U83836E对原代大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用及机制研究

目的:观察U83836E对原代大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用并探讨其初步机制.方法:分离大鼠原代心肌细胞建立缺氧复氧(H/R)模型,细胞随机分为5组,观察不同剂量U83836E对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用.结果:与Control组比较,H/R组心肌细胞内钙离子浓度明显增高,肌浆网Ca2+-ATP酶(SERCA2)表达显著减少.与H/R组比较,U83836E干预各组心肌细胞内游离钙离子浓度明显降低,且肌浆网钙泵的蛋白表达上调.结论:U83836E对缺氧复氧心肌细胞有保护作用,其可能与上调SERCA2的表达抑制细胞内钙超载有关.     

大株红景天对缺氧/复氧大鼠原代心肌细胞线粒体功能及线粒体动力学的影响

〖H通过观察大株红景天对缺氧/复氧（Hypoxia/reoxygenation,H/R）心肌细胞线粒体功能及线粒体动力学的影响,探讨其抗心肌细胞H/R损伤的可能机制。方法 分离并培养新生SD大鼠原代心肌细胞,选符合实验要求的心肌细胞,随机分为5组：空白对照组、缺氧/复氧组（H/R组）、红景天前干预组（S+H/R组）、红景天后干预组（H/R+S组）、红景天前后干预组（S+H/R+S组）。实验结束后多功能酶标仪测定心肌细胞内三磷酸腺苷（ATP）水平、活性氧簇（ROS）含量,JC1法测定心肌细胞线粒体膜电位（MMP）,Western blot法检测线粒体动力学相关蛋白视神经萎缩蛋白（OPA1）、动力相关蛋白1（DRP1）及磷酸化动力相关蛋白1（pDRP1）的表达水平。结果 S+H/R组、H/R+S组及S+H/R+S组H/R心肌细胞内ATP含量均增加,ROS水平降低,并抑制MMP的降低,上调OPA1蛋白表达,抑制pDrp1蛋白表达（P＜0.05）;S+H/R+S组分别与S+H/R组、H/R+S组组间比较,ATP、ROS、MMP水平变化及pDrp1表达量均具有统计学差异（P＜0.05）,而OPA1蛋白的表达无明显差异;S+H/R组、H/R+S组及S+H/R+S组组间比较,Drp1的表达量无明显差异。结论 大株红景天对H/R损伤的心肌细胞有保护作用,其机制可能与改善受损心肌细胞线粒体功能障碍、稳定线粒体动力学平衡有关,值得进一步探讨。     

银杏叶提取物对缺氧复氧致神经细胞凋亡中Bax基因表达的影响

为探讨缺氧复氧致原代培养的大鼠大脑皮质神经细胞凋亡中 ,Bax基因的表达及银杏叶提取物 (EGB)对其的调节作用 ,用胎龄 1 6～ 1 7dWistar大鼠的大脑皮质神经细胞进行原代分离培养。采用原位末端标记法 (TUNEL)透射电镜技术确立缺氧复氧神经细胞凋亡病理模型 ,并应用免疫组织化学方法显示缺氧复氧不同时间Bax基因的表达。结果 :缺氧复氧可以使大鼠大脑皮质神经细胞发生凋亡 ,随缺氧时间的延长 ,凋亡细胞数逐渐增多 ,至缺氧 8h ,复氧 1 8h达高峰 ,银杏叶提取物预保护可使凋亡细胞数减少 ;同时随着缺氧时间的延长 ,Bax基因表达逐渐增高 ,EGB可逆转缺氧复氧时Bax的表达。提示 :EGB对缺氧复氧时Bax的表达具有明显的抑制作用 ,这可能是EGB对抗缺氧复氧时胎鼠大脑皮质神经细胞发生凋亡的机制之一。     

