HPV18E77-15免疫原性的实验研究

目的 鉴定抗原肽HPV18 E77-15能否诱导HLA-A2+健康供者的外周血淋巴细胞(PBL)产生抗原肽特异性细胞毒性T细胞(CTL),判断其是否具有免疫原性.方法 通过体外细胞培养技术分为两组,实验组:负荷抗原肽为HPV18E77-15,对照组:负荷的抗原肽为HBVc17-28,采用抗原肽负荷外周血单个核细胞(PBMC)及T2 细胞作为抗原呈递细胞,重复刺激HLA-A2 阳性健康供者的外周血淋巴细胞(PBLs),1 周1次,共3次;分别在第1 轮刺激后和第3 轮刺激后,采用RPE 标记的抗原肽特异性五聚体和FITC标记的CD8+抗体通过流式细胞仪检测抗原肽所诱导产生的抗原肽特异性CTL 的频率.结果 在流式细胞仪检测中,实验组第1轮刺激后所选淋巴细胞群中CD8+五聚体+ 双阳性的抗原肽特异性CTL 为(1.87±0.01)%,第3 轮刺激后抗原肽特异性CTL 增至(15.73±2.47)%;而对照组中未检出抗原肽特异性的CTL细胞增殖.结论 抗原肽HPV18E77-15能够诱导产生抗原肽特异性CTL增殖,具有良好的免疫原性,可能成为针对HPV18感染的治疗性多肽疫苗的候选表位.     

QLFATINSTL（93-102aa）是隐球菌抗原MP98CTL优势表位

目的鉴定隐球菌抗原MP98中的HLA—A＊0201限制性CD8^＋CTL表位。方法应用数据库SYFPEITHI预测隐球菌MP98中可能存在的HLA—A＊0201限制性CD8^＋CTL表位,经流式细胞术分析各抗原肽与HLA-A＊0201的亲合力,经时间分辨荧光法检测外周血单个核细胞（PBMC5）对各抗原肽产生的增殖反应,经细胞毒性实验研究各抗原肽诱导的特异性T细胞的细胞毒杀伤活性,逐步鉴定MP98的HLA—A＊0201限制性CD8^＋CTL表位。结果位于MP98氨基酸序列肽3（93—102aa）与HLA—A＊0201分子具有较高的亲合力,并都能刺激HLA—A＊0201阳性个体PBMC增殖,并诱导产生具有特异性杀伤活性的CTL。结论肽3QLFATINSTL（93—102aa）是抗原MP98上HLA—A＊0201限制性CD8^＋CTL的优势表位,可作为隐球菌疫苗设计的候选表位。     

结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位的预测及鉴定

目的：预测及鉴定结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）抗原Ag85C的HLA-A＊0201限制性CD8^＋CTL表位，为基于表位的结核疫苗研究提供依据。方法：应用SYFPEITHI数据库预测结核杆菌抗原Ag85C序列中可能存在的HLA-A＊0201限制性T细胞表位，利用T2细胞株分析各预测的抗原肽与HL-A＊0201分子的亲合力，选取高亲合力肽诱导特异性CTL细胞，检测各高亲合力肽刺激其特异性CTL细胞分泌的IFN-γ水平、在体外的CTL增殖反应以及细胞杀伤毒性，逐步鉴定出Ag85C的HLA-A＊0201限制性CD8^＋CTL表位。结果：SYFPEITHI数据库从Ag85C序列中预测到14条能够结合HLA—A＊0201分子的抗原肽，其中3个抗原肽（170～178aa、317～325aa和144～153aa）显示与T2细胞上HLA-A＊0201分子有高结合力，而抗原肽FLTREMPAWL（144～153aa）能够诱导大多数HLA—A＊0201阳性结核患者及PPD（＋）健康志愿者产生特异性CTL细胞，并分泌大量的IFN-γ，能够诱导CTL体外发生增殖，能够产生特异性杀伤活性。结论：成功鉴定出抗原肽FLTREMPAWL（144～153aa）结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A＊0201限制性CD8^＋CTL表位，可作为结核疫苗设计的候选表位，为进一步研发新型有效的抗结核疫苗奠定了基础。     

