子基因（mip）对分离培养出的菌株进行PCR方法鉴定。结果1．在所调查的27个病房中有9个存在军团菌污染，污染率为33．3％。在所采集的52份标本中共有12份检出军团菌，阳性率为23．1％。2．经PCR鉴定，这12株细菌为非嗜肺军团菌。结论医院病房的供水系统军团菌污染严重，有发生医院感染的潜在危险，应引起相关部门的重视。     

PCR试验加样过程中无DNA原则控制污染的探讨

目的　探究在PCR操作过程中如何预防污染的一些基本操作方法。方法　首先制定了PCR操作过程中的无DNA原则 ,对实验室的划分 ,操作总原则 ,Eppendorf管开、关 ,有螺旋的离心管开、关 ,装有反应体系Eppendorf管的放置 ,标记反应管的操作 ,移液器的使用方法等进行规范化 ,最大限度地避免DNA污染反应体系。然后通过扩增新鲜扁桃体组织中珠蛋白基因及模拟手套被质粒污染的情况下扩增质粒基因 ,验证该无DNA操作过程对避免污染的有效性。结果　按本实验的规范方法进行操作 ,所有阴性对照均未出现假阳性。结论　采用这种无DNA原则进行PCR操作 ,是控制反应体系污染的一种有效方法。     

聚合酶链反应的质量控制

聚合酶链反应（PCR）用于临床病原微生物检测的质量控制包括室内质量控制和室间质量评价，室内质控的核心问题就是要避免交叉污染，这首先要求有严格的实验室管理和训练有素的操作人员，此外设立阴、阳性对照以及PCR结果的准确判读都是有效的必不可少的室内质控措施。室间质量评价国外只是近几年才开始的一项工作，本文亦对其作了简略的介绍。     

实时荧光定量PCR的研究进展及其应用

多聚酶链反应飞速的发展使其成为了分子生物学实验室重要的工具，实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR）以其敏感性高、重复性好、速度快和污染少使PCR技术又向前迈进了一步。本文对real-time Q-PCR技术的原理、五种主要的荧光化学及定量方法作一介绍，同时也讨论了此技术存在的不足，并对其目前在研究领域中主要的应用进行了概述。     

聚合酶链反应检测HBV—DNA技术的改进与应用

目的：建立一种特异、敏感、简便、快速的方法检测血清中的HBV-DNA。方法：采用以强烈蛋白变性剂异硫氰酸胍为主的裂解液与加热变性相结合的方法快速制备血清中HBV-DNA模板，直接进行聚合酶链反应（PCR），并用Southern Blot对PCR的产物刊物特异性分析。结果：对不同含量HBV-DNA的阳性血清测试结果表明本法检测水平达到10^5拷贝/ml，其敏感性与蛋白酶K消化法PCR相当，但较NP40变性法PCR及斑点法高。结论：本法操作简单，不易污染，具有较高的特异性及敏感性，值得临床推广应用。