人脐血前红系祖细胞(BFU-E)体外培养的动态观察

<正> 脐血含各系造血干/祖细胞和多种造血集落刺激因子,是继骨髓、外周血、胎肝之后第4个新开发的、可移植的造血干细胞来源;还可静脉输注,用于一切放化疗后血细胞减少的病人、刺激造血功能,从而扩大了血源供应。笔者通过对37份人脐血和11份正常骨髓的BFU-E体外培养观察,再次证明脐血含有丰富的造血干细胞,并对脐血红系定向祖细胞的2个亚群(CFU-E、BFU-E)进行了动态观察,结果报告如下。     

人巨细胞病毒感染致造血祖细胞增殖抑制与更昔洛韦的影响

背景:临床研究显示,骨髓移植后人巨细胞病毒感染可阻碍血小板植入、出现表型异常的外周血白细胞,导致骨髓移植失败,这可能是由于人巨细胞病毒感染直接影响了造血祖细胞所致.目的:观察更昔洛韦对人巨细胞病毒感染所致脐血粒-巨噬系祖细胞、红系祖细胞、淋巴系祖细胞、多向造血祖细胞及巨核系祖细胞体外增殖抑制的影响及更昔洛韦对此的保护作用. 设计:对比观察性实验.单位:泸州医学院附属医院分子生物学实验室.对象:正常足月顺产新生儿脐血标本20例,每份10 mL,由泸州医学院附属医院妇产科提供,产妇对本实验知情同意.实验经医院伦理委员会批准.方法:实验于2004-06/2006-12在泸州医学院附属医院分子生物学实验室完成.采用脐血标本造血祖细胞培养技术,观察、计数100 TCID50人巨细胞病毒-AD169感染粒-巨噬系祖细胞、红系祖细胞、淋巴系祖细胞、多向造血祖细胞及巨核系祖细胞后各祖细胞集落数,记录集落维持时间.用PCR和荧光定量PCR技术检测集落细胞内人巨细胞病毒-AD169DNA.将7.5 mg/L更昔洛韦作用于人巨细胞病毒感染的造血祖细胞,再分别计集落数、集落维持时间及集落细胞内人巨细胞病毒-AD169DNA.设正常培养的造血祖细胞为空白对照组,设与含灭活性人巨细胞病毒的正常造血祖细胞培养系统为灭活对照组.主要观察指标:①祖细胞集落数、祖细胞集落维持时间.②祖细胞集落细胞内人巨细胞病毒-AD169DNA. 结果:①集落数和集落维持时间:人巨细胞病毒感染的祖细胞集落数较对照组明显减少(P < 0.01),集落维持时间较对照组明显缩短(P < 0.01).在人巨细胞病毒感染的集落细胞内检测到人巨细胞病毒-DNA的存在;更昔洛韦作用于人巨细胞病毒感染的祖细胞后,与人巨细胞病毒感染的祖细胞比较集落数明显提高,差异有非常显著性意义(P < 0.01) ,集落维持时间明显延长,差异有非常显著性意义(P < 0.05).②集落增殖提高率: 粒-巨噬系祖细胞、红系祖细胞、淋巴系祖细胞、多向造血祖细胞、巨核系祖细胞分别为37.4%,74.2%,40.1%,67.4%,38.9%.③集落细胞内人巨细胞病毒-AD169DNA:荧光定量PCR显示更昔洛韦作用于人巨细胞病毒感染的祖细胞后核酸载量较人巨细胞病毒感染的祖细胞降低,差异有非常显著性意义(P < 0.01).结论:人巨细胞病毒-AD169株在体外能明显抑制粒-巨噬系祖细胞、红系祖细胞、淋巴系祖细胞、多向造血祖细胞及巨核系祖细胞集落细胞的增殖;在体外更昔洛韦有抗人巨细胞病毒的活性,能促进人巨细胞病毒感染的造血祖细胞增殖.     

