BMP-2基因转染的人骨髓基质干细胞复合PLA/PCL支架体外构建组织工程骨

目的　用人骨形态发生蛋白 2腺病毒表达载体 (Ad -BMP - 2 )转染的人骨髓基质干细胞 (hBMSC) ,复合PLA/PCL(聚乳酸 /聚己内酯 )生物降解支架体外构建组织工程骨。方法　用Ad -BMP - 2转染体外培养的成人BMSC ,免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹方法检测细胞BMP - 2的表达 ,并通过流式细胞仪和ALP活性检测分析其对细胞增殖、分化的影响。然后将转染后细胞接种到PLA/PCL支架上 ,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果　转染后 ,hBMP - 2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达 ;S期细胞比例和ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀 ,伸展良好。结论　Ad-BMP - 2可高效转染hBMSC ,且促进细胞增殖及成骨转化。转染后细胞在PLA/PCL上生长良好 ,BMP - 2基因治疗的组织工程骨构建成功     

转染BMP-2基因的兔BMSCs种植PLA/PCL支架体外构建组织工程骨

目的:用腺病毒载体将人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因导入兔骨髓基质干细胞(BMSCs),种植PLA/PCL(聚乳酸/聚己内酯)支架体外构建组织工程骨.方法:蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达,流式细胞仪和ALP活性检测分析基因转染对细胞增殖分化的影响.然后将转染后细胞接种到PLA/PCL支架上,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况.结果:转染后,BMSCs表达BMP-2,S期细胞比例和ALP活性明显增高.扫描电镜见转染细胞分布均匀,伸展良好.结论:BMP-2基因转染BMSCs,可促进细胞增殖分化.转染后细胞在PLA/PCL支架上生长良好,BMP-2基因治疗的组织工程骨构建成功.     

腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染对成骨及血管化的影响

目的 观察骨形态发生蛋白2(BMP-2)基因转染人骨髓基质干细胞(hBMSC)对诱导成骨及血管化的影响，方法 基因转染后，检则骨钙素、Ⅰ型胶原和血管内皮生长因子(VEGF)的表达。并利用转染后的培养液上清诱导小鼠成纤维细胞(L929)。然后将转染后细胞接种到PLA／PCL(聚乳酸／聚己内酯)支架上，然后扫描电镜观察。结果 BMP-2基因转染后，可诱导hBMSC有L929骨钙索、Ⅰ型胶原呈阳性表达，VEGF的表达明显增高。转染细胞在支架中上生长良好，能量谱仪测得钙质分泌。蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白产生。结论 BMP-2基因转染可诱导hBMSC成骨转化，且通过上调VEGF表达促进血管化，复合转染后细胞构建的组织工程骨对治疗骨缺损具有重要意义。     

转基因干细胞构建组织工程骨的初步实验研究

目的 用转基因干细胞在体外构建组织工程骨.方法 用携带有人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒感染骨髓基质干细胞(BMSCs)后接种于纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸(nHAC/PLA)支架.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断感染效率;RT-PCR、ELISA和Western-blot用于基因转染的表达检测;流式细胞仪检测细胞增殖;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况;ALP活性检测成骨能力.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%;RT-PCR检测到BMP-2阳性表达,与实际值1191 bp基本一致;ELIISA检测24 h BMP-2蛋白含量为(148.2±21.6)pg/ml;流式细胞仪检测到细胞S期比例增加;ALP活性检测基因转染组明显强于对照组(P＜0.05);扫描电镜见细胞在nHAC/PLA支架上粘附生长良好;第8周时Western-blot仍可检测到BMP-2在相对分子质量26×103处出现阳性条带.结论 BMP-2基因可在BMSCs稳定表达并诱导其向成骨分化,与nHAC/PLA复合培养可用于组织工程骨构建.     

