R848联合Poly(I:C)促进DC抗原呈递和增强T细胞杀伤效果的研究

目的:研究R848联合聚肌胞苷酸[Poly(I:C)]对树突状细胞(DC)成熟的影响及DC诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对人肺腺癌A549细胞的杀伤作用。方法:分离人外周血单个核细胞,诱导其成为DC,用A549细胞裂解物即肿瘤细胞裂解物(TCL)作为抗原,R848(Toll样受体7/8激动剂)联合Poly(I:C)(Toll样受体3激动剂)作用于DC,流式细胞术分析DC表面共刺激分子;将抗原刺激活化后的DC与T淋巴细胞混合培养7 d,收集培养上清液和CTL,检测上清液中白细胞介素12(IL-12)p70、干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量;CTL与肺腺癌A549细胞共培养16 h,观察其杀伤效果。结果:DC-R848+Poly(I:C)组DC表面CD83和CD80的表达较DC-TCL组显著提高(P0.01);同时可明显刺激DC分泌IL-12 p70(P0.01);此外,DC-R848+Poly(I:C)组较DC-TCL组对肺腺癌A549细胞杀伤效果亦显著提高(P0.01);DC-R848+Poly(I:C)组IFN-γ和TNF-α的分泌水平较DC-TCL组均显著提高(P0.01)。结论:R848联合Poly(I:C)作用于DC可显著促进其成熟、活化,并增强其抗原呈递作用及CTL对肺腺癌细胞的特异性杀伤作用。     

两种白血病细胞抗原负载DC的体外诱导特异性CTL应答的比较

目的: 比较树突状细胞 (DC)与白血病细胞融合及白血病细胞冻融抗原负载DC两种白血病DC疫苗诱导抗原特异性CTL应答的能力。方法: 采用羟乙基淀粉 Ficoll两步法分离外周血单个核细胞(PBMC), 通过贴壁 2h获得黏附的单核细胞, 用GM- CSF加IL- 4诱导培养 5d收获细胞。将细胞分为 4组: A组将K562细胞或原代慢性粒细胞白血病(CML)细胞在 500g/LPEG 100mL/LDMSO诱导下与DC融合; B组加入相应细胞数量的白血病细胞冻融抗原; C组将K562细胞或CML细胞与DC共培养; D组: 单独DC培养组。融合前以红色荧光染料PKH26标记K562细胞, 采用流式细胞仪(FCM)检测PKH26 /FITC 抗HLA ABC抗体双标细胞并评估融合率。培养的第 6天, 加入TNF -α诱导DC成熟, 然后分别与自体T细胞共培养, 用MTT比色法检测各组CTL对靶细胞的杀伤活性。结果: GM- CSF加IL -4和TNF- α依次诱导成熟的DC具有经典的DC的形态和表型特征, 在PEG -DMSO的介导下, DC与白血病细胞的融合率为 ( 17. 33 ~29. 94 )%。两种抗原负载方案激活的CTL均对表达K562抗原的细胞具有特异性的细胞毒作用。在效靶比相同时, 融合组诱导CTL的杀伤活性强于冻融抗原致敏DC组。结论: 与冻融抗原致敏的DC相比, DC与白血病细胞融合细胞递呈抗原的效率更高, 体外诱导的CTL特异性杀伤靶     

慢性粒细胞性白血病细胞诱导分化的树突状细胞及其抗原提呈作用的研究

观察细胞因子联合培养诱生的慢性粒细胞性白血病(CML)细胞白血病性树突状细胞(DC)的细胞特性及抗原提呈作用。选择CML患者的骨髓细胞和CML性细胞株K562细胞,应用GM-CSF+IL-4+TNF-α联合培养后进行细胞表型和特异性激活淋巴细胞作用的检测。CML-DC和K562-DC具有DC的形态特征和超微结构,表达CD1a、CD80和CD86等DC相关抗原,并可激活淋巴细胞产生增殖反应,并产生针对白血病细胞的特异性细胞毒效应,同时DC可不同程度地分泌IL-12并协助淋巴细胞产生IFN-γ。CML患者的细胞和K562细胞在细胞因子的诱导下,可分化为具有DC表型特性和特异性激活T细胞的白血病性抗原提呈细胞,使白血病DC瘤苗的应用成为可能。     