经人巨细胞病毒感染人脐血造血干细胞向粒-巨噬系和红系祖细胞增殖过程中HOXB6-mRNA及其基因表达

背景:造血祖细胞被人巨细胞病毒(HCMV)感染后增殖和分化能力受到抑制是否与受染细胞增殖的基因异常表达有关联?目的:观察经人类巨细胞病毒感染的人类造血干祖细胞向粒-巨噬系、红系祖细胞增殖过程中HOXB6mRNA表达.设计:观察对比实验.单位:泸州医学院附属医院分子生物学实验室.材料:所有脐血标本由泸州医学院附属医院产科提供,取自正常足月顺产新生儿断脐后的胎盘段脐血.所有新生儿母亲HBSAg阴性,常规ELISA检测抗HCMV-IgM及PCR检测HCMV-DNA均为阴性,且对本实验知情同意,实验经过医院伦理委员会批准.HCMV-AD169株由中国预防医学科学院病毒研究所提供.全反式维甲酸(ATRA)为重庆华邦制药股份有限公司产品,批号为20010126.方法:实验于2006-04/2007-04在泸州医学院附属医院分子生物学实验室完成.分离脐血单个核细胞,进行造血祖细胞培养.根据实验干预方式不同将细胞分为4组:[1]对照组:与HCMV组等量的IMDM培养液进行细胞培养.[2]HCMV组:HCMV-AD169滴度为105pfu,以0.1mL感染培养体系.[3]ATRA组:在培养体系分组中加入12μL ATRA,终浓度为60μmol/L.[4]HCMV ATRA组:在HCMV感染组中加入ATRA,终浓度同ATRA组.主要观察指标:分别于培养后3,7,12天收获各组细胞,采用实时荧光定量PCR技术分别检测脐血粒-巨噬系祖细胞和脐血红系祖细胞HOXB6 mRNA表达水平.结果:[1]对照组红系祖细胞和粒-巨噬系祖细胞均表达HOXB6-mRNA,随着时间推移,表达水平增加,其中,脐血红系祖细胞表达HOXB6-mRNA于第12天达高峰,脐血粒-巨噬系祖细胞HOXB6-mRNA于第7天达高峰.[2]HCMV组脐血粒-巨噬系祖细胞、红系祖细胞感染人巨细胞病毒后各时间点HOXB6基因表达均低于对照组,差异有显著性意义(P<0.05).[3]ATRA组各时间点脐血粒-巨噬系祖细胞、红系祖细胞HOXB6-mRNA表达均高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05).[4]HCMV ATRA组各时间点红系祖细胞及粒-巨噬系祖细胞的HOXB6-mRNA表达均高于人巨细胞病毒组,差异有显著性意义(P<0.05~0.01).结论:[1]人类造血干祖细胞向粒单系和红系祖细胞增殖分化过程中,HOXB6-mRNA呈现持续稳定的表达.[2]人巨细胞病毒能使HOXB6基因表达下调.[3]ATRA能上调HOXB6基因的表达.     

脐血混合培养对粒-巨噬细胞系祖细胞产率的影响

利用粒-巨噬细胞系祖细胞(CFU-GM)体外培养技术,观察了2份脐血混合后CFU-GM集落和集簇的产率。结果表明:混合培养组造血祖细胞的集落和集簇的产率不低于单一培养组。该研究为混合脐血造血细胞移植提供了一定的理论依据。     

墓头回诱导脐血基质细胞生长促粒-单系和红系造血祖细胞集落形成的研究

目的 研究中药墓头回对脐血基质细胞促粒-单系和红系造血祖细胞集落形成的影响.方法 收集12例脐血单个核细胞(MNC),加入不同浓度的墓头回水提物共培养14天,基质细胞层形成后,消化,计数;收集基质细胞最多浓度的上清液(MTH-PSCS),以不同比例与MNC共同加入集落培养基中共培养14天,计数粒-单系和红系造血祖细胞集落数.结果 0.01μg/ml的墓头回与MNC共孵育14天后,基质细胞的数量(14±2.8)×105/ml明显多于对照组(9±2.2)×105/ml.0.01 μg/ml的MTH-PSCS以0、5、10、20比例作用后,脐血粒-单系造血祖细胞集落数分别为17±6、121±24、268±27、114±31、68±11,10%的MTH-PSCS作用最为明显;脐血红系造血祖细胞集落数分别为38±12、72±23、81±9、159±45、90±32,其中以20%的MTH-PSCS作用最为明显.结论 中药墓头回可诱导脐血基质细胞的生长,可以促进粒-单系和红系造血祖细胞集落的形成.     