心肌细胞缺氧/复氧模型的构建及研究进展

心肌细胞缺氧/复氧模型是模拟心肌缺血再灌注损伤及相关疾病的经典细胞模型,具有操作便捷、直观形象、稳定性好等优势,可准确反映疾病细胞水平的病理改变,广泛应用于药物与疾病的分子机制研究。缺氧/复氧是导致多种心血管疾病的主要机制之一,构建理想的心肌细胞缺氧/复氧模型是深入研究心血管疾病机制的基础,目前该模型的构建方法较多,主要包括物理法(混合气体培养法、厌氧袋/罐法、液体石蜡封闭法)、化学法(氧耗法、超氧法、酶抑法和缺氧液法)和联合法等,其中混合气体培养法和氧耗法最常用。     

Rapamycin Protects Cardiomyocytes against Anoxia/Reoxygenation Injury by Inducing Autophagy through the PI3k/Akt Pathway

The purpose of this study was to investigate the potential cardioprotection roles of Rapamycin in anoxia/reoxygenation(A/R) injury of cardiomyocytes through inducing autophagy, and the involvement of PI3k/Akt pathway. We employed simulated A/R of neonatal rat ventricular myocytes(NRVM) as an in vitro model of ischemial/reperfusion(I/R) injury to the heart. NRVM were pretreated with four different concentrations of Rapamycin(20, 50, 100, 150 μmol/L), and pretreated with 10 mmol/L 3-methyladenine(3MA) for inhibiting autophagy during A/R. Then, Western blot analysis was used to examine variation in the expression of LC3-Ⅱ, LC3-Ⅰ, Bim, caspase-3, p-PI3KⅠ, PI3KⅠ, p-Akt and Akt. In our model, Rapamycin had a preferential action on autophagy, increasing the expression of LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ, whereas decreasing the expression of Bim and caspase-3. Moreover, our results also demonstrated that Rapamycin inhibited the activation of p-PI3KⅠ and enhanced the activation of p-Akt. It is concluded that Rapamycin has a cardioprotection effect by inducing autophagy in a concentration-dependent manner against apopotosis through PI3K/Akt signaling pathway during A/R in NRVM.     

钾通道开放剂预处理对兔离体基底动脉缺氧-复氧损伤的保护作用

目的：观察ATP敏感性钾通道开放剂吡那地尔(pinacidil)和钙激活钾通道开放剂NSl619对基底动脉缺氧复氧(H／R)损伤的保护能力。方法：采用离体血管环灌流的方法，比较对照组、缺氧复氧组、吡那地尔预处理组和NSl619预处理组4组血管环对缩血管物质U46619(前列腺素A2模拟物)及内皮依赖性扩血管物质乙酰胆碱(ACh)以及非内皮依赖性扩血管物质硝晋钠(SNP)的反应。结果：①H／R组与对照组比较，兔基底动脉对U46619的反应明显增强，对SNP的反应未见差异，而对ACh的反应明显减弱；②经吡那地尔和NSl619分别预处理后，可以预防离体兔基底动脉在缺氧复氧后对ACh舒张作用的减弱和对U46619收缩反应的增强。结论：吡那地尔和NSl619分别预处理后可以保护基底动脉内皮细胞免受后继H／R的损伤。     

建立新生大鼠心肌细胞缺氧／复氧模型

目的：探讨缺氧密闭法建立新生SD大鼠心肌细胞缺氧／复氧模型的可行性与稳定性。方法：将体外培养的新生SD大鼠心肌细胞随机分为对照组（不做处理）和实验组（进行不同时间（30min、1-4h）的缺氧／复氧处理）。DCFH-DA荧光探针检测活性氧（ROS）浓度;AO／EB双染法及AnexinV／PI流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：对照组ROS浓度及细胞凋亡率均较低;而实验组随着缺氧时间的延长,ROS浓度逐渐增加,细胞凋亡数逐渐增多。不同缺氧时间段细胞凋亡率与对照组比,除缺氧30min组外,1-4h组差异均有统计学意义（P〈0．05,P〈0．01）。结论：厌氧产气袋．缺氧密闭系统建立新生SD大鼠心肌细胞缺氧／复氧模型稳定、可行且重复性好。     

