经人巨细胞病毒感染人脐血造血干细胞向粒-巨噬系和红系祖细胞增殖过程中HOXB6-mRNA及其基因表达

背景:造血祖细胞被人巨细胞病毒(HCMV)感染后增殖和分化能力受到抑制是否与受染细胞增殖的基因异常表达有关联?目的:观察经人类巨细胞病毒感染的人类造血干祖细胞向粒-巨噬系、红系祖细胞增殖过程中HOXB6mRNA表达.设计:观察对比实验.单位:泸州医学院附属医院分子生物学实验室.材料:所有脐血标本由泸州医学院附属医院产科提供,取自正常足月顺产新生儿断脐后的胎盘段脐血.所有新生儿母亲HBSAg阴性,常规ELISA检测抗HCMV-IgM及PCR检测HCMV-DNA均为阴性,且对本实验知情同意,实验经过医院伦理委员会批准.HCMV-AD169株由中国预防医学科学院病毒研究所提供.全反式维甲酸(ATRA)为重庆华邦制药股份有限公司产品,批号为20010126.方法:实验于2006-04/2007-04在泸州医学院附属医院分子生物学实验室完成.分离脐血单个核细胞,进行造血祖细胞培养.根据实验干预方式不同将细胞分为4组:[1]对照组:与HCMV组等量的IMDM培养液进行细胞培养.[2]HCMV组:HCMV-AD169滴度为105pfu,以0.1mL感染培养体系.[3]ATRA组:在培养体系分组中加入12μL ATRA,终浓度为60μmol/L.[4]HCMV ATRA组:在HCMV感染组中加入ATRA,终浓度同ATRA组.主要观察指标:分别于培养后3,7,12天收获各组细胞,采用实时荧光定量PCR技术分别检测脐血粒-巨噬系祖细胞和脐血红系祖细胞HOXB6 mRNA表达水平.结果:[1]对照组红系祖细胞和粒-巨噬系祖细胞均表达HOXB6-mRNA,随着时间推移,表达水平增加,其中,脐血红系祖细胞表达HOXB6-mRNA于第12天达高峰,脐血粒-巨噬系祖细胞HOXB6-mRNA于第7天达高峰.[2]HCMV组脐血粒-巨噬系祖细胞、红系祖细胞感染人巨细胞病毒后各时间点HOXB6基因表达均低于对照组,差异有显著性意义(P<0.05).[3]ATRA组各时间点脐血粒-巨噬系祖细胞、红系祖细胞HOXB6-mRNA表达均高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05).[4]HCMV ATRA组各时间点红系祖细胞及粒-巨噬系祖细胞的HOXB6-mRNA表达均高于人巨细胞病毒组,差异有显著性意义(P<0.05~0.01).结论:[1]人类造血干祖细胞向粒单系和红系祖细胞增殖分化过程中,HOXB6-mRNA呈现持续稳定的表达.[2]人巨细胞病毒能使HOXB6基因表达下调.[3]ATRA能上调HOXB6基因的表达.     

9顺维甲酸、全反式维甲酸诱导肺腺癌细胞株PG分化与凋亡的比较研究

维甲酸类化合物 (retinoids,RA)有调控细胞生长、分化、凋亡的重要作用。RA在体内的生理活性代谢产物包括全反式维甲酸 (ATRA)、1 3 顺维甲酸 (1 3 cis RA)和 9 顺维甲酸 (9 cis RA)。ATRA能抑制支气管上皮细胞的生长和鳞状分化 ,但体外实验表明大多数人肺癌细胞株对ATRA有显著的抗性作用。 9 cis RA比ATRA作用更广泛 ,副作用更小而倍受瞩目[1 3 ] ,为了解ATRA和 9 cis RA对肺癌细胞生长和分化的影响 ,我们比较了 9 cis RA和全反式维甲酸对肺腺癌细胞PG株细胞周期和凋亡的影响。1　材料与方法1 .1　材料　 9 cis RA、胎牛…     

全反式维甲酸在成人慢性粒单核细胞白血病的应用:初步研究结果

儿童慢性髓细胞白血病(JCML)具有CFU-GM自发增殖以及对GM-CSF敏感的特性,13-顺式维甲酸(RA)在体外能够抑制CFU-GM自发增殖,并且在以往研究中对于半数JCML病人,RA能够减少白细胞计数及器官肿大。成人慢性粒单核细胞白血病(CMML)与JCML有许多临床及血液学相似之处,包括CFU-GM在体外自发增殖。作者应用全反式维甲酸(ATRA)在10例晚期成人CMML做了体内试验,对其中5例同时做了体外研究。     