人脐血清造血刺激活性的检测

通过半固体培养法(甲基纤维素法和琼脂培养法)和液体长期培养等方法,观察了脐血清和成人血清对正常小鼠骨髓细胞的影响。结果表明:①脐血清EPO活性高于成人血清,红系祖细胞产率分别为23.2±5.4/1×10~5细胞和3.0±1.3/1×10~5细胞,差异非常显著;对PHA刺激的小鼠脾细胞培养液的活性,脐血清抑制作用较低;②以脐血清作为外源性刺激因子,可形成粒单系祖细胞21.7±16.8集落和丛/1×10~5细胞,用成人血清仅见个别小丛1.1±1.2丛/1×10~5细胞;③脐血清可促进成纤维系祖细胞(CFU-F)增殖与分化,其产率为36.0±29.7/1×10~6细胞,明显高于成人血清。提示:脐血清不仅含有丰富的红系、粒单系、巨核系祖细胞,而且造血活性也高于成人血清,因而脐血输注和移植将有广阔前景。     

脐血造血干／祖细胞集落产率的研究

对３１例脐血及３１例正常成人骨髓细胞进行体外培养，分别检测其ＣＦＵ－ＧＭ，ＢＦＵ－Ｅ，巨核细胞集落形成单位（ＣＦＵ－Ｍｅｇ），粒、红、巨噬细胞集落形成单位（ＣＦＵ－ＧＥＭ），粒、红、巨噬、巨核细胞集落形成单位（ＣＦＵ－ＧＥＭＭ）及初始造血祖细胞——粘附于基质的原始细胞集落形成单位（ｓＣＦＵ－Ｂｌ），对比分析其造血细胞的层次结构。发现脐血晚期祖细胞含量接近骨髓，早期祖细胞含量则高于骨髓。经推算２１天时ｓＣＦＵ－Ｂｌ含量可达骨髓的１０倍左右。提示脐血长期重建造血的能力优于骨髓，一份脐血重建成人造血理论上是可能的。     

人巨细胞病毒感染致造血祖细胞增殖抑制与更昔洛韦的影响术

背景：临床研究显示，骨髓移植后人巨细胞病毒感染可阻碍血小板植入、出现表型异常的外周血白细胞，导致骨髓移植失败，这可能是由于人巨细胞病毒感染直接影响了造血祖细胞所致。目的：观察更昔洛韦对人巨细胞病毒感染所致脐血粒一巨噬系祖细胞、红系祖细胞、淋巴系祖细胞、多向造血祖细胞及巨核系祖细胞体外增殖抑制的影响及更昔洛韦对此的保护作用。设计：对比观察性实验。单位：泸州医学院附属医院分子生物学实验室。对象：正常足月顺产新生儿脐血标本20例，每份10mL。由泸州医学院附属医院妇产科提供，产妇对本实验知情同意。实验经医院伦理委员会批准。方法：实验于2004-06／2006-12在泸州医学院附属医院分子生物学实验室完成。采用脐血标本造血祖细胞培养技术，观察、计数100TCID50人巨细胞病毒-AD169感染粒-巨噬系祖细胞、红系祖细胞、淋巴系祖细胞、多向造血祖细胞及巨核系祖细胞后各祖细胞集落数，记录集落维持时间。用PCR和荧光定量PCR技术检测集落细胞内人巨细胞病毒-AD169DNA。将7．5mg/L更昔洛韦作用于人巨细胞病毒感染的造血祖细胞，再分别计集落数、集落维持时间及集落细胞内人巨细胞病毒-AD169DNA。设正常培养的造血祖细胞为空白对照组，设与含灭活性人巨细胞病毒的正常造血祖细胞培养系统为灭活对照组。主要观察指标：①祖细胞集落数、祖细胞集落维持时间。②祖细胞集落细胞内人巨细胞病毒-AD169DNA。结果：①集落数和集落维持时间：人巨细胞病毒感染的祖细胞集落数较对照组明显减少（P〈0．01），集落维持时间较对照组明显缩短（P〈0．01）。在人巨细胞病毒感染的集落细胞内检测到人巨细胞病毒-DNA的存在：更昔洛韦作用于人巨细胞病毒感染的祖细胞后，与人巨细胞病毒感染的祖细胞比?     