巨噬细胞缺氧复氧模型的制作方法及其生物学意义

目的：建立一种简单可行的巨噬细胞缺氧复氧（H/R）模型。方法：采用制备缺氧液与氮气饱和相结合的方法制造细胞缺氧环境。巨噬细胞系RAW264.7分为对照组、缺氧（30、60和120min）复氧（15或30min）组及H/R＋不同剂量的依达拉奉（EDA）组,借助于倒置荧光显微镜及流式细胞仪观测巨噬细胞内活性氧（ROS）浓度的变化,作为评判H/R模型成功与否的标准。结果：与各自对照组比,缺氧60min复氧15 min组即可引起ROS浓度明显升高（P〈0.05）,随着H/R时间延长,ROS生成呈进行性增加趋势。ROS清除剂EDA能剂量-依赖地抑制H/R所致ROS的大量生成。结论：应用制备缺氧液与氮气饱和相结合的方法可成功建立巨噬细胞H/R模型,该模型适于不同脏器缺血再灌注损伤共同分子机制的探讨及寻找共同治疗策略的相关研究。     

缺氧诱导因子1在人肾微血管内皮细胞低温缺氧再复氧损伤中的抗凋亡作用

目的探讨缺氧诱导因1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)在人肾微血管内皮细胞(human renal mi-crovascular endothelial cells,RMVEC)低温缺氧再复氧(hypoxia/reoxygenation,HR)损伤中的抗凋亡作用。方法建立RMVEC低温HR模型,应用3,4-DHB和NS-398预处理细胞,设对照、低温HR、3,4-DHB和NS-398共4组。采用RT-PCR和Western blot检测各组HIF-1α和血红素加氧酶1(heme oxygenases-1,HO-1)mRNA和蛋白的表达水平;通过TUNEL法及活化caspase-3蛋白表达水平检测各组细胞凋亡情况。结果各组间HIF-1αmRNA表达水平无统计学差异(P>0.05);经低温HR损伤后HIF-1α蛋白(P<0.001)、HO-1mRNA(P<0.001)和HO-1蛋白(P=0.002)表达水平与对照组比较显著增高。与低温HR组比较,3,4-DHB组HIF-1α(P<0.001)、HO-1mRNA(P=0.03)和蛋白(P=0.017)表达水平有显著增高;而NS-398组HIF-1α(P=0.036)、HO-1mRNA(P=0.007)和蛋白(P=0.005)表达水平则显著减低。低温HR损伤造成活化caspase-3表达显著增高(P=0.001)。与低温HR组比较,3,4-DHB组表达减低(P=0.005)和NS-398组表达增高(P<0.001)均有统计学意义。TUNEL结果,与对照组[(6.97±0.032)%]比较,低温HR组[(19.1±0.053)%,P=0.002]和NS-398组[(26.7±0.079)%,P<0.001]原位凋亡细胞比例显著增高;3,4-DHB组[(7.89±0.038)%]增高无统计学意义(P=0.802)。与HR组比较,3,4-DHB组减低(P=0.003)和NS-398组增高(P=0.038)均有统计学意义。结论HIF-1稳定表达在RMVEC低温HR损伤中有显著的抗凋亡作用,机制可能与其诱导内源性HO-1过表达有关。     

