5-脱氧杂氮核苷培养对离体肝癌细胞生长速度及分泌免疫抑制因子活性影响的研究

研究证实,多种恶性肿瘤的发生、发展与基因甲基化有关,即癌细胞基因呈现低甲基化而抑癌基因呈现高甲基化,肿瘤细胞可以通过分泌某些细胞因子即免疫抑制因子来抑制机体正常免疫,从而达到免疫耐受。为探讨纠正癌细胞抑癌基因高甲基化状态对癌细胞分泌免疫抑制因子的影响,进一步证实基因甲基化及其改变在恶性肿瘤发生、发展中的作用,我们于2003年10月进行了本研究。     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷对肺癌SPC-A-1细胞p16、MGMT基因甲基化及其表达的影响

目的观察5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对体外培养的肺癌SPC-A-1细胞p16、MGMT基因启动子区DNA甲基化状态及其表达的影响,探讨肺癌细胞p16、MGMT基因失活的机制及去甲基化制剂对p16、MGMT基因表达的调控。方法 5-Aza-CdR处理体外培养的肺癌SPC-A-1细胞,甲基化特异性PCR（MSP）法检测用药前后细胞p16、MGMT基因的甲基化状态,RT-PCR法检测用药前后细胞p16、MGMT mRNA。结果加入5-Aza-CdR前,SPC-A-1细胞p16、MGMTmRNA表达缺失,其启动子区域表现为DNA甲基化。加入5-Aza-CdR后,SPC-A-1细胞中p16、MGMT基因呈现DNA去甲基化,而且表达缺失的p16、MGMT mRNA重新表达。结论启动子区高甲基化是肺癌细胞p16、MGMT基因失活的主要原因之一,去甲基化制剂5-Aza-CdR能逆转p16、MGMT基因甲基化状态,从而调控p16、MGMT基因表达。     

5-脱氧杂氮胞苷抑癌机制的探讨

5 脱氧杂氮胞苷是一种具有多种特异的生物学性质的核苷类似物 ,由于 5 脱氧杂氮胞苷能选择性地活化真核生物的基因表达 ,甚至可以诱导细胞分化 ,近年来越来越受到重视[1] 。 5 脱氧杂氮胞苷被认为是 ,通过非竞争性地结合到真核生物ＤＮＡ上甲基转移酶的结合位点 ,并阻断甲基转移酶的活性而用于治疗肿瘤。但这一机制尚不能解释 5 脱氧杂氮胞苷治疗肿瘤过程中的所有现象[2 ] 。以往的实验证实 ,ＨｅＰＧ2细胞中甲基转移酶表达明显增高[3 ] 。我们采用 5 脱氧杂氮胞苷处理ＨｅＰＧ2细胞和ＳＭＭＣ 772 1细胞 ,处理前后检测甲基转移酶ｍＲＮ…     

5-脱氧杂氮胞苷抑制肝癌细胞株生物学行为的机制

目的 DNA甲基化模式的改变伴随着永生性细胞系的确立,生长凋控基因CpG岛的重新甲基化可能导致了其转录的不活跃,在体外培养的情况下,使得肿瘤细胞选择了有利于生长的条件．我们用DNA甲基转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷处理两株肝癌细胞,研究其对肝癌细胞的影响,探讨DNA甲基化异常与肝细胞癌间的相关性及5-脱氧杂氮胞苷对肝癌细胞株恶性生物学行为的影响及其机制。方法 用5-脱氧杂氮胞苷处理肝癌细胞株SMMC-7721和HePG2,然后采用相差显微镜观察药物处理前后细胞的形态变化,采用MTT法观察细胞的生长速度变化,采用流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡率、P16蛋白表达的变化．采用RT-PCR法比较p16和甲基转移酶mRNA表达量的变化,比较裸鼠致瘤性的大小。结果 5-脱氧杂氨胞苷处理后细胞形态趋于规则,生长速度减慢．SMMC-7721细胞,G1期细胞增加了8.5％,而s期和G2／M期细胞分别减少了47．8％和10.4％．HePG2细胞,G1期细胞增加了3．5％,S期减少了46．2％．G2／M期增加了23．7％．两细胞凋亡率分别增加了91．6％和133．3％．P16蛋白表达分别增加了23．4％和20.9％,p16mRNA表达增高,而DNA甲基转移酶mRNA表达明显降低,裸鼠皮下移植瘤生长减慢。结论 肝细胞癌的发生与DNA甲基化异常有关,甲基化酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷可能通过抑制甲基转移酶抑制抑癌基因启动子区域的高甲基化,恢复其生长调控功能,从而使肝癌细胞株的恶性生物学行为发生逆转。     