血浆凝块扩散盒培养中生长的两种小鼠粒系祖细胞

体内血桨凝块扩散盒(PCDC)培养中可以生长多种不同成熟程度的粒系和红系造血祖细胞。作者观察表明,正常小鼠骨髓在PCDC培养系统中至少生长有两种不同类型的粒系祖细胞。作者使用体内PCDC技术,同时以体外琼脂CFU-C和外源性CFU-S技术为对照,结合细胞形态学观察,以及注射细胞毒剂后体外孵育测定处于细胞周期中的细胞比例、水渗透崩溶和速度沉降等处理方法,测定了生长于PCDC培养中小鼠粒系祖细胞的特性。     

人干细胞因子与其它造血生长因子对造血集落形成的协同作用

本文观察了含有人造血干细胞因子(rh-SCF)的重组质粒转染的COS7上清液,在半固体培养中,单独或协同rhGM-CSF、G-CSF、IL-3、EPO刺激人粒单系和红系造血祖细胞形成集落的影响。结果表明:单独rh-SCF对造血祖细胞集落形成无明显作用,SCF主要是协同其它因子,明显增加集落形成数量和集落的大小。     

人巨细胞病毒感染对脐血红系祖细胞发育过程中Hoxb2,Hoxb4基因表达的影响

背景:人巨细胞病毒感染可损害造血系统,甚至造成骨髓衰竭.人巨细胞病毒感染抑制红系祖细胞增殖和分化,是否与受染红系祖细胞增殖的基因异常表达有关?目的:观察人巨细胞病毒和/或全反式维甲酸对人脐血造血干细胞向红系祖细胞定向增殖分化过程进行干预后Hoxb2、Hoxb4基因表达的变化.方法:取12例正常足月顺产新生儿断脐后的胎盘段脐血,采用造血干细胞体外培养技术及实时荧光定量聚合酶链反应方法,以人巨细胞病毒-AD169和(或)6×10-8 mol/L的全反式维甲酸持续干预人脐血造血干细胞向红系定向增殖分化过程,检测空白组、全反式维甲酸组、人巨细胞病毒组、全反式维甲酸+人巨细胞病毒组在培养第3,7,10天红系祖细胞Hoxb2、Hoxb4基因的表达情况.结果与结论:各组Hoxb2、Hoxb4基因均在增殖分化的第3天已有表达,第7天表达明显增加,第10天表达最强烈.与空白组相比,人巨细胞病毒组明显下降;与人巨细胞病毒组相比,全反式维甲酸+人巨细胞病毒组的Hoxb2、Hoxb4基因表达量明显增加(P < 0.05).提示人巨细胞病毒可能通过调控Hoxb2、Hoxb4基因异常表达而引起造血功能异常;Hoxb2、Hoxb4均与红系造血有相关性;6×10-8 mol/L全反式维甲酸能显著上调正常红系祖细胞Hoxb2、Hoxb4基因的表达,也能上调经人巨细胞病毒感染的红系祖细胞Hoxb2、Hoxb4基因的表达.     