硫化氢后处理对缺氧/复氧损伤心肌的保护及其机制

目的:探讨硫化氢(H2S)后处理对H9C2细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及其机制。方法:细胞随机分为:正常对照组(con)、缺氧/复氧组(H/R)、NaHS后处理组(H/R+NaHS)、CSE阻断剂干预组(H/R+PAG)。倒置显微镜、流式细胞仪检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR检测胱硫醚-!-裂解酶(CSE)mRNA表达;Western blotting检测p50ATF6、GRP78蛋白表达。结果:H/R组CSE mRNA表达较对照组明显降低(P<0.01);H/R+NaHS组CSE mRNA表达较H/R组明显升高(P<0.01)。H/R组p50ATF6、GRP78表达较对照组明显升高(P<0.01);NaHS后处理后p50ATF6和GRP78表达较H/R组升高(P<0.05);给予PAG后,p50ATF6、GRP78表达较H/R组降低(P<0.01)。结论:H2S后处理对H9C2细胞缺氧/复氧损伤具有保护作用,其机制可能与H2S可活化ATF6,上调GRP78表达,降低内质网应激有关。     

碘化N-正丁基氟哌啶醇对心肌细胞缺氧复氧损伤保护作用机制的研究

目的：探讨碘化N-正丁基氟哌啶醇（F2）对缺氧复氧心肌细胞损伤及早期生长反应基因-1（Egr-1）蛋白表达的影响。方法：用1—3d的SD大鼠进行心肌细胞原代培养。取生长5-6d的心肌细胞分为对照组、缺氧复氧组、聚乙二醇＋脂质体组、反义寡核苷酸组、反义寡核苷酸＋F2组。除对照组外其他组均做缺氧复氧模型。通过测定肌酸激酶、乳酸脱氢酶、肌钙蛋白、超氧化物歧化酶、丙二醛及肿瘤坏死因子-α的变化，观察心肌细胞损伤及炎症反应情况：Westernblot法检测培养心肌细胞中Egr-1蛋白的表达水平。结果：与对照组比，反义寡核苷酸组及反义寡核苷酸＋F2组Egr-1蛋白表达明显减少（P（0．05），细胞损伤及炎症反应程度明显减弱（P〈0．01）；反义寡核苷酸组与反义寡核苷酸＋F2组比，Egr-1蛋白表达虽无统计学意义（P〉0．05），但细胞损伤及炎症反应改善情况却有统计学意义（P〈0．05）。结论：F2可通过抑制Egr-1蛋白表达来减轻缺氧复氧心肌细胞的损伤，它还可通过其他机制起到保护缺氧复氧心肌细胞损伤的作用。     

MAPK信号转导在缺氧/复氧性心肌细胞凋亡中的作用

细胞凋亡是能量依赖的细胞内死亡程序活化而导致的细胞自杀,由基因控制的细胞自主有序的主动死亡过程;心肌细胞缺氧/复氧(H/R)存在细胞凋亡。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是细胞应激反应的重要信号分子,在H/R性心肌细胞凋亡中起着重要的作用,深入研究MAPK在心肌细胞凋亡中的作用,对临床上防治心肌缺血/再灌注损伤具有非常重要的指导意义。     

低氧对体外培养的肺血管周细胞免疫表型的影响

用细胞培养、免疫细胞化学染色、图像分析及流式细胞术观察低氧和猪肺动脉缺氧内皮细胞条件培养液(HECCM)对体外培养的新生大鼠肺血管周细胞 (PC)α- SM- actin、 CD34 、 S- 10 0和 PCNA的表达及细胞周期的影响。结果发现 ,低氧和 HECCM可促进 PC表达α- SM- actin和 PCNA,而抑制 CD34 和 S- 10 0的合成 ,促进 PC由静止期 (G0 /G1 期 )进入 DNA合成期 (S期 )及有丝分裂期 (G2 M期 )。提示 ,低氧不仅能促进 PC增殖 ,而且还可促进其向平滑肌样细胞转化。故 PC是慢性低氧性肺动脉高压时无肌型细动脉肌化的重要细胞来源。     

Ginsenoside Rb1 Ameliorates Autophagy of Hypoxia Cardiomyocytes from Neonatal Rats via AMP-Activated Protein Kinase Pathway

