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1.
丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆及其高效表达 总被引:5,自引:2,他引:3
目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因片段。方法利用PCR技术,扩增出357bp的HCV核心蛋白基因片段,双酶切后将其插入到原核表达载体pET-32a,构建重组表达质粒pET-32a/HCVc。转化到大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达。SDS-PAGE鉴定表达情况,Western blot鉴定表达产物的抗原性。结果 经IPTG诱导后获得了目的蛋白的融合表达;SDS—PAGE电泳显示其在32000处有一条融和表达条带;Western blot结果显示其具有HCV抗原特异性。结论 HCV核心蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,而且表达产物有良好的抗原性。 相似文献
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HCV非结构蛋白3反式激活基因6转染肝癌细胞的基因表达谱芯片分析 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:为了研究NS3TP6可能的分子生物学功能,我们应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3 (NS3)反式激活基因NS3TP6的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响. 方法:以分子生物学技术构建NS3TP6的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS3TP6,以表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3TP6转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA. 应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析. 结果:HepG2细胞经转染NS3TP6后,有7条基因表达增强,38条基因表达降低. 结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了NS3TP6的反式调节基因,为进一步阐明NS3TP6的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据. 相似文献
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面对丙型肝炎的流行,至今缺少理想的治疗药物和方案,丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白3(NS3)蛋白酶是近年来抗丙型肝炎药物研究的重要靶点。作者综述了NS3蛋白酶抑制剂的作用机制和活性特点。 相似文献
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目的了解丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对肝细胞内p5 3表达的影响 ,探讨其在肝癌发生中的作用 ,及其发生机制。方法使用脂质体介导法 ,转染丙型肝炎病毒非结构蛋白重组质粒PCXN2 NS4B及突变型p5 3基因重组质粒P5 3 CX2 2AN3进入Chang肝细胞内 ,并用G4 18筛选获得稳定表达细胞 ,分别采用细胞化学法检测p5 3表达率。设置空白对照组、空白载体组、转染NS4B组 ,转染p5 3组、共转染NS4B及p5 3组。结果空白对照组无p5 3表达 ,空白载体组及转染NS4B组呈弱阳性表达 ,转染p5 3组及共转染组呈阳性表达 ,与空白对照组、空白载体组及转染NS4B组比较有显著差异 ,P <0 .0 1。结论NS4B可能抑制突变型p5 3表达 ,也可能阻止其进入细胞核。 相似文献
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目的:筛选表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV) 1b型非结构蛋白4B(nonstructural protein 4B,NS4B)的慢病毒稳定细胞株L02-NS4B差异表达基因和基因通路,为深入研究HCV NS4B在慢性丙型肝炎和肝细胞癌发生中的作用及机制提供依据.方法:将已构建好的2株慢病毒稳定细胞株LO2-NS4B和阴性对照慢病毒稳定细胞株LO2-mkate2复苏扩增;应用Human Gene 1.0ST芯片筛选出LO2-NS4B与LO2-mkate2差异表达基因.基于京都基因和基因组百科全书(kyotoencyclopedia of genes and genomes,KEGG)数据库,利用Fisher精确检验和卡方检验,对差异基因参与的信号转导通路进行显著性分析.应用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,real-time QPCR)方法验证基因芯片中5个表达上调且与凋亡有关的基因,即蛋白激酶Cδ结合蛋白(protein kinaseC delta binding protein,PRKCDBP)基因、肿瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)基因、v-akt鼠科胸腺瘤病毒癌基因同源物Ⅰ(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1,AKT1)基因、含3个杆状病毒凋亡蛋白抑制因子重复序列(baculoviral IAP repeat containing 3,BIRC3)基因和B细胞淋巴瘤2样1基因(B-cell lymphoma 2-like1,BCL2L1)的mRNA水平.结果:以LO2-NS4B与LO2-rnkate2之间基因荧光强度的比值大于1.2或小于0.8为差异表达基因,在已知的28 869个人类基因中L02-NS4B中有2 682个差异表达基因,包括1 446个基因表达上调和1 236个基因表达下调.上调基因参与的显著性信号转导通路41项,主要有凋亡通路、细胞外基质受体相互作用通路、细胞周期通路、癌症通路和Toll样受体信号通路等;下调基因参与的显著性信号转导通路20项,主要有癌症通路、Wnt信号通路和细胞周期通路等.Real-time QPCR验证5个表达上调基因中有3个基因表达变化与基因芯片结果一致,分别是AKT1,BIRC3和BCL2L1,吻合率为60%.结论:HCV NS4B可以调节LO2细胞中与细胞凋亡、细胞周期和细? 相似文献