转基因干细胞构建组织工程骨的初步实验研究

目的 用转基因干细胞在体外构建组织工程骨.方法 用携带有人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒感染骨髓基质干细胞(BMSCs)后接种于纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸(nHAC/PLA)支架.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断感染效率;RT-PCR、ELISA和Western-blot用于基因转染的表达检测;流式细胞仪检测细胞增殖;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况;ALP活性检测成骨能力.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%;RT-PCR检测到BMP-2阳性表达,与实际值1191 bp基本一致;ELIISA检测24 h BMP-2蛋白含量为(148.2±21.6)pg/ml;流式细胞仪检测到细胞S期比例增加;ALP活性检测基因转染组明显强于对照组(P＜0.05);扫描电镜见细胞在nHAC/PLA支架上粘附生长良好;第8周时Western-blot仍可检测到BMP-2在相对分子质量26×103处出现阳性条带.结论 BMP-2基因可在BMSCs稳定表达并诱导其向成骨分化,与nHAC/PLA复合培养可用于组织工程骨构建.     

转基因干细胞构建组织工程骨的初步实验研究

目的 用转基因干细胞在体外构建组织工程骨.方法 用携带有人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒感染骨髓基质干细胞(BMSCs)后接种于纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸(nHAC/PLA)支架.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断感染效率;RT-PCR、ELISA和Western-blot用于基因转染的表达检测;流式细胞仪检测细胞增殖;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况;ALP活性检测成骨能力.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%;RT-PCR检测到BMP-2阳性表达,与实际值1191 bp基本一致;ELIISA检测24 h BMP-2蛋白含量为(148.2±21.6)pg/ml;流式细胞仪检测到细胞S期比例增加;ALP活性检测基因转染组明显强于对照组(P＜0.05);扫描电镜见细胞在nHAC/PLA支架上粘附生长良好;第8周时Western-blot仍可检测到BMP-2在相对分子质量26×103处出现阳性条带.结论 BMP-2基因可在BMSCs稳定表达并诱导其向成骨分化,与nHAC/PLA复合培养可用于组织工程骨构建.     

重组PcDNA3.1-hBMP-2转染骨髓基质干细胞及复合异种骨支架体外构建组织工程骨

目的：构建人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein,，hBMP-2)真核表达载体PcDNA3．1-hBMP-2，转染兔骨髓基质干细胞(bane marrow stromal cells，BMSCs)，种植去抗原牛松质骨(bovine cancellous bone，BCB)支架体外构建组织工程骨。方法：蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达，碱性磷酸酶(ALPase)活性检测分析基因转染对细胞分化的影响。然后将转染后细胞接种到BCB支架上，扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果：转染后，BMSCs表达BMP-2，ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀，伸展良好。结论：在脂质体介导下，BMP-2基因可导入细胞且稳定表达基因产物促进自身增殖分化，转染后细胞在支架材料上贴附生长良好，为进一步应用携带BMP-2基因的人工骨修复骨缺损奠定了实验基础。     

转基因人骨髓间质干细胞在支架中增殖及矿化的研究

目的:观察携带骨形态发生蛋白2基因(BMP-2)的人骨髓间质干细胞(hMSCs)在生物衍生骨支架环境中的增殖及矿化.方法:利用BMP-2腺病毒载体转染hMSCs后种植生物衍生骨支架中,扫描电镜观察细胞生长增殖,能量谱仪测定钙质分泌,RT-PCR检测培养液上清中BMP-2表达.结果:转染后,hBMSC呈ALP、Ⅰ和Ⅱ型胶原阳性表达;细胞在支架中伸展良好,生长旺盛,并产生钙盐沉积;RT-PCR显示培养液上清中存在BMP-2基因表达.结论:转染BMP-2基因的hMSCs在生物衍生骨支架中能够立体生长、增殖,并继续表达目的基因,为基因修饰的组织工程骨修复骨缺损奠定了基础.     

骨形成蛋白-2基因在人骨髓基质细胞中的表达及对其成骨分化的作用

目的利用构建的人骨形成蛋白-2(BMP2)真核表达载体pcDNA3／BMP2，检测其转染人骨髓基质细胞后的表达及对其成骨分化的影响。方法酶切鉴定构建的真核表达载体pcDNA3／BMP2，利用脂质体介导的转染技术，将所构建的载体导入骨髓基质细胞中，体外单层培养。分别于转染后48h和4周采用原位杂交、免疫组化和碱性磷酸酶、钙化学染色方法检测BMP2的基因蛋白表达以及对骨髓基质细胞成骨分化的影响。结果pcDNA3／BMP2酶切片段的大小与理论相符。转染后细胞能检测到BMP2基因和BMP2蛋白表达，并促进成骨转化。结论pcDNA3／BMP2转染骨髓基质干细胞中可获得短暂和长期表达，并加强骨髓基质细胞的成骨分化能力。     

人骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及分化的影响

目的：研究人骨形态发生蛋白-2腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染人骨髓基质干细胞(hBMSC)对其增殖及分化的影响。方法：利用免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞。BMP-2的表达。流式细胞仪和ALP活性测定分析BMP-2基因转染对细胞增殖、分化的影响。结果：转染后，hBMP-2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达。蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白阳性表达，S期细胞比例和ALP活性明显增高。结论：Ad-BMP-2可高效转染hBMSC，且促进细胞增殖和成骨转化。     

BMP2重组慢病毒转染兔BMSCs黏附DBM支架的生物矿化研究

目的 探究BMP2重组慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)黏附脱钙骨(DBM)支架体外构建转基因组织工程骨的生物矿化能力。方法 密度梯度离心及贴壁培养法获取第5代兔BMSCs,用BMP2重组慢病毒转染细胞，通过RT-PCR检测目的基因的表达，利用倒置荧光显微镜观察细胞在DBM支架上的生长情况，借助扫描电镜和能谱分析观测细胞在DBM支架上的表面微观形貌及生物矿化能力。结果 BMP2重组慢病毒成功转染兔BMSCs, RT-PCR显示转染后细胞能高效表达BMP2目的基因，在倒置荧光显微镜下观察见转染后细胞黏附在DBM支架上呈满天星样，并沿DBM支架孔隙内壁贴壁叠加生长、分裂增殖，扫描电镜下见细胞填满整个DBM支架孔隙，分泌大量细胞外基质，并在DBM支架表面形成凹凸不平的光泽结晶矿化物，能谱分析显示其钙磷比(Ca/P)为1.89±0.31,与正常骨组织成分相近(P>0.05)。结论 BMP2重组慢病毒转染兔BMSCs黏附DBM支架构建的转基因组织工程骨成功完成了生物矿化过程，体现出较好的生物矿化能力。     

转BMP-7基因BMSCs复合nHAC体外培养的实验研究

目的 建立能够稳定表达骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的骨髓基质干细胞(BMSCs),并与纳米羟基磷灰石胶原(nHAC)材料复合培养体外构建组织工程骨.方法 用慢病毒把人BMP-7基因和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因导入大鼠BMSCs,用G418筛选获得阳性细胞后接种于nHAC支架体外复合培养.荧光显微镜下观察eGFP表达, 判断感染效率;以四唑盐(MTT)实验检测细胞活力;RT-PCR、ELISA检测目的基因表达;碱性磷酸酶(ALP)活性检测成骨能力;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%;MTT实验显示细胞活性较未转染组无明显差异(P＞0.05);RT-PCR检测到BMP-7表达,在1 300 bp处出现特异性条带;ELISA检测24h BMP-7蛋白含量为(150.2±18.3)pg/ml;ALP活性以第16天左右最强;扫描电镜见细胞种植nHAC支架后粘附、生长良好.结论 BMP-7可在BMSCs内稳定表达,并诱导其向成骨分化;与nHAC复合培养可构建组织工程骨.     

慢病毒介导骨形态发生蛋白-7基因的干细胞用于组织工程骨构建的实验研究

目的 建立能够稳定表达骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的骨髓基质干细胞(BMSCs),观察其成骨分化,并与纳米羟基磷灰石胶原(nHAC)材料复合培养体外构建组织工程骨的可行性.方法 实验分4组:BMP-7和eGFI基因转染组(A组)、eGFP基因转染组(B组)、常规成骨诱导组(C组)、未转染组(D组).用G418筛选获得阳性细胞后接种于nHAC支架体外复合培养.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断转染效率;以逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)、ELISA检测目的基因表达,四唑盐(MTT)实验检测细胞活力,碱性磷酸酶(ALP)活性和Gomori染色榆测成骨情况;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%.RTPCR检测到A组在1300 bp处出现特异性条带,其他组结果阴性;ELISA检测24 h BMP-7蛋白含量为(150.2±18.3)pg/mL,种植支架复合培养8周后BMP-7含量为(76.6±7.4)pg/mL;MTT实验显示细胞活性与未转染组比较差异无统计学意义(P>0.05);ALP活性以16 d最强;扫描电镜见细胞种植nHAC支架后黏附、生长良好.结论 BMP-7可在BMSCs内稳定表达,并诱导其向成骨分化;与nHAC复合培养可构建组织工程骨.     