5-Aza—CdR对胃癌细胞系BGC823生长及p27kip1基因异常甲基化的影响

选择浓度为1×10-6mol/L的5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理体外培养的BGC823细胞后,用AO染色检测药物处理后细胞增殖情况;MSP法检测用药前后细胞中Apaf-1基因的甲基化状态;RT-PCR法检测用药前后细胞中p27kipl的mRNA表达的变化.结果 显示,药物作用细胞增殖明显受到抑制,p27kipl基因的甲基化状态得到了逆转,p27kipl基因的mRNA表达得到增加.认为5-Aza-CdR对BGC823细胞具有增生抑制作用,p27kipl基因的表达情况与其甲基化状态的改变有关.     

5-杂氮-2'-脱氧胞苷诱导裸鼠HepG2种植瘤细胞T-cadherin的表达及其对种植瘤的抑制作用

目的: 探讨去甲基化药物5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)在裸鼠体内诱导HepG2细胞T-cadherin的表达,及其对HepG2种植瘤生长的抑制作用.方法:皮下接种法建立HepG2细胞裸鼠种植瘤模型,随机分为实验组(11只)和对照组(10只).实验组裸鼠给予5-Aza-CdR注射,对照组裸鼠注射等量PBS.4wk后处死裸鼠,观察种植瘤的生长情况,用RT-PCR技术及免疫组织化学技术检测T-cadherin mRNA及蛋白的表达.结果:用药4wk后,实验组肿瘤组织的T-cadherin mRNA的表达水平显著高于对照组(t=6.613, P<0.05);对照组HepG2细胞几乎检测不到T-cadherin蛋白表达,而实验组裸鼠种植瘤细胞膜上可检测到T-cadherin蛋白表达;实验组肿瘤的平均体积明显小于对照组肿瘤平均体积(t=2.337,P=0.025).结论:5-Aza-CdR能诱导裸鼠皮下种植HepG2瘤细胞的T-cadherin表达,抑制HepG2种植瘤的生长,其机制可能为5-Aza-CdR使甲基化的T-cadherin启动子去甲基化,恢复T-cadherin的表达,从而抑制HepG2种植瘤生长.     

5-Aza-CdR对胃癌细胞系BGC823生长及p27 kipl基因异常甲基化的影响

选择浓度为1×10-6mol/L的5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理体外培养的BGC823细胞后,用AO染色检测药物处理后细胞增殖情况;MSP法检测用药前后细胞中Apaf-1基因的甲基化状态;RT-PCR法检测用药前后细胞中p27kipl的mRNA表达的变化.结果 显示,药物作用细胞增殖明显受到抑制,p27kipl基因的甲基化状态得到了逆转,p27kipl基因的mRNA表达得到增加.认为5-Aza-CdR对BGC823细胞具有增生抑制作用,p27kipl基因的表达情况与其甲基化状态的改变有关.     