ΔNp73α基因转染树突状细胞抗乳腺癌细胞的免疫效应

目的:研究ΔNp73α基因转染树突状细胞(DC)诱导的特异性抗乳腺癌免疫效应。方法:人脐带血细胞经GM-CSF、IL-4、TNF-α等细胞因子诱导培养DC,流式细胞仪(FCM)检测DC成熟前后CD1a、CD83的表达变化情况。脂质体法将pc DNA-HA/ΔNp73α转染至DC,经Western blot检测转染情况。转染DC与自体T细胞共培养诱导特异性CTL。MTT法测定T细胞增殖能力;ELISA法检测IFN-γ的分泌水平;LDH释放法检测T细胞对乳腺癌细胞MDA-MB-231的杀伤作用。结果:DC诱导成熟后,CD1a表达约占56%,CD83约占74%,与未成熟DC(CD1a 19%,CD83 13%)比较,差异有显著统计学意义(P0.01)。Western blot检测到DC-ΔNp73α组有一特异条带表达。DC-ΔNp73α组诱导的特异性CTL对MDA-MB-231杀伤作用高于DC组(P0.05),而且刺激T细胞增殖能力增强,分泌IFN-γ的水平升高,与空载体DC-pc DNA组及DC组比较有显著统计学意义(P0.01)。结论:以ΔNp73α转染DC制备的DC疫苗,具有显著诱导CTL杀伤乳腺癌细胞的作用。     

冻融抗原负载树突状细胞诱导细胞毒性T淋巴细胞特异性杀伤急性白血病细胞的实验研究

我们应用基因重组人白介素 4 (rhIL 4 ) ,基因重组人粒 /单细胞集落刺激因子 (rhGM CSF)联合培养体系自健康志愿者骨髓单个核细胞诱导产生DC ,使其负载急性髓系白血病 (AML)细胞冻融抗原 ,体外诱导细胞毒性T细胞 (CTL) ,观察负载AML细胞冻融抗原后DC的状态对所激发的T淋巴细胞表型及功能的影响及CTL对AML细胞特异性杀伤活性。我们发现负载AML冻融抗原后DC的CD1a、CD83、CD86、CD11C、HLA DR表达率为较培养前明显增高 (P <0 .0 1) ,且负载AML冻融抗原的DC诱导的CTL中CD3 CD8 T细胞比例 ,较诱导前明显增高 (P <0 .0 1) ,而负载AML细胞冻融抗原的DC诱导CTL对AML细胞有较强的杀伤作用 ,明显强于加或不加IL 2培养的T细胞对照组 (P <0 .0 1) ,而对K5 6 2细胞无明显的杀伤活性。通过以上实验我们认为经rhGM CSF ,rhIL 4培养产生的DC为CD14CD1a DC ,能诱导CTL对AML细胞产生明显的特异性杀伤作用 ,另外 ,负载AML细胞冻融抗原DC诱导的CTL中CD3 CD8 T细胞比例明显增高 ,提示CD8 T细胞在抗肿瘤免疫中具有极其重要的作用。     

HER2/neu和GM-CSF共转染树突状细胞的免疫杀伤研究

目的:探讨HER2/neu蛋白细胞胞外段的基因重组腺相关病毒(rAAV-HER2/neu)和粒-巨噬细胞集落刺激因子重组腺相关病毒(rAAV-GM-CSF)共转染树突状细胞(DC)诱导的细胞免疫应答.方法:成熟的DC通过淋巴细胞分离液分离培养获得,流式细胞技术分析HER-2/neu以及细胞表面标志CD1a、CD83、CD80、CD86和HLA-DR的表达,MTT检测混合淋巴反应,3H-TdR释放法检测CTL杀伤活性,RT-PCR检测FasL表达.结果:共转染组(CT)、单独转染组(ST)和未转染组(UT)3组DC的细胞表面标志表达无统计学意义(P＞0.05),共转染组中HER2/neu和FasL的表达比单独转染组高,共转染组中可以检测到更强的混合淋巴细胞反应和CTL杀伤活性.结论:HER2/neu蛋白细胞外段的基因通过DC的抗原提呈作用可以诱导出免疫应答,其免疫应答作用与FasL表达相关,而GM-CSF可以增强其免疫应答作用.     