Objective: To investigate whether ginsenoside-Rb1(Gs-Rb1) improves the CoCl2-induced autophagy of cardiomyocytes via upregulation of adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase(AMPK) pathway. Methods: Ventricles from 1-to 3-day-old Wistar rats were sequentially digested, separated and incubated in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% fetal bovine serum for 3 days followed by synchronization. Neonatal rat cardiomyocytes were randomly divided into 7 groups: control group(normal level oxygen), hypoxia group(500 μmol/L CoCl_2), Gs-Rb1 group(200 μmol/L Gs-Rb1 + 500 μmol/L CoCl_2), Ara A group(500 μmol/L Ara A + 500 μmol/L CoCl_2), Ara A+ Gs-Rb1 group(500 μmol/L Ara A + 200 μmol/L Gs-Rb1 + 500 μmol/L CoCl_2), AICAR group [1 mmol/L 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide(AICAR) + 500 μmol/L CoCl_2], and AICAR+Gs-Rb1 group(1 mmol/L AICAR + 200 μmol/L Gs-Rb1 + 500 μmol/L CoCl_2). Cel s were treated for 12 h and cell viability was determined by methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide(MTT) assay and cardiac troponin I(cTnI) levels were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). AMPK activity was assessed by 2',7'-dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA) ELISA assay. The protein expressions of Atg4 B, Atg5, Atg6, Atg7, microtubule-associated protein 1 A/1 B-light chain 3(LC3), P62, and active-cathepsin B were measured by Western blot. Results: Gs-Rb1 significantly improved the cell viability of hypoxia cardiomyocytes(P0.01). However, the viability of hypoxia-treated cardiomyocytes was significantly inhibited by Ara A(P0.01). Gs-Rb1 increased the AMPK activity of hypoxia-treated cardiomyocytes. The AMPK activity of hypoxia-treated cadiomyocytes was inhibited by Ara A(P0.01) and was not affected by AICAR(P=0.983). Gs-Rb1 up-regulated Atg4B, Atg5, Beclin-1, Atg7, LC3B Ⅱ, the LC3BⅡ/Ⅰ ratio and cathepsin B activity of hypoxia cardiomyocytes(P0.05), each of these protein levels was significantly enhanced by Ara A(all P0.01), but was not affected by AICAR(all P0.05). Gs-Rb1 significantly down-regulated P62 levels of hypoxic cardiomyocytes(P0.05). The P62 levels of hypoxic cardiomyocytes were inhibited by Ara A(P0.05) and were not affected by AICAR(P=0.871). Conclusion: Gs-Rb1 may improve the viability of hypoxia cardiomyocytes by ameliorating cell autophagy via the upregulation of AMPK pathway.     

严重急性呼吸综合征肺部病变的CT表现及预后

目的：探讨SARS肺部CT表现及其与预后的关系。方法：收集临床确诊的50例SARS病例的临床及CT资料，CT检查时间从发病1d～2个月以后。结果：初期(1～3d)，单发病变较多见，病灶以圆形、类圆形和小片状居多，大片较少，多分布于胸膜下或肺周边，中央分布略少。病变的密度以磨玻璃样密度为主，实变和混合密度较少；中期(4～20d)，病灶的范围及密度变化较大，原有病灶明显扩大，密度变淡，同侧和／或对侧肺出现新的病灶，病变数增加，密度多样化，以磨玻璃样密度多见，大片状影较初期明显增加，少数缩小、吸收；恢复期(21d～2个月以后)，绝大多数病灶吸收、消失。少数吸收缓慢，病灶仍以磨玻璃样为主，间质病变明显，但最终吸收、消失。结论：SARS肺部病变在疾病的不同阶段有不同表现。认识其各自CT特点，有助于疾病的早期诊断及对疾病演变规律的了解。     

