皮肤真皮来源多能干细胞筛选与鉴定

目的:克隆培养SD大鼠皮肤真皮多能干细胞,并对其生物学特性进行检测,以期为组织工程再生牙齿探寻一种可靠的成体干细胞.方法:采用贴壁细胞培养法和有限稀释法培养出生1d的SD仔鼠掌趾部皮肤真皮成纤维细胞,分别检测其克隆形成能力、增殖能力和多向分化能力,并对其进行分子标志分析.结果:培养获得的SD大鼠皮肤真皮成纤维细胞,其中7株单克隆来源的细胞具有较强的克隆形成能力、较高的细胞群体倍增能力;同时,这部分细胞高表达细胞表面分子标志物CD44和CD90;成骨诱导后可形成矿化结节,成脂诱导后可见细胞内出现脂滴.结论:利用贴壁细胞培养法和有限稀释法培养皮肤真皮成纤维细胞,可获得具有类似间充质干细胞的生物学特性的真皮多能干细胞.本实验成功培养并获得了单克隆来源的真皮多能干细胞,为后续实验奠定了基础.     

小鼠毛囊来源间充质干细胞体外诱导成骨的实验研究

目的:探索便捷而有效的小鼠毛囊来源间充质干细胞的体外培养方法,并研究该群细胞的成骨能力,以探寻新的骨组织工程种子细胞。方法:采用酶消化法分离获得小鼠毛囊来源的干细胞,用不同培养体系进行传代培养,观察各细胞的增殖能力,并对所获得的毛囊来源的干细胞向成骨细胞诱导,行碱性磷酸酶染色、茜素红染色,对该细胞的成骨能力进行鉴定。结果:应用MEF条件培养液培养的小鼠毛囊来源的间充质干细胞具有较强的增殖能力,且诱导组和对照组能在体外被诱导成骨。结论:小鼠毛囊中存在具有较强增殖能力及成骨能力的间充质干细胞,可作为骨组织工程的种子细胞。     

大鼠Hertwig''''s上皮根鞘细胞的分离培养

目的:建立大鼠Hertwig's上皮根鞘细胞分离、培养和纯化的方法.方法:分离出生后7d SD大鼠上下颌第一、二磨牙牙胚,切取牙冠颈部组织,酶消化法原代培养,利用差速传代纯化上皮细胞.用角蛋白14和波形丝蛋白染色确定细胞来源.结果:原代培养细胞为上皮和间充质混合细胞,经2～3次差速传代后可获得纯化的上皮根鞘细胞.免疫组化染色角蛋白14阳性,波形丝蛋白阴性.结论:利用酶消化法及差速传代法培养并获得纯化的上皮根鞘细胞.     

用两种毛囊细胞构建细胞团以再生毛囊的初步研究

目的:探索体外制备毛乳头细胞和隆突部细胞复合而成的细胞团在体内构建毛囊的可行性。方法:分别分离培养毛囊毛乳头细胞、隆突部细胞,利用毛乳头细胞混合I型胶原制作细胞团包裹隆突部细胞团,移植于大鼠肾被膜下。结果:移植后的混合细胞团内有毛囊样结构产生。结论:毛乳头细胞和隆突部细胞复合形成的细胞团有生成毛囊的潜力,为组织工程皮肤中构建毛囊做了进一步铺垫。     

构建无外源性支架材料组织工程真皮的研究

目的:探讨运用组织工程方法构建不含有任何外源性支架材料的组织工程真皮组织.方法:以青少年包皮环切术后皮肤组织作为细胞来源,用消化法获得真皮成纤维细胞,用本实验室设计的组织工程皮肤培养系统构建组织工程真皮:在培养液中加入10 ng/ml的bFGF和50 ug/ml的Vitamin C,持续培养4周即形成组织工程真皮.免疫组化检测构建的真皮中细胞外基质(Ⅰ型胶原)的形成情况.结果:所构建的组织工程真皮含有多层细胞,细胞状态良好,染色结果显示形成了大量成熟的细胞外基质,Ⅰ型胶原呈强阳性表达.结论:本实验成功构建了不含外源性的组织工程真皮组织,可以用于下一步构建含有表皮的全层皮肤和动物实验.     