NKG5SV裸基因抑制裸鼠体内人肝癌细胞生长及转移

目的 研究NKG5SV裸基因直接注射抗肝细胞肝癌生长及转移复发的作用。方法 以常规方法将NKG划SV装入逆转录病毒载体,扩增捉取NKG5裸基因,以LacZ为对照基因。将不同裸基因和生理盐水与LCI-D20裸鼠人肝癌同时皮下接种或待LCI-D20肿瘤成瘤后瘤内注射,观察对肿瘤成瘤和生长的影响。LCI-D20肿瘤裸鼠皮下接种后10d,分别瘤内注射不同裸基因,观察对肿瘤生长转移的影响。LC1-D20肿瘤肝内接种,接种后22d行肝癌切除术,术中经切缘或脾内注射不同裸基因,观察其对术后转移复发的影响。结累 不同裸基因与LCI-D20肝癌同时皮下接种对照组、LacZ组、NKG5SV组,肿瘤直径(cm)分别为1.76±0.11、1.51±0.34、0.33±0.04。裸基因肿瘤内注射对照组、LacZ细胞组、NKG5SV组,肿瘤直径(cm)分别为0.87±0.08、0.83±0.05、0.26±0.04。瘤重(g)分别为0.43±0.06、0.38±0.04、0.08±0.06。肝癌切除术中应用裸基因转移灶累及部位数、切缘复发瘤直径、肝内转移灶数目、转移灶累及肝叶数在对照组、LacZ组、NKG5SV组分别为,切缘注射肝外转移灶数目(个):4.25±1.48、4.25±1.04、0.63±0.51,切缘肿瘤直径(cm):1.51±0.27、1.35±0.17、0.81±0.17,肝内转移灶数目(个)2.50±1.41、2.38±1.06、1.25±0.71,转移灶累及肝叶数(个):2.13±0.99、2.     

5-氮杂胞苷上调miR-27b-5p表达对模拟失重下血管内皮细胞凋亡的影响

目的 探究5-氮杂胞苷（5-azacytidine, 5-AZA）对模拟失重效应下血管内皮细胞miR-27b-5p表达及细胞凋亡的影响。 方法 体外培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）,利用MTT试剂盒检测不同浓度5-AZA（0.1 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L和100 μmol/L）对HUVECs的毒性作用。采用qRT-PCR技术观察模拟失重环境下miR-27b-5p表达的时程变化及5-AZA药物处理对miR-27b-5p表达的影响;Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Cleaved Caspase-3的表达,观察5-AZA在回转模拟失重效应下对HUVECs凋亡的影响。 结果 5-AZA对HUVECs的细胞毒性呈浓度依赖性。与对照组相比,0.1 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L组的细胞存活率无统计学差异,50 μmol/L 5-AZA组和100 μmol/L5-AZA组的细胞存活率显著降低（P<0.05）。因此,我们采用10 μmol/L作为后续实验5-AZA的加药浓度。在回转模拟失重效应下,HUVECs的miR-27b-5p表达显著下降（P<0.05）,且随回转时间的延长而下降程度增大（P<0.05）。qRT-PCR检测结果提示,5-AZA可显著上调模拟失重效应下HUVECs中miR-27b-5p表达（P<0.05）。Western blot检测结果提示,5-AZA可显著下调模拟失重效应下HUVECs中Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达（P<0.05）,上调Bcl-2蛋白表达（P<0.05）。 结论 5-AZA通过上调miR-27b-5p表达,抑制模拟失重效应下HUVECs凋亡的发生。     

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对人胃癌SGC-7901细胞株生长及EDNRB基因启动子异常甲基化的影响

目的:探讨去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人胃癌细胞系SGC-7901细胞株的生长及EDNRB基因启动子异常甲基化的影响.方法:使用1、2、5、10μmol/L5-Aza-CdR干预胃癌SGC-7901细胞,甲基化特异性PCR(MSP)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测药物干预前后EDNRB基因的甲基化状态和EDNRB mRNA的表达,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术分析细胞周期及细胞凋亡的改变.结果:未经5-Aza-CdR处理的SGC-7901细胞中EDNRB基因启动子区域CpG岛高甲基化,且EDNRB mRNA不表达,经1、2、5、10μmol/L5-Aza-CdR处理4d后,EDNRB基因启动子区域高甲基化状态得到逆转,细胞中EDNRB mRNA表达恢复.4种浓度5-Aza-CdR处理的SGC-7901细胞后,细胞增殖受到抑制,且呈时间和剂量依赖性;并抑制SGC-7901细胞生长周期,其细胞周期阻滞于S期,5、10μmol/L5-Aza-CdR实验组细胞凋亡率显著高于对照组,且差异有统计学意义(7.13%±0.87%,13.34%±1.12% vs 3.69%±...     