硫氧还蛋白对缺氧/复氧大鼠海马神经元caspase-3活性的影响

目的：探讨硫氧还蛋白（Trx)和caspase-3在鼠海马神经元缺氧／复氧损伤中的作用。方法：原代培养10d的新生鼠海马神经元缺氧3h复氧12h,24h和48h，分为正常对照组、缺氧／复氧组和Trx组，用MTT比色法测定各时点的神经元存活率；底物裂解法检测caspase-3活性。结果：缺氧／复氧组海马神经元复氧12－48h，海马神经元caspase-3样蛋白酶活性明显增高，以复氧24h为最高，而存活率进行性下降；Trx组caspase-3样蛋白酶活性曲线与缺氧／复氧组相似，但明显下降，细胞存活率较缺氧／复氧组明显提高。结论：海马神经元缺氧／复氧后，caspase-3样蛋白酶被激活，参与神经元损伤过程；Trx对神经元有保护作用。     

缺氧复氧对内皮细胞间隙连接通讯功能的影响初探

目的　观察缺氧复氧刺激对内皮细胞间隙连接通讯功能的影响 ,初步探讨缺氧复氧引起内皮细胞损伤的机制。方法　将人脐静脉内皮细胞株 ECV30 4分为两组 ,常氧对照组在常氧状态下培养 12～ 18小时 ;缺氧复氧组先在氧浓度低于 1%状态下培养 12～ 14小时 ,再置于常氧状态复氧 0～ 6小时。应用荧光漂白回复技术对细胞间隙连接通讯功能进行分析 ,结果用荧光回复率表示。结果　常氧对照组内皮细胞荧光回复率为 34 .4%±16 .5 %;缺氧复氧组经缺氧处理以及复氧 4小时和复氧 6小时处理后 ,其内皮细胞荧光回复率分别为 42 .7%±2 2 .7%、37.8%± 13.2 %和 43.0 %± 16 .2 %,与常氧对照组相比差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ;经复氧 2小时处理后 ,内皮细胞的荧光回复率为 2 5 .0± 7.4%,与常氧对照组和经缺氧、复氧 4小时、复氧 6小时处理组相比 ,差异十分显著(P<0 .0 1)。结论　在本实验条件下 ,单独缺氧 12～ 14小时不影响内皮细胞间隙连接通讯功能 ,而复氧 2小时则能显著抑制间隙连接通讯功能。由此提示 ,间隙连接通讯功能改变参与了内皮细胞缺氧复氧损伤的早期反应。     

缺氧/复氧损伤对血管内皮细胞NO生成和脂质过氧化物的影响

目的 观察缺氧复氧对内皮细胞NO生成和脂质过氧化物产生的影响。方法 用体外培养人脐静脉内皮细胞株缺氧2h后，复氧30min和60min；用硝酸还原酶法和TBA法分别测定内皮细胞培养液中NO和脂质过氧化物(MDA)含量；同时观察细胞的形态变化。结果 缺氧、缺氧复氧内皮细胞培养液中NO均明显减少、MDA显著增加；镜下细胞的形状变圆变小，细胞间隙疏松；随着复氧时间的延长，NO含量呈进一步减少趋势，MDA继续显著增多，镜下细胞变圆变大，有部分圆形悬浮肿胀细胞，细胞间隙变宽。结论 缺氧、复氧均可损伤内皮细胞，复氧可加重其损伤，并随复氧时间的延长而加剧。     

缺氧再给氧损伤对人肝细胞MHCⅠ分子相关抗原表达变化的影响

目的 探讨缺氧再给氧(hypoxia／reoxygenation,H／R)损伤是否能介导入MICA、B(MHC class Ⅰ chain-related antigenA,B)的表达变化。方法 建立人正常肝细胞缺氧再给氧损伤模型,模拟移植器官缺血再灌注损伤过程,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫荧光分别检测肝细胞MICA、B在mRNA和蛋白质水平的变化。结果 发现H／R损伤可以导致肝细胞中MICA和MICB表达上调．缺氧15h,再给氧2h、4h、6h、12h、24h后两者的表达逐步增多。结论 缺氧再给氧损伤能够诱导MICA、B表达上调。