不同标本对荧光实时定量PCR法测定HBV—DNA结果的影响

目的 利用沉淀煮沸裂解法提取HBV核酸，探讨不同的临床标本和贮存条件对荧光定量PCR法测定乙型肝炎病毒核酸（HBV－NDA）结果的影响，为临床标本的收集和贮存提供依据。方法 按不同要求收集特定的临床标本，用本实验室使用的HBV－DNA提取方法提取DNA模板，再用荧光实时定量PCR法检测HBV－DNA的含量。结果 经EDTA、中等含量肝素、枸橼酸钠抗凝血浆标本与相应血清标本测定HBV－DNA的含量无显著性差别均（P＞0．05），但高浓度肝素（1000U／ml)抗凝管结果显著降低（F值为25．96；P＜0．05）；溶血、高血脂标本、标本反复冻融、血浆（清）标本在室温下短期贮存（48h内）对HBV－DNA含量均无明显影响（P＞0．05）。结论 用本实验室使用的HBV－DNA提取方法，可使抗凝剂及其它PCR反应抑制物质对HBV－DNA测定结果影响降到最低，从而使临床无污染标本一般均可接受。     

三种HBV DNA提取方法对荧光定量PCR检测结果影响的比较

目的 研究3种核酸提取方法对黄疸、溶血和脂血标本HBV DNA荧光定量结果的影响,为进一步提高临床检验质最和改进检测技术提供理论依据.方法 采用目前临床常用的多聚糖病毒沉淀浓缩法(PEG法)、碱液直接裂解和微量核酸释放剂(Micro-Nucleic-Releaser,MNR)等3种核酸提取方法,对含有HBV的黄疸、溶血和脂血标本进行荧光定量PCR检测,研究不同标本对荧光PCR定量结果和扩增效率的影响.选择酚一氯仿提纯法作为核酸提取对照方法.结果 黄疸、溶血和脂血标本,对3种不同核酸提取方法的荧光PCR定量结果和扩增效率都产生不同程度的影响,其中完全溶血的标本对PCR扩增效率的影响最大,如定量值为4×103拷贝/ml的低拷贝完全溶血标本,MNR法测定结果为2.21×103拷贝/ml,PEG法为1.02×103拷贝/ml,碱性直接裂解法的定量值为阴性,临床自然溶血较重的标本对荧光定量检测影响较小,脂血和黄疸标本对荧光定量PCR扩增效率有明显抑制作用,但对实际定最值无明显影响;其中,MNR法在不同标本的定量重复性和荧光PCR扩增效率最好,碱液直接裂解法较差.酚.氯仿提纯法虽然获得较高的扩增效率,但存在大约有1个数量级的核酸丢失.结论 基于MNR核酸提取方法的荧光定量PCR检测,对不同的临床标本均可获得较好的扩增效率、敏感性和重复性,操作简便、快速且无核酸丢失和污染,适合临床检验应用.     

荧光探针定量PCR检测HBV—DNA

本文采用荧光探针定量（ＦＱ－ＰＯＣＲ）法准确定量检测ＨＢＶ－Ｍ阳性标志中的ＨＢＶ－ＤＮＡ数量。结果显示：ＨＢｅＡｇ（＋组（３２份）的阳性率为１００％,ＨＢＶ－ＤＮＡ拷贝数范围在１０＾５－１０＾９／ｍｌ之间。ＨＢｅＡｂ（＋）组（４７份）的阳性率为２３．４％,ＨＢＶ－ＤＮＡ拷贝范围在１０＾３－１０＾５．７／ｍｌ之间;ＨＢｓＡｂ（＋）组（３７份）的阳性率为２．７％,ＨＢＶ－ＤＮＡ拷贝数为１０＾５／ｍｌ。     

标本前处理方法对乳汁HBV DNA检测的影响

目的探索一种简单易行的乳汁标本前处理方法 ,以便准确测定乳汁中的HBVDNA浓度。方法 4℃冰箱过夜后取中间层乳汁进行检测,以离心后的上清液、上清液浓缩、沉淀3种方法平行检测20份大三阳产妇的乳汁HBVDNA含量。结果沉淀方法检测阳性率为98%,明显高于其他2种方法 (均P0.01)。阳性标本HBVDNA的对数浓度为4.8±0.5,与其他2种方法比较,差异有统计学意义(均P0.01)。结论 4℃冰箱过夜后取中间层乳汁离心沉淀检测HBVDNA是比较准确可靠的,方法简单易行,值得临床推广应用。     