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目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS3的真核表达载体,并分析其在HeLa细胞中的表达。方法:以HCV全长cDNA质粒为模板进行PCR扩增,获得全长NS3基因,将其插入克隆载体pMD18-T中,鉴定后与真核表达载体pcDNA3.1(+)重组,用脂质体介导法转染HeLa细胞,间接免疫荧光法及Western blot鉴定转染后HCVNS3蛋白的表达。结果:PCR扩增的NS3序列正确,构建的真核表达载体成功转染HeLa细胞,表达的NS3蛋白相对分子量为70kD。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/NS3,并在HeLa细胞中获得表达。 相似文献
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目的:筛选表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)1b型非结构蛋白4B(nonstructural protein 4B,NS4B)的慢
病毒稳定细胞株L02-NS4B差异表达基因和基因通路,为深入研究HCV NS4B在慢性丙型肝炎和肝细胞癌发生中的作用
及机制提供依据。方法:将已构建好的2株慢病毒稳定细胞株LO2-NS4B和阴性对照慢病毒稳定细胞株LO2- mkate2复苏
扩增;应用Human Gene 1.0ST 芯片筛选出LO2-NS4B与LO2-mkate2差异表达基因。基于京都基因和基因组百科全书(kyoto
encyclopedia of genes and genomes,KEGG)数据库,利用Fisher精确检验和卡方检验,对差异基因参与的信号转导通路进行
显著性分析。应用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,real-time QPCR)方法验证基因芯片中5个表达上调且与凋亡有关的基因,即蛋白激酶C 结合蛋白(protein kinase C delta binding protein,PRKCDBP)基因、肿瘤
蛋白p53(tumor protein p53,TP53)基因、v-akt 鼠科胸腺瘤病毒癌基因同源物1 (v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1,AKT1)基因、含3个杆状病毒凋亡蛋白抑制因子重复序列 (baculoviral IAP repeat containing 3,BIRC3)基因和B细胞淋巴瘤2样1基因(B-cell lymphoma 2-like1,BCL2L1)的mRNA水平。结果:以LO2-NS4B与LO2-mkate2之间基因荧光强度的比值大于1.2或小于0.8为差异表达基因,在已知的28 869个人类基因中L02-NS4B中有2 682个差异表达基因,包括1 446个基因表达上
调和1 236个基因表达下调。上调基因参与的显著性信号转导通路41项,主要有凋亡通路、细胞外基质受体相互作用
通路、细胞周期通路、癌症通路和Toll样受体信号通路等;下调基因参与的显著性信号转导通路20项,主要有癌症通
路、Wnt信号通路和细胞周期通路等。Real-time QPCR验证5个表达上调基因中有3个基因表达变化与基因芯片结果一
致,分别是AKT1,BIRC3和BCL2L1,吻合率为60%。结论:HCV NS4B可以调节LO2细胞中与细胞凋亡、细胞周期和
细胞增殖等有关的多种基因表达,主要影响与细胞凋亡、细胞周期和癌症相关的信号转导通路。 相似文献
病毒稳定细胞株L02-NS4B差异表达基因和基因通路,为深入研究HCV NS4B在慢性丙型肝炎和肝细胞癌发生中的作用
及机制提供依据。方法:将已构建好的2株慢病毒稳定细胞株LO2-NS4B和阴性对照慢病毒稳定细胞株LO2- mkate2复苏
扩增;应用Human Gene 1.0ST 芯片筛选出LO2-NS4B与LO2-mkate2差异表达基因。基于京都基因和基因组百科全书(kyoto
encyclopedia of genes and genomes,KEGG)数据库,利用Fisher精确检验和卡方检验,对差异基因参与的信号转导通路进行
显著性分析。应用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,real-time QPCR)方法验证基因芯片中5个表达上调且与凋亡有关的基因,即蛋白激酶C 结合蛋白(protein kinase C delta binding protein,PRKCDBP)基因、肿瘤
蛋白p53(tumor protein p53,TP53)基因、v-akt 鼠科胸腺瘤病毒癌基因同源物1 (v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1,AKT1)基因、含3个杆状病毒凋亡蛋白抑制因子重复序列 (baculoviral IAP repeat containing 3,BIRC3)基因和B细胞淋巴瘤2样1基因(B-cell lymphoma 2-like1,BCL2L1)的mRNA水平。结果:以LO2-NS4B与LO2-mkate2之间基因荧光强度的比值大于1.2或小于0.8为差异表达基因,在已知的28 869个人类基因中L02-NS4B中有2 682个差异表达基因,包括1 446个基因表达上
调和1 236个基因表达下调。上调基因参与的显著性信号转导通路41项,主要有凋亡通路、细胞外基质受体相互作用
通路、细胞周期通路、癌症通路和Toll样受体信号通路等;下调基因参与的显著性信号转导通路20项,主要有癌症通
路、Wnt信号通路和细胞周期通路等。Real-time QPCR验证5个表达上调基因中有3个基因表达变化与基因芯片结果一
致,分别是AKT1,BIRC3和BCL2L1,吻合率为60%。结论:HCV NS4B可以调节LO2细胞中与细胞凋亡、细胞周期和