全反式维甲酸对人脐血CD133+细胞体外短期扩增中生物学特性的影响

维甲酸 (RA)对许多细胞的增殖和分化具有调节作用。全反式维甲酸 (ATRA)在体内外能诱导急性早幼粒细胞白血病 (APL)细胞向成熟粒细胞分化 ,对造血细胞的调节作用尚未完全明了 ,有报道认为RA能促进粒系和红系祖细胞的增殖 ,也有报道认为 ,RA对造血干 /祖细胞 (HSPC)的增殖和分化具有抑制作用[1,2 ] 。近来有研究显示 ,RA在体外能促进小鼠HSPC的自我更新 ,并能延迟HSPC的分化[3 ,4] 。为了解ATRA对人脐血HSPC体外增殖和分化的影响 ,我们观察了ATRA对人脐血CD133 细胞体外增殖和分化的影响。材料和方法1　标本来源和细胞制备…     

人脐血清对粒－单系祖细胞体外培养初步观察

人脐血清对粒－单系祖细胞体外培养初步观察５１０１２０中山医科大学孙逸仙纪念医院侯玲玉，黄绍良，李文益我们曾报道过人脐血中富含扩增潜能更强、可维持长期造血重建的早期造血干细胞群［１，２］。在临床输注脐血时发现脐血对再生障碍性贫血患者有刺激造血、改善血象...     

混合脐血血浆对脐血CD34^＋细胞体外扩增的作用

采用两步法分离出脐血CD34~ 细胞,比较研究了混合脐血血浆联合IL-3,IL-6,GM-CSF,Epo 4种中、晚期造血因子和单纯的4种造血因子情况下脐血CD34~ 细胞的体外扩增。结果表明,混合脐血血浆联合造血因子对粒-巨噬细胞集落形成单位(granulocyte-macrophage colony-forming unit,CFU-GM),红系爆式集落形成单位(burst-forming unit of erythriod,BFU-E),混合集落形成单位(minxed colony-forming unit,CFU-mix)3种集落的扩增效果明显优于单纯的4种造血因子联合组,差异具有统计学意义(P<0.01),但单纯混合脐血血浆扩增效果较差。脐血造血细胞扩增对子成人脐血移植有重要意义。上述结果提示,混合脐血血浆的扩增成功,可代替或弥补早期造血生长因子的作用,用于脐血造血细胞的体外扩增。     

体外诱导人类诱导性多能干细胞分化为造血干 / 祖细胞的研究简

本研究探讨体外诱导人诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）分化为造血干/祖细胞的能力.在体外用小鼠骨髓基质细胞OP9与人类iPSC共培养的方法,将iPSC诱导分化为造血干/祖细胞;用流式细胞术检测造血干/祖细胞表面标志物的表达水平;用实时定量PCR检测分化过程中iPSC及造血干/祖细胞的相关基因mRNA表达水平的变化;用免疫磁珠法分离CD34＋造血干/祖细胞并进行半固体集落形成实验检测细胞的集落形成能力.结果表明,iPSC与OP9细胞共培养诱导造血分化的第4天即可观察到iPSC形态变化;流式细胞术检测显示,分化得到的细胞表达已知的造血干/祖细胞相关表面标志物CD34和CD43分子.在体外分化过程中多能性的标志基因Oct4的表达逐渐下降,造血相关转录因子Gata-2的表达逐渐升高,而Runx-1的表达量则呈波浪式变化,CD34表达量逐渐升高.集落培养14 d能够得到红系集落（CFU-E）,粒系集落（CFU-G）,巨核系集落（CFU-M）,粒-巨核系集落（CFU-GM）和混合系集落（CFU-GEMM）.结论：iPSC细胞能够在体外通过与OP9细胞共培养分化为造血干/祖细胞.     