HLA-A2限制性CTL表位HPV18E7_(7-15)分子修饰肽的免疫原性鉴定

目的:对HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位HPV18E77-15进行氨基酸置换修饰,探讨修饰肽的免疫原性。方法:采用细胞毒实验(51Cr释放法),以包被了九肽的T2细胞作为靶细胞,以九肽诱导的HLA-A2阳性人外周血单个核细胞为效应细胞,观察目标肽是否具有诱导特异性CTL杀伤效应。结果:修饰肽符合HLA-A2分子限制性细胞毒性T细胞的表位要求,具有特异性细胞毒性T细胞诱导活性。结论:修饰肽具有较强的抗原性,可以作为高危型HPV感染治疗性肽疫苗分子设计的候选表位。     

宫颈癌组织中HLA-Ⅰ缺失与HPV16、18感染的相关性研究(英文)

目的　探讨宫颈癌与人类组织相容性抗原 (HLA)表达缺失和人乳头瘤病毒 (HPV) 16、18感染的关系。方法　采用免疫组织化学S -P法检测特异性鼠抗人HLAⅠ类分子单克隆抗体及HPV16、18E6蛋白在宫颈癌组织中表达情况。结果　 6 2例宫颈癌组织中有 4 2例HLAⅠ抗原呈阳性表达 ,2 0例呈阴性表达 ,阴性表达率 32 .3%。有 4 4例HPV16、18E6呈阳性表达 ,阳性率 70 .9% (4 4 / 6 2 )。在HPV16、18E6阳性表达组织中其HLAⅠ抗原缺失明显增加。HLAⅠ抗原阳性表达组织中CD3 T细胞和CD8 T细胞数量明显多于HLAⅠ抗原阴性表达组织 ,肿瘤恶性程度及淋巴结转移与HLAⅠ抗原下调有关。结论　宫颈癌组织存在HLAⅠ抗原部分缺失与HPV16、18感染密切相关。HLAⅠ抗原部分缺失 ,形成了免疫逃逸导致了肿瘤细胞的发生、发展、浸润、转移。     

HPV18 E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th表位的预测与鉴定

目的:初步鉴定人乳头瘤病毒18型E7抗原的HLA-DRB1*0301限制性辅助T淋巴细胞(T-HelperCell)表位。方法:用SYFPEITHI软件预测HPV18E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th表位,候选表位分别命名为P1、P2、P3,以固相多肽合成技术合成,并运用HPLC进行纯化和质谱法(MS)鉴定。以密度梯度法分离HLA-DRB1*0301阳性健康人外周血单核细胞(PBMC),合成肽刺激PBMC,用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测淋巴细胞增殖活性,流式细胞仪分析细胞表型。结果:多肽P1(HPV18E780-94)在体外刺激PBMC后能够有效诱导CD4 T淋巴细胞增殖。结论:P1(HPV18 E780-94)可能为HPV18E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th细胞表位。     

宫颈癌组织中HLA-I缺失与HPV16、18感染的相关性研究

目的探讨宫颈癌与人类组织相容性抗原(HLA)表达缺失和人乳头瘤病毒(HPV)16、18感染的关系.方法采用免疫组织化学S-P法检测特异性鼠抗人HLA I类分子单克隆抗体及HPV16、18E6蛋白在宫颈癌组织中表达情况.结果62例宫颈癌组织中有42例HLA I抗原呈阳性表达,20例呈阴性表达,阴性表达率32.3%.有44例HPV16、18E6呈阳性表达,阳性率70.9%(44/62).在HPV16、18E6阳性表达组织中其HLA I抗原缺失明显增加.HLA I抗原阳性表达组织中CD3 T细胞和CD8 T细胞数量明显多于HLAI抗原阴性表达组织,肿瘤恶性程度及淋巴结转移与HLA I抗原下调有关.结论宫颈癌组织存在HLA I抗原部分缺失与HPV16、18感染密切相关.HLAI抗原部分缺失,形成了免疫逃逸导致了肿瘤细胞的发生、发展、浸润、转移.     

脂类分子内佐剂Th/CTL多表位肽体内诱导HLA-A2转基因鼠HBV特异性CTL应答的研究

目的 探索如何在体内启动对外源性合成肽抗原的HLA Ⅰ类分子限制性CD8 T细胞应答.方法 应用分子设计方法设计、合成基于免疫优势性HBcAg CTL表位、PreS2 B细胞表位和破伤风类毒素通用T表位的多肽,并在氨基端导入脂类分子内佐剂,分别与以完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)乳化的多肽抗原相比较,在HLA-A2转基因小鼠体内对其诱导T细胞Th1型极化、CD8 CTL扩增及CD8 CTL介导的HBV特异性细胞毒活性的功能进行研究.结果 含脂质分子内佐剂的Th/CTL多表位肽可在HLA-A2转基因小鼠体内诱导强而有效的Th1型极化和CD8 CTL扩增及HBV特异性CD8 CTL介导的细胞毒活性,其免疫原性显著高于CFA和IFA乳化的多肽(P＜0.05);而后二者其免疫原性未见显著差异.结论 Th/CTL多表位肽设计并引入脂质分子内佐剂是在体内有效诱导抗原特异性CTL应答并降低抗原制剂毒副作用的有效途径.     