大鼠Hertwig＇s上皮根鞘细胞的分离培养

目的：建立大鼠Hertwig＇s上皮根鞘细胞分离、培养和纯化的方法。方法：分离出生后7dSD大鼠上下颌第一、二磨牙牙胚,切取牙冠颈部组织,酶消化法原代培养,利用差速传代纯化上皮细胞。用角蛋白14和波形丝蛋白染色确定细胞来源。结果：原代培养细胞为上皮和间充质混合细胞,经2～3次差速传代后可获得纯化的上皮根鞘细胞。免疫组化染色角蛋白14阳性,波形丝蛋白阴性。结论：利用酶消化法及差速传代法培养并获得纯化的上皮根鞘细胞。     

上皮根鞘细胞表面超微结构及牙根发育中上皮根鞘增殖力的变化

目的:观察体外培养的上皮根鞘细胞超微结构及牙根发育中上皮根鞘增殖力的变化。方法:体外培养大鼠上皮根鞘细胞,扫描电镜观察。制备出生后5 d、7~8 d和15 d的SD大鼠下颌磨牙石蜡切片,增殖细胞核抗原,检测免疫染色。结果:上皮根鞘细胞表面有许多微绒毛,细胞间连接紧密。牙根发育中上皮根鞘增殖力有序变化。结论:上皮根鞘细胞具有典型的上皮细胞表面结构特性。牙根发育中上皮根鞘有序断裂与其增殖力变化有关。     

Notch 1在体外培养的大鼠根尖蕾细胞中的表达

目的:分离、培养和纯化大鼠切牙根尖蕾细胞,观察Notch 1在根尖蕾细胞中的表达.方法:分离出生后7d SD大鼠下颌切牙胚,切取根尖唇侧部分,酶消化法原代培养,差别胰酶消化法纯化上皮细胞.角蛋白14和波形丝蛋白染色鉴定细胞来源.Notch 1免疫细胞化学染色.结果:原代培养的细胞经2～3次差别胰酶消化后可获得纯化的根尖蕾上皮细胞.免疫细胞化学染色角蛋白14阳性,波形丝蛋白阴性,并且在根尖蕾细胞中存在Notch 1阳性细胞.结论:体外培养的根尖蕾细胞中存在Notch 1表达阳性的细胞,Notch信号途径可能参与了根尖蕾中干细胞增殖和分化的调控.     

同一个体成骨细胞和牙周韧带成纤维细胞的原代培养

目的：探索用简单，高效的方法对同一个体的成骨细胞和牙周韧带成纤维细胞进行原代培养，以便迅速建立相关的体外研究模型，为进一步研究两种细胞的相互作用奠定基础。方法：实验用酶消化法结合组织块培养法获取大鼠牙周韧带成纤维细胞，用组织块移行生长法培养成骨细胞，并对细胞培养中取材的对象和部位，酶消化时间，污染的控制等进行探讨。结果：发现所获得的细胞符合成骨细胞和成纤细胞的形态特征和生物学特性，且生长良好。结论：用酶消化法结合组织块培养法培养大鼠牙周韧带成纤维细胞，其方法可行，结果可靠。     

大鼠根尖蕾细胞的分离培养

目的研究大鼠切牙根尖蕾细胞的分离、培养和纯化的方法。方法分离出生后3dSD大鼠下颌切牙胚,切取根尖唇侧部分组织,酶消化法原代培养,利用差速传代纯化上皮细胞。用角蛋白14和波形丝蛋白染色确定细胞来源。结果原代培养的细胞为上皮和间充质混合细胞,经2～3次差速传代后可获得纯化的根间蕾上皮细胞。免疫组化染色角蛋白14阳性,波形丝蛋白阴性。结论利用酶消化法和差速传代法培养获得了纯化的根尖蕾细胞。     

Pilomatricoma of the auricular region: case report

Pilomatricomas are relatively rare tumors of ectodermal origin from the outer root sheath cell of the hair follicle. They are usually asymptomatic, solitary, firm or hard, freely mobile, dermal or subcutaneous nodules. The purpose of this article is to present a case that illustrates the diagnostic difficulty encountered by oral surgeons and pathologists and to review the literature regarding pilomatricomas of the auricular region.     