多发性骨髓瘤患者树突状细胞介导的特异性抗瘤活性的体外诱导

目的 :观察U2 6 6 细胞及其可溶性抗原激发的多发性骨髓瘤 (MM)患者树突状细胞 (DC)体外诱导U2 6 6 特异性CTL的作用。方法 :将MM患者外周血来源的单核细胞在rhGM CSF 80 0U ml与IFNα 6 0 0U ml条件下利用无血清技术培养生成DC ,应用丝裂霉素C处理的U2 6 6 细胞及用U2 6 6 细胞制备的可溶性抗原预刺激DC ,然后与自体淋巴细胞共同孵育 5～ 7d以诱生特异性CTL ,采用MTT法检测对U2 6 6 细胞的特异性杀伤效果。结果 :MM患者外周血单核细胞在GM CSF IFNα条件下培养 8d后生成具有典型特征的DC ,高度表达CD86、CD5 4及MHCII类分子HLA DR。应用MTT法检测U2 6 6 细胞及其可溶性抗原激发的DC诱导特异性CTL对靶细胞U2 6 6 的杀伤率分别为 2 1 2 %± 5 4 %和 2 8 0 %± 7 6 % ,对照组未用抗原刺激组都为 11 7%±4 3%。而以抗原直接刺激自体淋巴细胞组为 15 6 %± 4 8%和 13 1%± 5 5 % (P <0 0 1)。结论 :U2 6 6 细胞及其可溶性抗原激发的DC与自体淋巴细胞孵育能诱导抗U2 6 6 特异性CTL。     

人脐血树突状细胞分泌外来体的特性及其增强CTL杀伤活性的研究

目的探讨脐血树突状细胞(UBDC)及其分泌的亚细胞结构外来体(exosomes)的特性,以及他们对细胞毒性T细胞(CTL)杀伤活性的增强作用。方法分离脐血单个核细胞(UBMC),用rhSCF、rhGM-CSF及rhIL-4诱导12d,加入经反复冻融提取的肿瘤细胞膜抗原,继续培养2d。收集DC并从其培养上清中通过离心(1×105g)分离外来体。用流式细胞术、SDS-PAGE、透射电子显微镜(TEM)和MTT比色法,对DC和外来体的特性及其对CTL杀伤活性的增强作用进行分析。结果用3种细胞因子体外诱导UBMC12d,可使其扩增10倍,并出现DC典型的形态特征。负载肿瘤抗原后,细胞表面可高表达MHC-I、MHC-II、CD40、CD80、CD86、CD11c和CD54。利用超速离心法能从DC培养上清中分离出外来体。混合淋巴细胞反应(MLR)和CTL杀伤活性的分析表明,脐血DC分泌的外来体能有效地刺激T细胞增殖并增强CTL的杀伤活性。结论由UBMC可诱导出大量的DC并分泌外来体。后者可有效地向CTL细胞递呈肿瘤抗原使之活化并增强其杀伤活性。     

EpCAM 蛋白激活DC 诱导抗原特异性CTL 治疗卵巢癌的实验研究

目的:探讨EpCAM 蛋白激活树突细胞(DC)诱导产生CD8+ 细胞毒T 淋巴细胞(CD8+ CTL)进行卵巢癌免疫 治疗的效果,为卵巢癌的临床治疗提供帮助。方法:利用EpCAM 蛋白诱导成熟DC 同时检测DC 表面分子和白介素(IL)鄄10 与IL鄄12 表达量的变化,随后通过EpCAM鄄DC 诱导EpCAM 抗原特异性CD8+ CTL,继而检测EpCAM鄄DC鄄CD8+ CTL 对正常卵巢 上皮细胞IOSE80 和卵巢癌细胞SKVO3 的杀伤效果,同时检测干扰素(IFN)鄄酌释放量。随后进一步检测EpCAM鄄DC鄄CD8+ CTL 对卵巢癌移植裸鼠的肿瘤抑制程度,并通过病理学染色检测治疗后肿瘤组织变化情况。结果:与PBS 刺激相比,EpCAM 蛋白能够显著上调DC 表面分子DC80、DC83、DC86 和HLA鄄DR 水平,依次达到4郾79、4郾85、4郾60 和10郾91 倍;同时EpCAM 蛋白 显著提高IL鄄12 释放和显著抑制IL鄄10 分泌(P<0郾05)。DC鄄CD8+ CTL 与EpCAM鄄DC鄄CD8+ CTL 均引起少量IOSE80 细胞凋亡 (P>0郾05),但EpCAM鄄DC鄄CD8+ CTL 对SKVO3 细胞杀伤率是DC鄄CD8+ CTL 的6郾82 倍(P<0郾05)。动物实验表明,经EpCAM鄄 DC鄄CD8+ CTL 治疗后,BALB/ c鄄nu/ nu 卵巢癌移植肿瘤体积比明显低于PBS 组以及DC鄄CD8+ CTL 组,分别达到0郾27 和0郾28 倍 (P<0郾05)。HE 染色显示EpCAM鄄DC鄄CD8+ CTL 治疗导致肿瘤组织出现明显的病理学改变。结论:EpCAM 蛋白刺激促进了 DC 成熟继而诱导产生EpCAM 特异性CD8+ CTL,EpCAM鄄DC鄄CD8+ CTL 能够高效的杀伤肿瘤细胞并延迟肿瘤生长,对卵巢癌 临床免疫治疗具有重要意义。     