野生型p53基因对胃癌细胞生长及端粒酶活性的影响

本研究在确认存在 ｐ5 3基因突变和端粒酶阳性的胃癌细胞体外培养的条件下 ,观察野生型 ｐ5 3基因转染对胃癌细胞生长和端粒酶活性的影响 ,探讨二者变化的关系 ,同时观察野生型 ｐ5 3基因转染对胃癌细胞增殖与凋亡的影响 ,并分析细胞动力学改变与端粒酶活性的关系 ,从而探讨野生型ｐ5 3基因转染影响胃癌细胞生长的机制。一、材料与方法1.细胞 :中分化的人胃腺癌转移细胞ＳＧＣ790 1细胞株由中山医科大学动物实验中心提供。2 .真核表达载体ＰＣＥＰ4 /ｐ5 3、ＰＣＥＰ4 的扩增 ,纯化和酶切鉴定。3.基因转染 :胃癌ＳＧＣ790 1细胞株用含 15 %…     

5-氮杂-2’-脱氧胞苷对胰腺癌细胞PANC1的组织因子途径抑制物-2表达及CpG岛甲基化的影响

目的 探讨甲基化酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-dC)对胰腺癌细胞系PANCI的抑癌基因组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor 2,TFPI-2)甲基化水平及基因表达的影响.方法 应用1×10-7、5 × 10-7、1×10-6mol/L的5-Aza-dC处理胰腺癌细胞系PANCI.用甲基化特异性PCR(MSP)、RT-PCR及蛋白质印迹法检测细胞TFPI-2基因的甲基化状态、mRNA及蛋白的表达.结果 未经5-Aza-dC处理的PANCI细胞的TFPI-2基因CpG岛为完全甲基化,无TFPI-2 mRNA及蛋白的表达.1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L的5-Aza-dC处理后,PANC1细胞的TFPI-2基因CpG岛甲基化逆转,从不完全甲基化到完全非甲基化;TFPI-2 mRNA相对表达量分别为0.211±0.087、0.327 ±0.068、0.609±0.017;TFPI-2蛋白相对表达量为0.429±0.121、0.675±0.044、1.132±O,124,呈剂量依赖性增加(P＜0.05).结论 胰腺癌细胞系PANC1的TFPI-2启动子高甲基化可能是导致该基因表达下调甚至失活的主要原因.5 -Aza-dC能够逆转其高甲基化状态,并诱导TFPI-2 mRNA及蛋白重新表达.     

5-Aza-CdR对胃癌细胞系BGC823生长及DAPK1基因甲基化的影响

目的观察5．氮杂-2-脱氧胞苷（5-Aza-CaR）对体外培养的胃癌BGC823细胞增生和凋亡的影响及其对此细胞中DAPK1基因的甲基化状态的影响。方法选择浓度为1×10^-6的5-Aza-CdR处理体外培养的BGC823细胞后,用Annexin—v—FITC凋亡检测药物处理后细胞凋亡情况;MSP法检测用药前后细胞中Apaf-1基因的甲基化状态;RT—PCR法检测用药前后细胞中DAPKI的mRNA表达的变化。结果在药物作用24、48、72h后细胞的凋亡率分别为5．83±0．53、9．23±0．58、15．34±0．90,较对照组明显增加（P〈0．05）。DAPK1基因的甲基化状态得到了逆转,DAPK-1基因的mRNA表达得到增加。结论5-Aza—CdR对BGC823细胞具有增生抑制作用,并促进细胞凋亡。DAPK1基因表达情况与其甲基化状态的改变有关。     