腺病毒介导BMP-2和EGFP基因转染兔骨髓基质干细胞及种植脱钙骨的体外观察

目的用腺病毒载体介导人骨形态发生蛋白-2及EGFP基因转染兔骨髓基质干细胞(rBMSC),种植DBM(脱钙骨)支架体外构建组织工程骨。方法兔髓基质干细胞(rBMSC)的分离、培养;流式细胞仪检测细胞表面标记;转染后,荧光显微镜观察细胞最适感染复数(MOI)及蛋白印迹检测外源基因的表达情况;采用Urist提供的方法制备脱钙骨(DBM),用细胞计量法测定BMSCs与DBM复合培养的黏附率。然后将转染后细胞接种到DBM支架上,用荧光显微镜观察细胞是否成功粘附于支架材料上,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果 BMSCs细胞表型鉴定:CD44表达阳性,CD45表达阴性;转染后,蛋白印迹试验检测到BMP-2表达增高;骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质的平均粘附率为(72.74±1.99)%;扫描电镜见转染细胞生长良好,伸出丝状突起,相互连接。结论成功培养及鉴定兔BMSCs,Ad-BMP-2/EGFP可高效转染兔BMSCs,转染后的细胞种植于DBM支架材料后生长状况良好,组织工程骨构建成功。     

骨形态发生蛋白-2基因转染兔骨髓基质干细胞及复合纳米羟基磷灰石体外构建组织工程骨的研究

目的 探讨腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2表达载体(Ad-BMP-2)转染兔骨髓基质干细胞(rBMSCs)后复合到纳米羟基磷灰石(Nano-HA)体外构建仿生人工骨的可行性. 方法 采用GatewayTM技术构建腺病毒载体,溶胶-絮凝法制备Nano-HA,用Ad-BMP-2转染体外培养的rBMSCs,免疫组化、RT-PCR和蛋白印迹方法检测转染后细胞的BMP-2表达.将转染48 h的细胞均匀接种到Nano-HA支架上,第3、5天取细胞载体复合物扫描电镜观察细胞贴附、生长状况,消化收集贴附支架的细胞,蛋白印迹检测贴附支架细胞BMP-2的表达.结果 转染后BMP-2基金在mRNA水平和蛋白水平均有高表达;扫描电镜见转染细胞在支架材料分布均匀,黏附良好,转染后及复合后Western Blot检测BMP-2表达较高.结论 利用转基因技术,用含目的基因的腺病毒载体转染靶细胞复合到Nano-HA,细胞载体复合物稳定长效地分泌生长因子,体外成功地构建了仿生人工骨.     

人骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及分化的影响

目的:研究人骨形态发生蛋白-2腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染人骨髓基质干细胞(hBMSC)对其增殖及分化的影响.方法:利用免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达.流式细胞仪和ALP活性测定分析BMP-2基因转染对细胞增殖、分化的影响.结果:转染后,hBMP-2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达.蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白阳性表达,S期细胞比例和ALP活性明显增高.结论:Ad-BMP-2可高效转染hBMSC,且促进细胞增殖和成骨转化.     

纳米羟基磷灰石和重组胶原及聚乳酸复合材料作为骨形态发生蛋白2活性多肽缓释载体的实验研究

目的探讨纳米羟基磷灰石／重组胶膨聚乳酸（nano-hydroxyapatite／recombinanthuman-like collagen／polylactic acid，nHA／RHLC／PLA）复合多孔支架材料作为骨形态发生蛋白2（Bonemorphogenetic protein2，BMP2）活性多肽载体的可行性。方法制备nHA／RHLC／PLA复合多孔支架材料，扫描电镜观察支架材料表面微观形貌；通过真空吸附法将BMP2活性多肽与支架材料复合，采用高效液相色谱仪检测不同时问点BMP2活性多肽的释放量，观察BMP2活性多肽的体外释放规律；将复合了BMP2活性多肽的支架材料作为实验组，未复合BMP2活性多肽的支架材料作为对照组，分别植入大鼠背部肌肉内，于4周和8周两个时间点将大鼠分批处死，进行CT扫描、三维重建和组织学观察。结果扫描电镜结果显示：支架材料表面呈多孔状；体外BMP2活性多肽释放规律为：第1d表现为爆发性释放释放量为35．5％，以后缓慢持续释放，至1个月左右释放量达89．6％；CT扫描、三维重建和组织学观察结果均表明复合了BMP2活性多肽的多孔支架材料有较多新生骨组织形成，对照组未见成骨现象。结论nHA／RHLC／PLA复合多孔支架材料可以作为BMP2活性多肽的缓释载体，负载BMP2活性多肽的nHA／RHLC／PLA是一种理想的骨组织工程支架材料。     