丙型肝炎病毒HLA-A＊0201限制性CTL表位免疫学效应研究

目的：研究前期实验鉴定的2条丙型肝炎病毒HLA-A＊0201限制性CTL（活化的CD8＋T细胞）表位的体内外免疫学效应。方法：采用丙型肝炎病毒HLA-A＊0201限制性CTL表位肽C_181（LLSCLTTPV）和NS2_172（VLQAGLIRV）分别体外刺激HLA-A＊0201阳性健康志愿者外周血单个核细胞（PBMCs）和免疫HLA-A＊0201转基因小鼠,采用酶联免疫斑点实验（ELISPOT）和细胞内细胞因子染色（ICS）/流式细胞术检测表位肽特异性CD8＋T细胞的水平。结果：C_181和NS2_172诱导HLA-A＊0201阳性PBMCs产生了高水平的肽特异性分泌IFN-γ的细胞和肽特异性IFN-γ＋CD8＋T细胞;在C_181和NS2_172免疫的HLA-A＊0201转基因小鼠脾细胞中检测到了肽特异性分泌IFN-γ的细胞和肽特异性IFN-γ＋CD8＋T细胞。结论：C_181和NS2_172具有较好免疫学效应,有望用于研发CTL表位肽疫苗。     

树突状细胞吞噬PLA-AFP 218-226微球后诱导细胞毒性T淋巴细胞反应

目的研究树突状细胞（DC）吞噬包被有甲胎蛋白HLA—A2限制性表位肽（AFP218-226,LLNQHACAV）的聚乳酸微球（PLA—AFP218-226）后诱导的特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对肝癌细胞株HepG2和负载有AFP218-226的T2细胞株的毒性作用。方法用GM—CSF和IL-4诱导HLA—A2^＋的健康志愿者外周血单核细胞,LPS诱导成熟,使其分化为高纯度DC,在诱导过程中加入PLA—AFP218-226微球,用吞噬了PLA—AFP218-226微球的DC诱导自身T淋巴细胞,使其成为肝细胞癌（HCC）特异性CTL。用流氏细胞仪检测DC膜分子标志,T2细胞与AFP218-226结合实验检测HLA—A2分子与AFP218-226之间的亲合力,MTT法检测特异性CTL杀伤HepG2和T2细胞株的能力。结果AFP218-226与HLA—A2分子具有较高的亲合力,吞噬微球后的成熟DC高表达CD83、CD86、CD40等膜分子,其诱导的特异性CTL对HepG2和负载有AFP218-226的T2细胞株具有强的细胞毒作用。结论PLA—AFP218-226被DC细胞吞噬后,能够诱导HCC特异性CTL的产生,可能成为一种新型的抗肿瘤表位肽疫苗,在肝癌的防治中得到应用。     

登革病毒高度保守的HLA-A*1101限制性T细胞表位鉴定和体内免疫反应研究

目的：鉴定登革病毒2型（DENV-2）HLA-A*1101限制性T细胞表位并探讨其诱导的T细胞反应的特征。方法：基于DENV-2的氨基酸序列,采用T细胞表位预测软件预测HLA-A*1101限制性候选T细胞表位;基于HLA-A*1101转基因小鼠,采用ELISPOT实验、ELISA实验和CD8+T细胞（CTL）杀伤实验研究候选表位的HLA-A*1101限制性和所诱导的T细胞反应的特征。结果：在合成的14条候选表位中,9条肽（NS1161-170、NS1263-272、NS36-15、NS4b44-53、NS333-42、C58-67、E30-38、NS3576-584和NS4a72-80）免疫HLA-A*1101转基因小鼠可诱导产生肽特异性分泌IFN-γ的T细胞。除了分泌IFN-γ,C58-67和NS3576-584特异性T细胞也可分泌TNF-α,而E30-38特异性T细胞更可同时分泌TNF-α和IL-6。DENV-2感染的HLA-A*1101转基因小鼠体内也可检测到针对NS4b44-53、NS333-42、C58-67、E30-38、NS3576-584和NS4a72-80的分泌IFN-γ的T细胞。采用上述6条肽的混合物免疫HLA-A*1101转基因小鼠所诱导的效应细胞可显著杀伤DENV-2感染的小鼠脾单核细胞。结论：本研究鉴定出了9条全新的DENV-2特异性HLA-A*1101限制性T细胞表位。     