转染肿瘤总RNA的DC疫苗诱导抗肝癌特异性免疫

目的：探讨转染人肝癌总RNA的树突状细胞(DC) 疫苗体外诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的作用。 方法： 采用原发性肝癌（HCC）病人外周血单核细胞（PBMC），在粒/巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4) 刺激下增殖分化为DC细胞；从人肝癌细胞中体外扩增肝癌RNA。以HCCRNA转染DC细胞，并与PBMC混合培养诱导扩增CTL。MTT法测定CTL的杀瘤活性。 结果： 转染HCCRNA 48 h后， DC表面分子CD83、CD86和HLA-DR表达明显增高。转染HepG-2细胞HCCRNA的DC和病人HCCRNA诱导的CTL对HepG-2细胞和病人HCC细胞的杀瘤活性均明显高于正常肝细胞RNA+DC、脂质体+DC、Opti-MEM+DC以及空白对照组；而对胃癌SGC-7901细胞无杀伤活性。 结论： 以肝癌RNA为肿瘤抗原，DC作为疫苗的抗原提呈细胞，体外冲击致敏DCs，能诱导肝癌特异性CTL。本研究为HCC术后复发和转移的防治提供一种可能有效的疫苗治疗方法。     

EBV-LMP2A重组腺病毒体外转染树突状细胞激发特异性CTL的研究

目的：用EBV潜伏膜蛋白2A(EBV-LMP2A)重组腺病毒转染树突状细胞(DC)激发特异性细胞毒性T细胞(CTL)，分析CTL的特性。方法：用AdS-LaMP2A重组腺病毒转染EBV健康携带者及鼻咽癌患者的DC，与自体来源的外周血单个核细胞(PBMC)混合培养，激发LMP2A特异性CIL。用LDH释放法检测CIL杀伤活性；流式细胞术(FACS)检测培养细胞群体中CD3^ 、CD4^ 、CD8^ 、CD56^ 细胞的组成；生物活性法检测细胞培养上清中IFN-γ含量；RT-PCR分析CTL的FasL mRNA表达。结果：EBV健康携带者及鼻咽癌患者的PBMC，经AdS-LMP2A转染的自体DC两次刺激后，都能诱导出显著的EBV-LMP2A特异的CIL。EBV健康携带者CTL的杀伤活性，随DC刺激次数的增加而逐渐增强，诱导的CTL细胞群体以CD^4 和CD8^ 细胞组成为主，且CD4^ 细胞比例高于CD8^ 细胞，另含少量CD56^ 细胞；在不同时段所诱导的CTL上清中，均含一定量的IFN-γ并随刺激次数和诱导时间的延长呈上升趋势；RT-PCR研究表明，所诱导的CTL有FasL mRNA的表达。结论：以腺病毒载体介导EBV-LMP2A基因转染的成熟DC，在体外能激发较强的LMP2A特异的功能性CTL，可用于EBV相关NPC的免疫治疗。     