全反式维甲酸对脐血红系祖细胞Hoxb2、Hoxb4基因表达的影响

本研究探讨全反式维甲酸（ATRA）对人脐血造血干细胞向红系定向增殖分化过程进行干预后hoxb2、hoxb4基因表达的影响。取12例正常足月顺产新生儿断脐后的胎盘段脐血,采用造血干细胞体外培养技术及FQ—RT—PCR方法．以6×10μmol／L的ATRA干预人脐血造血干细胞向红系定向增殖分化的过程,进而检测空白对照组、ATRA组在培养的第3天、第7天和第10天红系祖细胞hoxb2、hoxb4基因表达情况。结果表明：本实验各组的hoxb2、hoxb4基因在第3天时开始少量表达,在第7天表达明显升高,而在第10天表达最强烈。在空白对照组中,第3天、第7天、第10天hoxb4基因相对表达量较hoxb2高。与空白对照组相比较,ATRA组Hoxb2、Hoxb4基因表达量明显增加。结论：hoxb2、hoxb4基因在脐血HSC向红系定向增殖分化过程中（体外）均有表达,说明hoxb2、hoxb4均与红系造血有相关性,且与hoxb2相比,可能hoxb4与红系造血相关性较大;6×10μmol／L的ATRA能显著上调正常红系祖细胞hoxb2、hoxb4基因的表达。     

丝裂原激活蛋白激酶信号转导系统对维甲酸诱导NB4细胞分化的影响

本研究观察丝裂原活化蛋白激酶对全反式维甲酸（ATRA）诱导NB4细胞分化的影响并探讨其机制。采用MTT法测定细胞增殖活性，用流式细胞术分析细胞周期，NBT还原实验检测粒系分化，底物磷酸化法测定细胞外调节激酶（ERK）活性。结果显示：0．01—0．1μmol／L的ATRA呈时间和剂量依赖方式抑制NB4细胞增殖，并诱导NB4细胞向粒系分化；在这过程中ATRA激活ERK活性，ERK抑制剂PD98059能部分阻断ATRA的作用。p38MAPK的特异抑制剂SB203580与ATRA联合应用部分阻断了ATRA对细胞的生长抑制和诱导分化作用。结论：ATRA在诱导NB4细胞分化过程中激活ERK和P38MAPK途径，并且对该途径有依赖作用。     

丝裂原激活蛋白激酶信号转导系统对维甲酸诱导NIM细胞分化的影响

本研究观察丝裂原活化蛋白激酶对全反式维甲酸(ATRA)诱导NB4细胞分化的影响并探讨其机制。采用MTT法测定细胞增殖活性,用流式细胞术分析细胞周期,NBT还原实验检测粒系分化,底物磷酸化法测定细胞外调节激酶(ERK)活性。结果显示:0.01-0.1μmol/L的ATRA呈时间和剂量依赖方式抑制NB4细胞增殖,并诱导NB4细胞向粒系分化;在这过程中ATRA激活ERK活性,ERK抑制剂PD98059能部分阻断ATRA的作用。p38MAPK的特异抑制剂SB203580与ATRA联合应用部分阻断了ATRA对细胞的生长抑制和诱导分化作用。结论:ATRA在诱导NB4细胞分化过程中激活ERK和P38MAPK途径,并且对该途径有依赖作用。     

脐血造血干/祖细胞体外定向诱导扩增的研究

目的　观察不同因子组合在体外对脐血 (CB)中的巨核系等造血祖细胞的诱导扩增作用。方法　用体外液体悬浮培养法 ,将白细胞介素 3(IL 3)、白细胞介素 6 (IL 6 )、血小板生成素 (TPO)、脐血血浆 (CBP)作为刺激因子 ,添加不同的细胞因子组合 ,对CB的单个核细胞 (MNC)短期培养 2 1d。在培养的 0、7、14、2 1d检测新鲜细胞和培养细胞中的有核细胞数 (NC)、巨核系祖细胞 (CFU Mk)、粒巨噬系祖细胞 (CFU GM)、混合系祖细胞 (CFU GEMM)增殖倍数。结果　在 2 1d内 ,3个实验组的NC数 ,CFU GM、CFU Mk、CFU GEMM都有不同程度的增加 ,其中NC、CFU GM在培养的 2 1d达到高峰。CFU Mk、CFU GEMM在培养的 14d达高峰。在含有TPO的实验组中 ,CFU Mk的增殖倍数高于不含TPO的实验组 ,CFU GM、CFU GEMM增殖的倍数也高于不含TPO的实验组。含有CBP的实验组对CFU GM、CFU Mk、CFU GEMM有明显的促增殖作用。结论　CB中的含有丰富的造血干 祖细胞 ,可以在不同细胞因子的刺激下进行定向扩增 ,TPO可以促进干 祖细胞向巨核系分化 ,对粒巨噬系祖细胞也有促进作用。脐血血浆可以作为协同刺激因子促进CB中干 祖细胞增殖。     