脐血造血干/祖细胞体外定向诱导扩增的研究

目的　观察不同因子组合在体外对脐血 (CB)中的巨核系等造血祖细胞的诱导扩增作用。方法　用体外液体悬浮培养法 ,将白细胞介素 3(IL 3)、白细胞介素 6 (IL 6 )、血小板生成素 (TPO)、脐血血浆 (CBP)作为刺激因子 ,添加不同的细胞因子组合 ,对CB的单个核细胞 (MNC)短期培养 2 1d。在培养的 0、7、14、2 1d检测新鲜细胞和培养细胞中的有核细胞数 (NC)、巨核系祖细胞 (CFU Mk)、粒巨噬系祖细胞 (CFU GM)、混合系祖细胞 (CFU GEMM)增殖倍数。结果　在 2 1d内 ,3个实验组的NC数 ,CFU GM、CFU Mk、CFU GEMM都有不同程度的增加 ,其中NC、CFU GM在培养的 2 1d达到高峰。CFU Mk、CFU GEMM在培养的 14d达高峰。在含有TPO的实验组中 ,CFU Mk的增殖倍数高于不含TPO的实验组 ,CFU GM、CFU GEMM增殖的倍数也高于不含TPO的实验组。含有CBP的实验组对CFU GM、CFU Mk、CFU GEMM有明显的促增殖作用。结论　CB中的含有丰富的造血干 祖细胞 ,可以在不同细胞因子的刺激下进行定向扩增 ,TPO可以促进干 祖细胞向巨核系分化 ,对粒巨噬系祖细胞也有促进作用。脐血血浆可以作为协同刺激因子促进CB中干 祖细胞增殖。     

人脐血、成人骨髓和小鼠骨髓成纤维细胞系祖细胞培养

自1989年美国Broxmeyer与法国医生合作首次开展脐血造血干细胞移植治疗Fanconis贫血获得成功之后,人们对以往常被丢弃的脐血的基础研究和临床应用研究的兴趣与日俱增。脐血中富含红系祖细胞BFU—E,粒单系祖细胞CFU—GM和巨核系祖细胞CFU-Meg并已基本被肯定,但是否存在成纤维细胞系祖细胞(CFU—F)尚有争     

干扰素-γ对脐血造血干/祖细胞细胞周期蛋白D各亚型表达的影响

体外观察干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)对脐血造血干／祖细胞细胞周期蛋白D(cyclinD)不同亚型表达的影响，以探讨IFN-γ造血抑制的机制。用免疫磁珠阳性分选的方法分离脐带血CD34^ 细胞，并进行体外扩增；用甲基纤维素半固体培养方法，观察IFN-γ对脐血造血干／祖细胞CFU-GM形成的影响；用半定量RT-PCR检测IFN-γ对脐血造血干／祖细胞cyclinD不同亚型表达的影响。结果显示IFN-γ可以显著抑制脐血CFU-GM的形成，并可以从mRNA水平抑制cyclinD2和CyclinD3亚型的表达。由此得出结论，IFN-γ可以显著抑制cyclinD的表达，这可能是IFN-γ介导造血抑制的一种机制。     

造血干细胞的抗原特性

本文综述了近年来有关人和小鼠造血祖细胞各种抗原系统的特点及其鉴别方法,以及在生物学和治疗学方面的有关问题。造血祖细胞在有刺激因子存在的半固体培养中,粒-巨噬祖细胞(CFU-G,M)可形成粒细胞或巨噬细胞,或二者混合组成的细胞集落。在红细胞生成素(Ep)刺激下,红系祖细胞(BFU-E和 CFU-E)可生成红系细胞集落。小鼠多能干细胞是通过受致死剂量照射小鼠的脾脏形成     

骨髓增生异常综合征患者血清造血抑制活性的研究

目的　探讨骨髓增生异常综合征（ＭＤＳ） 患者血清对正常骨髓粒系及红系造血祖细胞的抑制作用。方法　应用甲基纤维素体外培养法,以ＤＮＡ 末端标记及流式细胞术分析观察患者血清体外抑制正常人骨髓造血祖细胞增殖及对正常人造血细胞凋亡的作用。结果　２３ 例患者中有３ 例的血清具有抑制正常骨髓粒系祖细胞生长的作用,４ 例血清具有抑制正常骨髓红系祖细胞生长的作用。４例对正常骨髓红系祖细胞生长有抑制作用的患者中有３ 例患者血清的抑制活性可被抗肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）单克隆抗体中和。２ 例具有抑制正常骨髓红系祖细胞生长活性的血清在体外可促进正常骨髓造血细胞凋亡。结论　部分ＭＤＳ患者血清中存在造血抑制因子,这种抑制因子主要是ＴＮＦα,ＴＮＦα诱导造血细胞凋亡是致部分ＭＤＳ患者无效造血的重要原因