细胞增殖等有关的多种基因表达,主要影响与细胞凋亡、细胞周期和癌症相关的信号转导通路。 相似文献
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应用RT一PCR和基因重组技术,从湖南地区HCV感染者血清中获得HCVNS_5区的基因克隆。经核苷酸序列的比较分析,此克隆片段属1b型HCV基因。应用PMAL-CRI质粒在大肠杆菌中高效表达了此基因片段,并获融合蛋白MBP-HCV·NS_5,经WesternBlot分析证实该融合蛋白有较特异的HCV抗原性,可用于HCV感染的临床诊断和发病机制的研究。 相似文献
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丙型肝炎病毒(HCV)非结构区3(HCVNS3)是HCV的一个多功能区,在HCV复制中起重要作用,与丙型肝炎(简称丙肝)发病及转归关系密切。我们提取HCVNS3不同末端蛋白作为抗原,并检测了干扰素(IFN)治疗的HCVRNA阳性丙肝患者血清,寻... 相似文献
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目的:构建可表达丙型肝炎病毒(HCV)EGFP-CORE融合蛋白的真核表达载体,获得重组质粒稳定转染的QSG7701细胞系。方法:克隆HCV核心抗原基因于真核表达载体pEGFP-C1中,脂质体法转染QSG7701细胞后,荧光显微镜及免疫细胞化学染色检测EGFP-CORE融合蛋白的表达。再经持续G418压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系。最后用Western blotting鉴定融合蛋白的表达。结果:成功构建真核表达载体pEGFP-C1/CORE;建立了重组质粒稳定转染的QSG7701细胞系。结论:重组质粒稳定转染的QSG7701细胞系可表达EGFP-CORE,为以CORE基因作为靶位的抗HCV感染研究奠定了基础。 相似文献
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丙型肝炎病毒整个开放阅读框序列的克隆及各组分蛋白的表达 总被引:1,自引:1,他引:1
目的 在痘苗系统中表达丙型肝炎病毒(HCV)各组分蛋白。方法 将编码HCV大前体蛋白的开放阅读框(ORF)序列克隆至痘苗启动子后,构建重组质粒pVHCV。重组质粒转染BHK21细胞后,再用痘苗病毒vTF7-3株感染,培养48h后收集细胞。Western blotting和免疫荧光技术鉴定HCV非结构蛋白NS3和NS5a的表达情况。结果 Western blotting结果表明,在细胞中检测到相对分子质量为70000(NS3)和58000(NS5a)的两条带;免疫荧光试验结果表明,无论采用抗NS3单抗还是抗NS5a单抗,大部分转染质粒细胞的细胞质中都具有较强的荧光反应。结论 HCV非结构蛋白NS3和NS5a在BHK21细胞中得到表达。 相似文献
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B基因酵母表达载体的构建及表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS4B基因的酵母细胞表达载体,为探索HCVNS4B在细胞内的相互作用蛋白奠定基础。方法:用多聚酶链反应(PCR)的方法在HCV全长质粒pBRTM/HCV-1为模板扩增HCVNS4B基因,克隆到pGEM-T载体中,双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹分析。结果:成功构建HCVNS4B基因酵母表达载体,Western免疫印迹分析显示了HCVNS4B在酵母细胞中融合表达。表达产物在胞内存在,融合蛋白的相对分子量约为48ku左右。结论:HCVNS4B蛋白在酵母中表达成功。 相似文献
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丙型肝炎病毒包膜蛋白基因片段的克隆与表达 总被引:1,自引:0,他引:1
应用RT-PCR和基因重组技术,从湖南地区丙型肝炎病毒(HCV)感染者血清中克隆了HCV包膜蛋白基因片段(E1,E2/NS1)经与已知基因型的HCV-1,HCV-J,HCV-J6和HCV-J8进行核苷酸序列的比较分析,这些基因片段属1b型HCV基因。将克隆基因重组于表达质粒PMAL-CRI中,在大肠杆菌内进行高效表达,获得了融合蛋白MBP-E1,MBP-E2/NS1,经WestemBlot分析证实 相似文献
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目的:建立截短的丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中瞬时表达:方法:应用多聚酶链反应(PCR),以HCV-H株全长cDNA序列为模板,扩增获得C区羧基端部分缺失的基因片段,克隆人真核表达载体pcDNA3.1(-),并通过脂质体转染至CHO细胞。结果:构建了真核表达载体pcDNA3.1-Ct,成功转染CHO细胞,间接免疫荧光和RT-PCR证实pcDNA3.1-Ct在CHO细胞中表达截短型的C蛋白。结论:成功构建羧基端部分缺失的HCVC区基因的真核表达载体,瞬时转染CHO细胞,为进一步基因免疫和构建多表位卡介苗(BCG)活载体疫苗奠定基础。 相似文献
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乙型肝炎病毒PreS基因的克隆表达及亲和层析纯化 总被引:4,自引:4,他引:4
目的:获取乙型肝炎病毒前S区基因(HBVpreS),序列测定正确后进行融合表达,为今后研究其机制及应用创造条件。方法:利用乙型肝炎病毒基因组为模板体外扩增HBVPreS基因后进行基因克隆,目的基因经测序正确后克隆入融合表达载体pRSET-C中,转化大肠杆菌JM109()DE3)。目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的HBV-PreS蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行纯化。结果:成功地扩增到preS区全长基因,得到融合6个His的HBV-PreS蛋白纯度大于90%,结论:构建了乙型肝炎病毒前S区基因的重组表达载体,获得了稳定表达的工程菌,为以后的深入研究奠定了基础。 相似文献