脐血造血干/祖细胞免疫表型的流式细胞术双标法分析及其意义

目的比较脐血和骨髓中造血干/祖细胞(HSPC)的免疫表型差异.方法使用流式细胞术(FCM)双标法对38份脐血及10份骨髓HSPC进行免疫表型分析.结果①脐血有核细胞中CD34+细胞所占比例与骨髓中相近,约为0.5%;②脐血CD34+细胞中CD34+CD38-[(17.C4±5.37)%]、CD34+HLA-DR-[(32.65±10.71)%]及CD34+H-CAM+(CD44+)[(77.84±7.69)%]亚群含量均高于骨髓[含量分别为(8.26±3.19)%、(14.05±1.67)%和(70.02±6.40)%],CD34+CD13+、CD34+CD19+亚群比例低于骨髓.结论脐血与骨髓CD34+细胞比例相近,但前者较原始的干细胞含量更高,故脐血是极具潜力的HSPC来源;而脐血CD34+细胞中髓系及淋系祖细胞含量低于骨髓,可能是脐血移植后造血及免疫重建缓慢的原因之一.     

人巨细胞病毒感染对脐血红系祖细胞发育过程中Hoxb2,Hoxb4基因表达的影响

背景:人巨细胞病毒感染可损害造血系统,甚至造成骨髓衰竭.人巨细胞病毒感染抑制红系祖细胞增殖和分化,是否与受染红系祖细胞增殖的基因异常表达有关?目的:观察人巨细胞病毒和/或全反式维甲酸对人脐血造血干细胞向红系祖细胞定向增殖分化过程进行干预后Hoxb2、Hoxb4基因表达的变化.方法:取12例正常足月顺产新生儿断脐后的胎盘段脐血,采用造血干细胞体外培养技术及实时荧光定量聚合酶链反应方法,以人巨细胞病毒-AD169和(或)6×10-8 mol/L的全反式维甲酸持续干预人脐血造血干细胞向红系定向增殖分化过程,检测空白组、全反式维甲酸组、人巨细胞病毒组、全反式维甲酸+人巨细胞病毒组在培养第3,7,10天红系祖细胞Hoxb2、Hoxb4基因的表达情况.结果与结论:各组Hoxb2、Hoxb4基因均在增殖分化的第3天已有表达,第7天表达明显增加,第10天表达最强烈.与空白组相比,人巨细胞病毒组明显下降;与人巨细胞病毒组相比,全反式维甲酸+人巨细胞病毒组的Hoxb2、Hoxb4基因表达量明显增加(P < 0.05).提示人巨细胞病毒可能通过调控Hoxb2、Hoxb4基因异常表达而引起造血功能异常;Hoxb2、Hoxb4均与红系造血有相关性;6×10-8 mol/L全反式维甲酸能显著上调正常红系祖细胞Hoxb2、Hoxb4基因的表达,也能上调经人巨细胞病毒感染的红系祖细胞Hoxb2、Hoxb4基因的表达.     

维生素D3代谢物对造血系统的调节作用及其临床应用

维生素D_3(VitD_3)代谢物有20余种,其中1,25二羟基维生素D_3[1,25(OH_2)D_3]活性最强。近来研究表明,VitD_3代谢物除维持机体钙离子稳定和促进骨骼重吸收作用外,还具有诱导细胞分化、抑制细胞增生、拮抗胶原形成、调节原癌基因表达以及免疫调节等功能,其用于治疗白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)和骨髓纤维化(MF)已获初步效果。本文复习近年资料,对上述问题作一概述。一.VitD_3代谢物对正常骨髓及血细胞增殖、分化和功能调节体外实验证明,1,25(OH)_2D_3促进正常人骨髓粒-单系祖细胞(CFU GM)增殖,但对红系祖细胞(CFU-E、BFU-E)、巨核系祖细胞(CFU-MK)和多向系祖细胞(CFU-mix)的增殖有抑制作用。在骨髓细胞的半固体培养系统中,加入2×10~9和2×10~8M的     