BMP-2重组腺病毒转染肌源细胞体内外成骨的实验研究

目的探讨经重组腺病毒(Ad—BMP-2)转染的肌源细胞(muscle—derived cells)可否表达骨形成发生蛋白-2(BMP-2)及其体内外的成骨作用．方法Ad—BMP-2在体外转染肌源细胞后回植体内，观察其转归及成骨活性一结果经Ad—BMP-2转染的肌源细胞中有BMP-2的表达，该细胞中有碱性磷酸酶、培养基中有骨钙素的存在，细胞植入体内后可诱导成骨。结论经Ad—BMP-2转染的肌源细胞在生物体内外均具有骨诱导活性.     

经骨向诱导的骨髓间充质干细胞在脱钙骨上生长行为的实验研究

目的:建立成骨细胞-脱钙骨支架复合物,观察其诱导成骨能力,从而探寻组织工程化骨的体外构建方法.方法:运用细胞沉淀法将大鼠BMSCs诱导形成的成骨细胞接种于脱钙骨支架,通过扫描电镜(SEM)、免疫荧光观察脱钙骨表面细胞生长情况,通过上清液碱性磷酸酶(ALP)活性及Ⅰ型前胶原羧端肽(PICP)、骨钙素检测观察成骨细胞活性.结果:扫描电镜示成骨细胞在脱钙骨表面生长良好,上清液ALP、PICP及骨钙素表达均明显高于对照组(P＜0.05),并随时间的增长而显著增加(P＜0.05).结论:采用细胞沉淀法成功将成骨细胞接种于脱钙骨支架,成骨细胞在支架材料中增殖旺盛,细胞活性状态良好,具有良好的骨形成能力,脱钙骨支架可作为骨组织工程中载体支架的较优选择.     

hBMP2与hVEGF165双基因腺病毒载体转染BMSCs复合n-HA/PA66组织工程骨构建及检测

[目的]探讨腺病毒介导共表达人骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)和血管内皮生长因子165(vascular endothelia growth factor 165,VEGF165)载体转染兔骨髓间充质干细胞复合纳米羟基磷灰石/聚酰胺66(nano-hydroxyapatite/polyamide66,n-HA/PA66)体外构建组织工程骨的可行性。[方法]采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),取第3代BMSCs进行细胞表型鉴定;第3代BMSCs作为细胞实验对象,实验共分2组:Ad-BMP2-VEGF165为实验组和Ad-GFP为对照组;首先用不同感染复数感染BMSCs,并进行ELISA和Western blot检测细胞h BMP2和h VEGF165的表达;其次将感染后的细胞接种到n-HA/PA66生物材料上,7 d后扫描电镜观察细胞贴附、生长状况;同时,7 d后消化收集贴附n-HA/PA66上的细胞,Western blot检测贴附生物材料细胞中骨钙素(osteocalcin,OC)和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的表达,以及3 d和7 d后的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定。[结果]第3代细胞表面高表达CD29(99.82%)和CD44(94.14%),低表达CD14(3.11%)和CD34(0.34%);腺病毒感染后h BMP2和h VEGF165蛋白水平高表达;扫描电镜见感染细胞分布均匀,生长状态良好。实验组与对照组相比,复合n-HA/PA66后Western Blot检测显示OC和OPN表达和ALP活性均较高,两组差异均有统计学意义(P<0.05)。[结论]Ad-BMP2-VEGF165双基因腺病毒感染BMSCs后目的蛋白较高量表达,同时感染后BMSCs可以在n-HA/PA66进行良好的黏附、生长、增殖、矿化,Ad-BMP2-VEGF165双基因表达组织工程骨构建成功。