牙囊和上皮根鞘细胞成无细胞牙骨质的机制

无细胞牙骨质是锚定牙周纤维和牙根的重要组织结构,牙囊细胞（DFC）通过自身分化和上皮根鞘（ERS）通过上皮-间质转化（EMT）形成的成牙骨质细胞参与无细胞牙骨质形成。牙囊细胞体外移植后可形成纤维样和牙骨质样组织,而牙乳头和上皮根鞘可以诱导牙囊细胞从基因及其蛋白质水平高表达碱性磷酸酶、骨涎蛋白等无细胞牙骨质相关标志物。其中钙离子、骨形态发生蛋白、Wnt／β-连环蛋白通路等目前被认为是介导牙囊细胞成牙骨质分化的信号转导通路。目前发现,调控无机磷酸盐胞内外浓度的转运蛋白对无细胞牙骨质形成调节的敏感性更高。ERS亦可通过EMT形成间质细胞来参与牙周组织的发生。钙结合蛋白D28k、末端较小的同源异形盒-2等在无细胞牙骨质、ERS以及牙囊细胞表达差异都说明了ERS具有成牙骨质细胞特性。在此过程中,TGFβ激活下游蜗牛蛋白后,通过磷脂酰肌醇-3-激酶和蛋白激酶B信号转导通路来介导ERS的无细胞牙骨质分化过程。     

毛囊bulge干细胞培养方法的比较研究

目的通过对限定性角质形成细胞无血清培养基（DK-SFM）和3T3滋养层培养毛囊bulge干细胞的比较,寻求既能方便获得大量毛囊bulge干细胞,又能减少其分化的理想培养条件。方法采用DK-SFM和3T3滋养层分别培 养毛囊bulge干细胞,通过倒置显微镜观察毛囊bulge干细胞的形态,免疫荧光染色检测毛囊bulge干细胞的特异性标 记细胞角蛋白19（CK19）和分化相关抗体群34（CD34）的表达鉴定毛囊bulge干细胞。通过比较2种方法培养的毛囊bulge干细胞的克隆形成率和CD34阳性率的差异,分别比较毛囊bulge干细胞的增殖能力和干细胞的数量,综合评估 2种培养方法的优劣。结果倒置显微镜观察2种培养方法所得毛囊bulge干细胞均为铺路石状。免疫荧光染色检测 2种培养方法培养的毛囊bulge干细胞CK19和CD34均呈阳性。DK-SFM和3T3滋养层培养的毛囊bulge干细胞克隆形成 率分别为69.4%和62.2%。流式细胞仪检测DK-SFM培养的毛囊bulge干细胞中CD34阳性率为72.3%;3T3滋养层培养 的毛囊bulge干细胞中CD34阳性率为34.7％。结论DK-SFM和3T3滋养层培养作为毛囊bulge干细胞的2种培养方法, 均可以获得未分化的毛囊bulge干细胞。用3T3滋养层培养毛囊bulge干细胞的方法比较复杂,且所获的细胞混杂有 3T3细胞,但用此种方法可获得大量的毛囊bulge干细胞。用DK-SFM培养毛囊bulge干细胞方法简单,但细胞不易贴 壁,且数量较少,但能有效分离出较纯的毛囊bulge干细胞,保持较好的细胞活性。     

大鼠牙囊细胞体外培养技术的建立及其鉴定

目的　建立体外培养大鼠牙囊细胞的方法,观察牙囊细胞体外生长的生物学特性。方法　分离乳鼠下颌第一、第二磨牙牙胚的牙囊组织,应用组织培养的方法进行牙囊细胞原代和传代培养。显微镜观察培养细胞的形态,电镜观察体内牙囊组织和体外培养的牙囊细胞的超微结构。免疫组化法检测细胞波形蛋白、Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白的表达。结果　分离组织培养24 h后,梭形细胞和多角形细胞从组织块中游出,经消化排除法获得纯化的牙囊细胞。显微镜下牙囊细胞为成纤维细胞样,电镜下牙囊细胞无桥粒,胞浆中含有高密度电子颗粒和大量粗面内质网(RER)。免疫组化染色显示牙囊细胞表达波形蛋白、Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白。结论　运用组织培养和细胞生物学技术可以成功获得原代和传代培养的大鼠牙囊细胞,体外培养的细胞具有与正常大鼠牙囊细胞相一致的生物学特性。     

Are Hertwig’s epithelial root sheath cells necessary for periodontal formation by dental follicle cells?