联合输注Flt3-L和GM-CSF表达质粒体内诱导小鼠DC的研究

目的:探讨联合输注Flt3-L和GM-CSF真核表达质粒体内诱导小鼠DC的方法并检测其抗原提呈功能。方法:采用尾静脉注射法分别输注Flt3-L及GM-CSF质粒,15d后收获小鼠脾脏;采用流式细胞术检测小鼠脾细胞CD11c、CD11b、B220、CD8α和NK1.1等表面标志以鉴定DC的比例及亚型;将体内诱导DC与HBsAg共孵育,然后刺激HBsAg预免疫小鼠的脾细胞并检测其分泌IFN-的水平。结果:联合输注Flt3-L和GM-CSF质粒小鼠的脾细胞达到4×108个细胞/脾脏、其中CD11c+细胞占20%以上,CD11c+细胞中CD11b+、CD11b-、B220+、CD8+、NK1.1+细胞的比例分别达17%、10%、26%、16%、7%左右;体内诱导DC负载HB-sAg后刺激HBsAg特异性淋巴细胞分泌IFN-γ的水平明显高于HBsAg单独刺激组。结论:采用小鼠尾静脉注射技术输注Flt3-L及GM-CSF质粒能够诱导CD11c+ DC的产生并包含多种亚型,体内诱导DC具备有效的抗原提呈功能。     

肝癌DC疫苗诱导CTL的效应与机理研究

目的 探讨肝癌DC疫苗诱导肝癌特异性淋巴细胞的效应与机理。方法 用流式细胞术检测肝癌细胞表面HLA-DR的表达；用GM-CSF和IL-4从健康人外周血诱导DC，使之负载肝癌相关抗原，并在BCG HSP-70作用下活化，制成肝癌DC疫苗；用流式细胞术检测BCG HSP 70活化的负载肝癌抗原DC对自身淋巴细胞的活化；分别用MTT法和ELISA检测肝癌DC疫苗活化的淋巴细胞培养上清中TNF和IL-12水平；用原位杂交检测淋巴细胞内IFN-γ mRNA表达；用流式细胞术检测经DC疫苗活化后淋巴细胞表面Fas-L表达；最后检测肝癌DC疫苗活化的淋巴细胞对肝癌细胞的特异性杀伤。结果 肝癌DC疫苗在体外诱导活化的淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤以CD4^ T CTL为主，不但可以杀伤SMMC-7721细胞，同时对其它3种肝癌细胞也有不同程度的杀伤。CTL培养上清液和细胞中可分别检测到TH1型细胞因子TNF和IFN-γ mRNA。Fas和Fas配体途径发挥了重要的作用。结论 为肝癌DC疫苗的进一步深入研究及今后的临床应用奠定了良好的基础。     

转染自体胃癌细胞总RNA的树突状细胞诱导个体化免疫治疗的体外实验

目的探讨转染自体胃癌细胞总RNA的树突状细胞(DC)体外介导抗胃癌的免疫效应。方法制备短期培养的原代胃癌细胞。用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α体外诱导胃癌患者外周血单个核细胞(PBMC)中DC的发育和成熟,并转染自体肿瘤细胞总RNA,激活自体T细胞产生CTL,用CCK-8试剂盒检测CTL的杀伤活性。应用流式细胞术及混合淋巴细胞培养技术检测DC的免疫功能状态。用ELISA法测定IL-12和INF-γ的水平。结果转染自体肿瘤细胞总RNA的成熟DC,不仅可高表达MHC-I、II类分子及CD80、CD83和CD86协同刺激分子,并可获得高效刺激自体或异体T细胞增殖的能力。转染RNA的成熟DC,分泌IL-12的水平及其刺激产生的CTL培养上清液中INF-γ的水平显著高于单纯成熟DC及未成熟DC;且CTL对自体胃癌细胞的杀伤率显著高于异体组。结论转染自体胃癌细胞总RNA的成熟DC能够体外诱导产生对自体肿瘤细胞具有高度抗原特异性杀伤活性的CTL。     

人乳头状瘤病毒11型E7抗原HLA-A*0201限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的功能鉴定