5-氮杂胞苷抑制肝癌细胞恶性表型和逆转甲基化状态的作用及机制

目的:探讨DNA异常甲基化与肝细胞肝癌间的相关性及5-氮杂胞苷(5-aza-CR)抑制肝癌细胞恶性表型和逆转甲基化状态的作用及其机制.方法:用5-aza-CR处理肝癌细胞株HuH-7和裸鼠移植瘤模型,然后用相差显微镜观察药物处理前后细胞形态变化,MTT法观察细胞生长速度变化,流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡率,甲基化特异性PCR(MSP)检测p16基因5'CpG岛甲基化状态,RT-PCR法检测p16 mRNA的表达情况.结果:5-aza-CR对肿瘤细胞HuH-7和裸鼠移植瘤细胞均有明显的抑制作用;实验组HuH-7细胞周期G0/G1期延长41.1%±3.2%,S期缩短39.0%±1.4%.G2期缩短2.2%±0.7%,凋亡细胞增加30.0%±4.5%;裸鼠移植瘤细胞周期G0/G1期延长27.4%±3.1%,S期缩短25.8%±2.1%,G2期缩短1.6%±1.8%,凋亡细胞增加2.9%±0.6%;对照组HuH-7与裸鼠细胞仅甲基化引物扩增出特异PCR条带,实验组HuH-7细胞仅非甲基化引物扩增出特异PCR条带,而实验组裸鼠细胞甲基化和非甲基化引物均扩增出特异PCR条带;实验组肿瘤细胞HuH-7和裸鼠移植瘤细胞的p16 mRNA均有表达,而对照组则无表达.结论:5-aza-CR在体外和体内均有抑制肝癌细胞生长、阻滞细胞周期G1/S和促进p16 mRNA表达的作用:5-aza-CR可抑制肝癌细胞恶性表型和逆转p16甲基化状态.     

甘草酸对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化肝组织p53蛋白表达的影响

目的：探讨甘草酸对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化肝组织p53蛋白表达的影响。方法45只雄性SD大鼠随机均分为对照组、肝纤维化组和甘草酸干预组3组,每组各15只。肝纤维化组和甘草酸干预组构建四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型,对照组大鼠注射等量的橄榄油。甘草酸干预组大鼠以0．2％甘草酸溶液予腹腔注射,3 ml／只,3次／周;对照组大鼠予等量双蒸水替代。3组于实验第1、4、8周各处死5只大鼠,取肝组织行HE染色检测纤维化情况,采用免疫组织化学和Western印迹定量分析检测p53蛋白在大鼠肝组织内的表达情况。采用单因素方差分析比较各组大鼠实验第1、4、8周p53蛋白表达量差异,进一步组间两两比较采用LSD-t检验。结果实验第1周,3组大鼠肝组织p53蛋白表达量差异无统计学意义;实验第4、8周,肝纤维化组大鼠肝组织中p53蛋白表达量均较对照组大鼠升高,而甘草酸干预组大鼠肝组织中p53蛋白表达量均较肝纤维化组大鼠降低,且差异均有统计学意义（实验第4周：t值分别为2．39、2．74;实验第8周：t值分别为1．58、7．79;P值均为0．000）。结论甘草酸可减缓肝纤维化进程,其分子机制可能与p53蛋白的表达下调有关。     

p16及p53蛋白在前列腺癌中的表达及意义

目的探讨p16及p53蛋白在前列腺癌中的表达及意义。方法应用免疫组化方法检测p16及p53蛋白在58例前列腺癌和20例良性前列腺增生症中的表达状况。结果p16在前列腺癌中阳性率为72．4％,在前列腺增生症中的阳性率为25．0％,两组差异有有统计学意义（P〈0．01）。p53在前列腺癌中的阳性率为29．3％,在前列腺增生症中的阳性率为15．0％、染色强度弱于前列腺癌,两组阳性率无统计学差异。053表达与Gleason评分呈正相关（r=0．334,P=0．011）。结论p53及p16可能与前列腺癌的发生有关。     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷对胃癌AGS细胞CHFR基因去甲基化作用及意义