ObjectiveThe role of Hertwig’s epithelial root sheath (HERS) cells in periodontal formation has been controversial. This study aimed to further clarify whether HERS cells participate in formation of the periodontium, and the necessity of HERS cells in differentiation of dental follicle cells (DFCs) for periodontal regeneration.DesignHERS cells and DFCs were isolated and identified from post-natal 7-day Sprauge-Dawley rats. In vitro, direct co-culture of HERS cells and DFCs as well as the individual culture of HERS and DFCs were performed and followed by alizarin red staining and the quantitative real-time polymerase chain reaction analysis. For in vivo evaluation, the inactivated dentin matrix (iTDM) was fabricated. HERS cells and DFCs were seeded in combination or alone on iTDM and then transplanted into the rat omentum. Scanning electron microscope and further histological analysis were carried out.ResultsIn vitro, mineral-like nodules were found in the culture of HERS cells alone or HERS + DFCs either by alizarin red staining or scanning electronic microscope. The mineralization and fiber-forming relevant mRNA expressions, such as bone sialoprotein, osteopontin, collagen I and collagen III in HERS + DFCs were significantly higher than that of the HERS or DFCs alone group. After transplantation in vivo, cementum and periodontal ligament-like tissues were formed in groups of HERS + DFCs and HERS alone, while no evident hard tissues and attached fibers were found in DFCs alone.ConclusionsHertwig’s epithelial root sheath cells directly participate in the formation of the periodontium, and they are essential for the differentiation of dental follicle cells to form periodontal structures. The combination use of Hertwig’s epithelial root sheath cells and dental follicle cells is a promising approach for periodontal regeneration.     

毛囊bulge区神经嵴细胞体外分离培养及生物学特点

目的探讨毛囊bulge区神经嵴细胞的体外生物学特点。方法采用体视显微解剖分离毛囊bulge区组织块,贴壁培养获取神经嵴细胞,通过形态学,结合Sox10,p75,nestin免疫细胞化学,观察神经嵴细胞的生物学特点。结果分离培养的小鼠毛囊神经嵴细胞,其形态类似成纤维细胞,免疫细胞化学检测细胞表型nestin,p75,Sox10均呈阳性表达。结论本研究成功从小鼠触须毛囊分离培养出神经嵴细胞,为进一步利用神经嵴细胞开展组织再生研究奠定了基础。     

差速传代纯化大鼠牙囊细胞

目的:建立一种简捷的分离培养和纯化大鼠牙囊细胞的方法。方法:分离出生后6dSD大鼠上下颌第一和第二磨牙完整牙胚,剥离牙囊和成釉器,剪碎后酶消化并混合培养,再利用多次差速传代纯化牙囊细胞。结果:原代细胞为牙囊细胞和成釉器细胞混合生长,差速传代培养到第4代可获得纯化的牙囊细胞。倒置显微镜下观察牙囊细胞呈长梭形或三角形,免疫组化染色抗波形丝蛋白阳性,抗角蛋白阴性。结论:利用多次差速传代可从混合培养的原代细胞中获得纯化的牙囊细胞。     

Ultrastructural evidence of directed cell migration during initial cementoblast differentiation in root formation

Root formation in 14-day-old Sprague-Dawley rats was studied by light and electron microscopy. Special attention was focused on initial cementoblast differentiation. Disruption of the epithelial root sheath appears to be a consequence of directed cell migration by cells of the dental follicle proper which undergo differentiation into precementoblasts. Precementoblasts rapidly develop polarity towards the dentin, exhibiting major cytoplasmic processes rich in cytoplasmic filaments. These processes grow toward and eventually contact the dentin matrix. It is suggested that the cells of the dental follicle proper are cementoblast precursors which respond to chemoattractant substances released from newly deposited dentin matrix- and/or basal lamina-associated material of root sheath origin.