目的 筛选和鉴定人乳头状瘤病毒11型E7抗原(HPVllE7)HLA-A*0201限制性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位.方法 预测HPVllE7抗原HLA-A*0201限制性CTL表位并合成相对应的表位多肽和四聚体(tetramer),即HPVllE7 7-15(TLKDIVLDL)、15-23(LQPPDPVGL)、47-55(PLTQHYQIL)、81-89(DLLLGTLNI)和82-90(LLLGTLNIV).从健康HLA-A*0201成人外周血单一核细胞诱导树突状细胞(DC)并负载上述表位多肽,流式细胞技术检测DC成熟分化标记及ELISA法检测DC分泌的IL-12;成熟DC负载各组多肽后观察DC激活T淋巴细胞的效应,ELISA法检测T细胞分泌的IFN-γ;四聚体检测抗原特异性CD8+ T细胞及乳酸脱氢酶(LDH)释放法评价DC诱导的CTL对靶细胞的特异性体外杀伤效应.结果 预测的5条HPVllE7表位多肽均能诱导DC的成熟分化;E7 7-15、82-90和15-23多肽负载的DC能激活T淋巴细胞分泌高水平IFN-γ;E7 7-15多肽负载的DC能刺激特异性tetramer+CD8+细胞增殖且其诱导的CTL对HPVllE7/293细胞产生高效率的特异性杀伤作用(P<0.05).结论 筛选并鉴定出1条HPVllE7HLA-A*0201限制性CTL表位E7 7-15(TLKDIVLDL),负载该表位肽的DC体外可诱导高效、特异性的CTL效应,抗原性较强,有可能作为HPV感染治疗用肽疫苗的候选表位.     

多种活化因子共刺激对人外周血单个核细胞体外增殖和表型的影响

目的:观察多种活化因子共刺激后对人外周血淋巴细胞增殖和表型的影响。方法:用淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞(PBMC),根据加入刺激因子(CD3 mAb、CD28 mAb、IFN-γ、IL-1α、IL-2、IL-15和IL-21)种类和方法不同将实验分为7组。用全自动五分类血液分析仪计数不同细胞因子诱导培养的PBMC增殖力、流式细胞术测定诱导后共刺激细胞表面CD3,CD4,CD8,CD28,CD16、CD56+CD16,CD3+CD8+,CD3+CD4+,CD3+CD56+,CD45RO等分子的变化、乳酸脱氢酶释放法测定诱导后的共刺激细胞对SGC-7901、SW-1990和SW-116细胞株的杀伤活性。结果:在PB-MC培养体系中加入不同的刺激因子其细胞增殖能力有明显的差异,以含刺激因子CD3、CD28、IFN-γ、IL-2、IL-1α、IL-15和IL-21组增殖倍数最高,在培养第10 d时该组的增殖倍数为255.3 6.3,明显高于仅含CD3、IFN-γ和IL-2培养体系组(166.6 5.5)(P<0.05)。在PBMC培养体系中加入不同的刺激因子其部分细胞表面标志有所差异,在培养体系中无IL-15时CD16+CD56+(NK细胞)细胞和CD3+CD56+细胞比例明显高于其他组;CD45RO+的记忆性T细胞以延迟3 d添加IL-15和IL-21组升高最明显。经不同活化因子刺激培养10 d的PBMC对SGC-7901、SW-1990和SW-1116细胞杀伤活性有明显差异,以延迟3 d添加IL-15和IL-21组最高(分别为76.2%、60.3%和70.6%),明显高于仅含CD3、IFN-γ和IL-2培养体系的细胞组(分别为54.9%、44.6%和50.4%)(P<0.05)。培养的细胞对胃腺癌细胞SGC-7901杀伤活性最强。结论:不同刺激因子活化的PBMC其增殖能力、表面标记和杀伤活性有明显差异,在培养体系中增加相应的刺激因子对细胞定向培养有一定价值。     

树突状细胞体外诱导抗肿瘤血管内皮细胞特异性免疫的研究

目的:探讨肿瘤内皮细胞抗原负载的树突状细胞(DC)诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的特异性杀伤效应。方法:采用肿瘤细胞的培养上清诱导人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)增殖,制备肿瘤血管衍生的内皮细胞(TdEC)。用RTPCR检测肿瘤内皮标志物(TEM)的表达。制备TdEC的冻融抗原,负载从外周血中扩增的DC,用MTS比色法检测DC刺激自体淋巴细胞增殖的效应;用LDH法检测DC诱导的CTL的特异性杀伤效应。结果:TdEC可表达TEM1和TEM8。负载TdEC抗原的DC,可显著刺激自体淋巴细胞增殖。由其诱导的CTL对TdEC具有特异性的杀伤作用。在效靶比为20∶1和10∶1时,杀伤率分别为33%和27%,高于对照组的14%和10%。结论:TdEC抗原负载的DC,在体外可有效地诱导CTL产生,并特异性地杀伤TdEC。     