目的观察5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对胃癌AGS细胞CHFR基因去甲基化的作用,并探讨其临床意义。方法分别采用BSP和RT-PCR技术检测5-Aza-CdR处理前后胃癌AGS细胞CHFR基因启动子甲基化状态及其mRNA。结果 AGS细胞CHFR基因启动子在5-Aza-CdR处理前呈现高甲基化状态（甲基化率≥60%）,其mRNA表达完全缺失;5-Aza-CdR处理后则表现为低或无甲基化状态（甲基化率≤20%）,其mRNA表达恢复正常。结论 CHFR基因启动子在AGS细胞中呈高甲基化状态,5-Aza-CdR能显著逆转其CHFR基因异常甲基化,诱导CHFR基因表达,为胃癌的治疗提供新思路。     

外源性野生型p53基因对人肺癌细胞生长的抑制

目的观察外源性野生型ｐ５３基因对有ｐ５３基因突变的人肺癌细胞系生长的影响。方法用多聚酶链反应单链构象多态性及ＤＮＡ测序，选择ｐ５３基因突变的人肺巨细胞癌系８０１Ｄ为受体细胞。构建野生型ｐ５３表达质粒ＰＺＩＰｎｅｏＳＶｐ５３。用基因枪介导外源基因。建立转染细胞系８０１Ｄｐ５３。用聚合酶链反应检测外源基因，观察转染细胞恶性生长的变化。结果转染细胞系８０１Ｄｐ５３体外长期传代有ｎｅｏ基因及外源ｐ５３基因存在，转染细胞生长明显受到抑制，克隆形成抑制率达９６％，裸鼠异种移植致瘤性降低，肿瘤生长明显缓慢。结论外源性野生型ｐ５３经基因枪导入有ｐ５３基因突变的人肺癌细胞后可长期存在于转染细胞中，且明显抑制转染细胞的恶性生长     

5-Aza-dC和TSA对胃癌细胞系p16和hMLH-1基因甲基化水平及表达的影响

目的:探讨5-Aza-dC及TSA对胃癌细胞系中抑癌基因p16和hMLH-1基因甲基化水平和基因表达的影响.方法:5-Aza-dC及TSA处理体外培养的MKN-45细胞和MGC-803细胞,应用逆转录PCR(RT-PCR)法及甲基化特异性PCR(MSP)法分别检测两株细胞药物干预前后抑癌基因p16和hMLH-1的表达及甲基化情况.结果:MKN-45和MGC-803细胞系经TSA,5-Aza-dC及联合作用后使原来不表达或有弱表达的抑癌基因p16和hMLH-1重新表达或表达增强.胃癌细胞系MKN-45和MGC-803均显示p16、hMLH-1基因启动子区存在高甲基化,其中p16基因在两种胃癌细胞系中均表现为甲基化,hMLH-1基因在胃癌细胞系MGC-803中表现为甲基化而在胃癌细胞系MKN-45中表现为半甲基化.在5-Aza-dC及TSA的作用下,MKN-45和MGC-803细胞系中p16及hMLH-1基因的甲基化状态得到逆转.结论:胃癌细胞系中抑癌基因p16和hMLH-1基因启动子甲基化可能是导致其基因失活的主要原因,5-Aza-dC单独作用和5-Aza-dC及TSA联合应用效果相似,均能显著增强甲基化的肿瘤抑制基因的重新表达.     

5-杂氮2’-脱氧胞苷对白血病K562细胞株SHP-1和JAK2基因表达的影响及意义

目的探讨白血病的发病机制及有效治疗方法。方法用RPMI1640培养基对白血病细胞株K562进行传代培养，用0．5,2、5μmol／L的5-杂氮-2’-脱氧胞苷（5-aza—Cdn）对其进行处理，于24、48、72h收取细胞，用实时定量PCR法检测SHP-1和JAK2 mRNA表达水平。结果5-az8-CdR作用于K562细胞株后随作用时间延长和浓度升高，SHP-1 mRNA表达水平升高，JAK2 mRNA表达水平降低。二者呈负相关。结论5-aza—CdR可抑制肿瘤的发生，其可能通过抑制JAK／STAT通路发挥作用。