HPV18E7抗原HLA-A2限制性CTL表位的初步筛选

目的:初步筛选人乳头瘤病毒18型E7抗原的HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位,为表位免疫原性鉴定提供靶肽.方法:采用超基序、多项式和量化基序方案相结合的方法,对靶抗原HPV18E7的HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞表位进行预测,并应用固相合成法合成多肽,经RP-HPLC纯化及纯度分析,用质谱进行定性鉴定.结果:分别预测出5条、1条和6条九肽表位,综合三种预测方案确定其中1条为候选合成表位,合成肽的纯度大于95%,经质谱分析合成肽的分子量测定值与理论值相符.结论:超基序、多项式和量化基序方案联合应用提高预测效率,避免了在研究HPV18E7抗原表位时盲目合成多肽;所合成的多肽为高纯度靶肽,为后继的抗原表位的免疫原性的鉴定奠定了实验基础.     

登革病毒HLA-A*0201限制性T细胞表位诱导免疫反应的研究

目的：探讨登革病毒（DENV）HLA-A*0201限制性T细胞表位诱导DENV血清型间交叉反应性T细胞的效应。方法：基于已鉴定DENV-1中HLA-A*0201限制性CD8+ T细胞表位（NS4b40-48TLYAVATTI）序列,合成在其他血清型中相似的候选表位,采用MHC-肽复合物稳定性实验检测候选表位与HLA-A*0201结合力。采用酶联免疫斑点（ELISPOT）实验研究已鉴定表位及候选表位免疫HLA-A*0201转基因小鼠产生的CD8+ T细胞识别相同及相似表位能力;采用ELISPOT实验研究不同DENV血清型感染HLA-A*0201转基因小鼠是否产生能识别已鉴定表位及候选表位的T细胞反应。结果：DENV-3中NS4b39-47TLYAVATTV与HLA-A*0201具高结合力,但DENV-2中NS4b39-47TLYAVATTF与HLA-A*0201结合力弱。DENV-1-NS4b40-48和DENV-3-NS4b39-47免疫的转基因小鼠脾、淋巴结和外周血中存在可识别DENV-1-NS4b40-48、DENV-2-NS4b39-47和DENV-3-NS4b39-47的交叉反应性CD8+ T细胞。在DENV-1,-2,-3感染的转基因小鼠体内也存在类似的T细胞反应。结论：DENV-3中NS4b39-47TLYAVATTV为新的CD8+ T细胞表位,该表位及已报道表位NS4b40-48TLYAVATTI均可诱导DENV血清型间交叉反应性CD8+ T细胞反应,二者有助于我们研究DENV血清型间交叉反应性CD8+ T细胞的功能以及用于评估DENV候选疫苗的T细胞免疫效应。     

HPV18E7抗原B细胞表位的鉴定

目的：鉴定人乳头瘤病毒18型早期蛋白E7的B细胞优势表位的免疫原性。方法：根据亲水性方案、柔韧性方案、抗原指数方案及表面可能性方案预测分析抗原可能的B细胞优势表位肽,并探讨合成肽的免疫效果。结果：HPV18E715-22（LEPQNEIP）,E729-44（EQLSDSEEENDEIDGV）,E751-59（ARRAEPQRH）是可能的B细胞优势表位,其中,E729-44和E751-59可明显诱导小鼠血清抗体滴度升高。结论：HPV18E729-44具有较强的免疫原性,为E7抗原B细胞优势表位。     

结核分枝杆菌CFP21抗原的HLA-A*0201/*03限制性细胞毒T淋巴细胞表位预测

目的:探寻结核分枝杆菌CFP21抗原的同时针对HLA-A*0201/*03型别的广谱细胞毒T淋巴细胞(CTL)表位。方法:对结核分枝杆菌CFP21抗原的HLA-A*0201候选肽,利用在线数据库预测HLA-A*03限制性的天然表位肽,通过氨基酸置换适当修饰获得对应的改造肽。通过T2A3细胞结合力实验筛选候选肽,用于细胞毒活性实验。结果:在线数据库预测共获得4条母体肽和3条改造肽。结合力实验显示,改造肽p134-1Y2L、p134-1Y2L9L和母体肽p134与HLA-A*03分子均具有较高的结合力。改造肽p134-1Y2L9L和母体肽p134均能诱导CTL反应,但p134诱导出的CTL对靶细胞具有更强的杀伤效应。结论:p134(AVADHVAAV)是同时针对HLA-A*0201/*03型别的广谱CTL表位。     