顺式维甲酸治疗幼年型慢性髓细胞白血病的探索性研究

幼年型慢性髓细胞白血病(CML)是一种婴幼儿中少见的骨髓增殖性疾病,除异基因骨髓移植外无有效的治疗方法。在体外,13-顺式维甲酸抑制外周血祖细胞(CFU-GM)的自发性增殖和选择性抑制其对粒-单细胞刺激因子(GM-CSF)的敏感性。本文对13-顺式维甲酸治疗幼年型CML的临床疗效     

人脐血红系祖细胞体外培养观察

<正>脐血代替骨髓移植重建造血的成功,已引起人们对脐血造血功能研究的兴趣。笔者等曾在国内首先报告了脐血粒—单核系祖细胞(CFU-GM)体外培养观察,证实人脐血富含粒单核细胞系造血干/祖细胞。通过进一步以体外甲基纤维素法培养人脐血的红系祖细胞,包括红系集落形成单位(CFU-E)和爆式红系形成单位(BFU-E),笔者观察了人脐血红系祖细胞造血情况,现将结果报告如下。     

人脐血清造血刺激活性的检测

通过半固体培养法(甲基纤维素法和琼脂培养法)和液体长期培养等方法,观察了脐血清和成人血清对正常小鼠骨髓细胞的影响。结果表明:①脐血清EPO活性高于成人血清,红系祖细胞产率分别为23.2±5.4/1×10~5细胞和3.0±1.3/1×10~5细胞,差异非常显著;对PHA刺激的小鼠脾细胞培养液的活性,脐血清抑制作用较低;②以脐血清作为外源性刺激因子,可形成粒单系祖细胞21.7±16.8集落和丛/1×10~5细胞,用成人血清仅见个别小丛1.1±1.2丛/1×10~5细胞;③脐血清可促进成纤维系祖细胞(CFU-F)增殖与分化,其产率为36.0±29.7/1×10~6细胞,明显高于成人血清。提示:脐血清不仅含有丰富的红系、粒单系、巨核系祖细胞,而且造血活性也高于成人血清,因而脐血输注和移植将有广阔前景。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂对HL-60细胞和K562细胞的抗肿瘤作用

为了观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸（VPA）、曲古抑菌素（TSA）对K562细胞和HL-60细胞的抗肿瘤作用以及它们同全反式维甲酸（ATRA）之间的协同效应,采用绘制细胞生长曲线,计算半数抑制浓度（IC50）以及集落抑制试验等方法观察VPA,TSA以及全反式维甲酸（ATRA）在不同浓度或不同组合条件下对HL-60细胞和K562细胞的增殖抑制作用.采用细胞化学染色、分化抗原检测、细胞周期测定、联合NBT与MTT还原试验计算A（NBT）/A（MTT）值等方法分析细胞的分化或凋亡特点.结果显示,在体外培养体系中,VPA对HL-60细胞的IC50值低于对K562细胞的IC50值.ATRA能明显增强VPA、TSA对HL-60细胞以及VPA对K562细胞集落形成的抑制.HL-60经VPA处理后出现粒系表型,NBT还原率增加,CD11b表达增强,而K562细胞未显示分化迹象.结论：VPA和TSA抑制HL-60细胞增殖,VPA诱导HL-60细胞向粒系分化,这些作用均能被ATRA增强;VPA和TSA对K562细胞增殖抑制作用较弱,不能诱导K562细胞分化.     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为肾小球系膜样细胞

目的:探讨血小板衍生生长因子(PDGF-BB)和全反式维甲酸(ATRA)在体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为肾小球系膜样细胞的效果.方法:分离培养人骨髓间充质干细胞,在培养液中添加300 ng/mLPDGF-BB,2μmol/L ATRA进行诱导分化,对分化后的细胞进行鉴定.结果:经过7 d诱导分化后,细胞呈现典型的肾小球系膜细胞形态,波形蛋白基因,结蛋白基因与α-平滑肌肌动蛋白基因及相应的蛋白在分化组均有很强的阳性表达.结论:PDGF-BB和ATRA能够有效地在体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为肾小球系膜样细胞.     