两步法从慢性髓系白血病患者骨髓CD34+细胞体外扩增诱导树突状细胞

目的探讨从慢性髓系白血病(CML)患者骨髓CD34~ 细胞体外扩增诱导树突状细胞(DC)的可行性,并比较CML-DC和正常DC的生物学特性。方法免疫磁珠法从CML患者和正常供者骨髓纯化CD34~ 细胞,在有血清条件下应用两步法:干细胞生长因子(SCF) FLT3配体(FL) 促血小板生成素(TPO) 白细胞介素-3(IL-3)扩增2周,然后以粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 白细胞介素-4(IL-4) 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(GI方案)诱导DC。通过相差显微镜、电子显微镜、流式细胞仪分析DC的生物学特性,荧光原位杂交(FISH)检测培养前后CML细胞的bcr/abl融合基因表达。结果诱导后细胞较0d或诱导前细胞高表达DC相关抗原(CD1a,CD80,CD86,CD40,CD54,HLA-DR)。CML患者和正常供者CD34 细胞经GI方案诱导10d,CD1a阳性率分别为36.90%±26.94%和54.35%±16.34%,CD1a~ DC数是0d接种细胞的(54±54)倍和(122±129)倍。两组相比,总细胞扩增倍数、DC扩增倍数、细胞表型均无明显差异,诱导后的DC具有相似的超微结构。CML患者CD34~ 细胞诱导10d后bcr/abl融合基因阳性率为43.67%±21.55%,具有典型DC形态的细胞bcr/abl融合基因阳性率为53.2%。结论两步法GI方案能诱导CMLCD34~ 细胞产生大量DC,诱导生成的DC不但具有正常DC的典型形态、表型,而且起源于CML细胞。     

γ干扰素处理对树突状细胞生物学特性及功能的影响

目的研究γ干扰素(IFN-γ)处理对C57BL/6小鼠树突状细胞(DC)生物学特性及功能的影响。方法在DC培养过程的早期(第2天)或晚期(第5天)加入20 ng/m L IFN-γ进行处理,第7天加入脂多糖(LPS)刺激DC成熟,流式细胞术检测细胞表面分子CD11c、CD80、CD86的表达。为检测DC功能,将其与BALB/c小鼠来源的淋巴细胞进行共培养,5,6-羧基荧光黄二乙酸盐N-琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记法检测其刺激异基因淋巴细胞增殖的能力、流式细胞术检测其诱导调节性T细胞(Treg)产生的能力。结果与对照组相比,早期IFN-γ处理组的DC数量减少、分化受到抑制;虽然表面共刺激分子的表达无明显变化,但是却明显拮抗LPS刺激其成熟;刺激异基因淋巴细胞增殖的能力明显减弱;诱导产生更多的Treg。与对照组相比,晚期IFN-γ处理的DC数量及分化无变化;表面共刺激分子CD86及CD80表达升高;LPS刺激DC成熟及同种异体混合淋巴细胞反应的结果相似,但是诱导Treg产生的能力增加。结论早期IFN-γ处理组和晚期IFN-γ处理组的DC生物学特性及功能明显不同。     

EIER2／neu和GM-CSF共转染树突状细胞的免疫杀伤研究

目的：探讨HER2／neu蛋白细胞胞外段的基因重组腺相关病毒（rAAV-HER2／neu）和粒-巨噬细胞集落刺激因子重组腺相关病毒（rAAV-GM-CSF）共转染树突状细胞（DC）诱导的细胞免疫应答。方法：成熟的DC通过淋巴细胞分离液分离培养获得，流式细胞技术分析HER-2／neu以及细胞表面标志CD1a、CD83、CD80、CD86和HIA-DR的表达，MTT检测混合淋巴反应，^3H-TdR释放法检测CTL杀伤活性，RT-PCR检测FasL表达。结果：共转染组（CT）、单独转染组（ST）和未转染组（UT）3组DC的细胞表面标志表达无统计学意义（P〉0．05），共转染组中HER2／neu和FasL的表达比单独转染组高，共转染组中可以检测到更强的混合淋巴细胞反应和CTL杀伤活性。结论：HER2／neu蛋白细胞外段的基因通过DC的抗原提呈作用可以诱导出免疫应答，其免疫应答作用与FasL表达相关，而GM-CSF可以增强其免疫应答作用。