丙型肝炎病毒HLA-A＊1101和A＊2402限制性CD8＋T细胞表位的研究

目的：鉴定出丙型肝炎病毒（HCV）特异性HLA-A＊1101限制性和A＊2402限制性CD8＋T细胞表位.方法：采用T细胞表位预测软件SYFPEITHI预测HCV特异性CD8＋T细胞表位,合成HLA-A＊1101限制性、A＊2402限制性候选表位;建立永生化的HLA-A＊1101阳性、A＊2402阳性B细胞株,采用竞争性肽结合实验检测候选表位与HLA-A＊1101或A＊2402分子的结合力;候选表位体外分别刺激HLA-A＊1101阳性或A＊2402阳性HCV感染者外周血单个核细胞（PBMCs）后,采用酶联免疫斑点（ELISPOT）和细胞内细胞因子染色（ICS）实验分别检测肽特异性分泌γ-干扰素（IFN-γ）的细胞的水平和（肝） 异性IFN-γ＋CD8＋T细胞的水平.结果：5条HLA-A＊1101限制性候选表位中,NS3_609（ITLTHPITK）和NS2_165（VVFSDMETK）与HLA-A＊1101分子具有高结合力.3条HLA-A＊2402限制性候选表位中,NS3_373 （KCDELASKL）和NS5b_382 （YYLTRDPTI）与HLA-A＊2402具有高结合力;在HLA-A＊1101阳性HCV感染者PBMCs中存在NS3 609和NS2_165特异性分泌IFN-γ的CD8＋T细胞,而在HLA-A＊2402阳性HCV感染者PBMCs中存在NS3_373和NS5b 382特异性分泌IFN-γ的CD8＋T细胞.结论：本研究证实NS3_609（ITLTHPITK）和NS2_165（WFSDMETK）为全新的HCV特异性HLA-A＊1101限制性CD8＋T细胞表位,NS3_373 （KCDELASKL）和NS5b_382 （YYLTRDPTI）为全新的HCV特异性HLA-A＊2402限制性CD8＋T细胞表位.     

pIRES2-HPV18E2-EGFP质粒重组及其在HeLa细胞中的表达

目的构建人乳头瘤病毒18型E2基因片段(HPV18E2)重组表达质粒并予以表达,为进一步研制HPV18相关疾病提供材料.方法以重组质粒(pBR322-HPV18)为模板,PCR方法扩增HPV18E2DNA片段,将HPV18E2DNA与加强绿色荧光质粒(pIRES2-EGFP)重组构建重组质粒(pIRES2-HPV18E2- EGFP).用酶切电泳及测序检查质粒重组后序列正确性.重组质粒转染Hela细胞.RT-PCR鉴定转染细胞中E2基因.结果 PCR扩增DNA片段约为1 kb,与预期结果相同.克隆重组质粒pIRES2-HPV18E2- EGFP酶切后显示的酶切图谱与预期相同,而且测序验证插入片段全序列无改变.转染并用G418筛选后,在荧光显微镜下可见绿色荧光细胞的表达.转染细胞RT-PCR出现特异性条带.结论成功构建表达HPV18 E2蛋白的靶细胞模型.     

MUC4 HLA-A*0201限制性CTL表位的预测及结合力分析

目的：寻找并鉴定MUC4 HLA-A^＊0201限制性细胞毒性T细胞（CTL）表位.方法：结合2种常用表位预测数据库（SYFPEITHI和ProPred-I）和工具,应用多种参数和方法进行综合分析,包括MHC结合力、蛋白酶体切割位点等综合预测方法.预测得到的抗原表位合成相应抗原肽.用T2细胞株测定各肽与HLA-A^＊0201分子的亲和力.结果：综合分析预测得到HLA-A^＊0201的5个可能表位;合成抗原肽经纯化后纯度＞95%;在5个候选表位肽中,LLLGVGTFV（u25-33）和LLGVGTFVV（1126-34）2个九肽与HLA-A^＊0201的结合力较强.结论：多参数表位预测结果和结合力分析实验结果一致性较好,两者联合应用初步认为LLLGVGTFV（1125-33）和LLGVGTFVV（1126-34）2个九肽为MUC4 HLA-A^＊0201限制性CTL表位的可能性最大.