骨髓增生异常肿瘤的骨髓微环境促进疾病发生发展的机制北大核心CSCD

骨髓增生异常肿瘤(myelodysplastic neoplasms,MDS)是一种以造血干细胞克隆增殖、骨髓增生异常、无效造血、外周血细胞减少,高风险发展为急性髓系白血病(AML)为特征的恶性疾病[1]。基因和表观遗传学变化及异常的骨髓微环境以多步骤和克隆进化的方式促成MDS或AML的转化[2]。但是,携带MDS常见基因突变的造血干祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cells,HSPC)无独立的细胞自主增殖能力,并不能单独为恶性克隆提供增殖优势[3]。因此骨髓微环境的变化及其与HSPC的双向交流被认为在启动MDS的发生和支持肿瘤克隆的发展中起到关键作用。     

无血清培养体系对脐带血CD34~+细胞定向红系分化影响的比较

目的:通过3种无血清红系定向诱导分化培养体系比较,优化培养体系诱导脐带血干/祖细胞(HSPC)体外红系定向分化,以满足基础研究与临床应用。方法:应用磁珠分选脐带血单个核细胞中的CD34~+细胞;分别接种到3种培养体系(1、2、3)中并采用3阶段培养法诱导CD34~+细胞红系定向分化,在分化不同阶段进行细胞计数,瑞氏吉姆萨染色,应用流式细胞术检测细胞表面CD71、CD235a的表达,集落形成能力检测鉴定红系分化的进程。结果:体系2促HSPC增殖能力最强,体系3促红系分化效果最佳。体系2培养的细胞增殖能力均明显高于体系1、2(P 0.05);FACS分析显示,红系表面分子CD71、CD235a在体系3培养的细胞表面表达最高,分化d 15 CD235a+百分率高达(92.23±3.89)%,体系2为(84.67±3.12)%,体系1为(72.17±6.83)%(P 0.05);细胞形态学染色显示,体系3培养的细胞在分化d 12的晚幼红细胞比例为(67.67±2.08)%,是体系2的10.69倍、体系1的25.34倍(P 0.05);造血集落形成实验发现在体系3中d 3-9形成的BFU-E比例逐渐升高(r=0.99, P 0.05),体系3中BFU-E形成比率明显高于体系1、2(P 0.05)。结论:通过比较3种培养体系,筛选出体系3是促进CD34~+细胞体外红系分化最有效的体系,体系2是促增殖最有效的体系。本研究为进一步提高HSPC体外红系增殖与诱导效率奠定了技术基础,也为研究红系分化调控机制提供了体外培养体系。     

急性早幼粒细胞白血病的维甲酸治疗

自 1 986年我国首次报导用全反式维甲酸(ATRA)诱导急性早幼粒细胞白血病 (APL)成功以来 ,ATRA诱导APL细胞分化治疗的显著疗效已得到公认 ,完全缓解率 (CR)达到90 %以上[1 ] 。同时ATRA大大地增加了APL患者的无病生存期及生存率 ,降低复发率[2 ] 。现将ATRA治疗APL的机制、方法、并发症等综述于下。1　APL的特征APL是急性髓系白血病的一个特殊类型 ,它具有下述 4个方面特征 :(1 )细胞形态学 ;表现为粒系分化停滞在早幼粒细胞阶段 ;(2 )细胞免疫表型 :CD9+ 、CD33+ 、CD1 3+ 、HLA-DR- 为APL的特征 ,而CD34、CD7、CD1 …     

人胎盘造血干/祖细胞的增殖分化能力

近年来有研究表明，人胎盘组织富含造血干细胞，而且其CD34^＋CD38^-、CD34^＋CD38^＋造血干／祖细胞（HSPC）的百分率明显高于脐血。但有关人胎盘组织CD34^＋HSPC亚群的增殖分化能力的研究却未见报道。我们采用免疫磁珠分选人胎盘组织CD34^＋CD38^-和CD34^＋CD38^＋HSPC亚群，并用不同培养体系进行血细胞集落培养，以评价其增殖分化能力。     

人脐血造血细胞体外扩增的研究进展

单份脐血所含的干细胞数难以满足成人移植的需要[1] 。对脐血造血细胞进行体外培养和扩增有望克服这一障碍。我们就脐血造血细胞体外扩增的实验室研究最新进展作一介绍。1　脐血造血细胞的生物学特征　ＣＤ3 4 细胞是具有多系分化潜能的前体细胞 ,人的造血干细胞主要存在于ＣＤ3 4 细胞群中。如何进一步从脐血ＣＤ3 4 细胞群中纯化造血干细胞进行扩增 ,ＤｉＧｉｕｓｔｏ等[2 ] 发现大约 1%的脐血单个核细胞 (ＭＮＣ)在细胞表面有高度的ＣＤ3 4抗原表达 ,无系分化抗原的标志(Ｌｉｎ阴性 ) ,说明它们可能是未定向分化的造血前体细胞 ,并提…