溶血对荧光定量PCR检测低水平HBV DNA的影响

HBV DNA定量能反映乙型肝炎病毒的复制情况,在临床诊断、治疗等方面具有重要的参考价值。在留取标本时要求较为严格,一般规定溶血者为不合格标本,因为其中的血红蛋白（Hb）在核酸提取时可能无法彻底去除,会抑制核酸扩增从而影响结果的准确性。     

不同标本对荧光实时定量PCR法测定HBV0-DNA结果的影响

目的　利用沉淀煮沸裂解法提取HBV核酸 ,探讨不同的临床标本和贮存条件对荧光定量PCR法测定乙型肝炎病毒核酸(HBV NDA)结果的影响 ,为临床标本的收集和贮存提供依据。方法　按不同要求收集特定的临床标本 ,用本实验室使用的HBV DNA提取方法提取DNA模板 ,再用荧光实时定量PCR法检测HBV DNA的含量。结果　经EDTA、中等含量肝素、枸橼酸钠抗凝血浆标本与相应血清标本测定HBV DNA的含量无显著性差别均 (P >0 0 5 ) ,但高浓度肝素 (10 0 0U/ml)抗凝管结果显著降低 (F值为 2 5 96 ;P <0 0 5 ) ;溶血、高血脂标本、标本反复冻融、血浆 (清 )标本在室温下短期贮存 (48h内 )对HBV DNA含量均无明显影响 (P >0 0 5 )。结论　用本实验室使用的HBV DNA提取方法 ,可使抗凝剂及其它PCR反应抑制物质对HBV DNA测定结果影响降到最低 ,从而使临床无污染标本一般均可接受     

荧光定量PCR检测乙肝患者HBV DNA的临床价值

我们通过检测228例乙肝患者血清HBV DNA拷贝数及乙肝病毒血清标记物的检测，发现HBV DNA的定量检测更能真实反映乙肝病毒在体内的复制和感染程度。     

乙型肝炎病毒血清DNA定量检测的临床意义

目的　探讨乙型肝炎病毒 (HBV)感染者乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸 (HBV DNA)定量检测的临床意义 ,以及与乙型肝炎血清学e系统 (HBe)标志、丙氨酸转氨酶 (ALT)和天冬氨酸转氨酶 (AST)水平的相关性。方法　采用荧光标记探针定量聚合酶链反应 (PCR)技术、酶联免疫吸附测定法及速率法 ,对 14 0例乙型肝炎病毒感染者乙型肝炎病毒血清DNA含量、血清学标志、ALT和AST进行检测 ;同时动态检测了 2 0例乙肝患者 2 4周拉米夫定治疗期间的血清HBe标记系统和HBV DNA含量变化。结果　e抗原 (HBeAg)阳性组的HBV DNA含量 (M =6 .4 8)显著高于e抗体 (HBeAb)阳性组的HBV DNA含量 (M =4 .2 8) ,差异有统计学意义 (H =2 8.4 8,P <0 .0 0 1) ;不同临床类型乙肝患者的HBV DNA含量检测结果之间的比较 ,差异无统计学意义 (H =2 .181,P >0 .0 5 ) ;在拉米夫定治疗期间 ,血清HBV DNA含量的下降和转阴明显先于血清学标志系统的转换。结论　HBeAg是反映HBV DNA复制的重要指标 ,HBeAg阳性表示乙型肝炎病毒复制活跃 ,但在抗病毒治疗期间 ,血清学标志指标反映HBV复制状态存在局限性 ,HBV DNA定量检测是反映HBV复制和判断药物疗效的最直接、可靠的指标 ;乙型肝炎患者病程的变化、ALT和AST水平与HBV复制是否活跃没有直接相关关系     

慢性乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA定量检测的临床意义

目的探讨慢性乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（HBV cccDNA）的临床意义。方法选取经肝组织病理学诊断的慢性乙型肝炎患者57例,其中乙型肝炎e抗原（HBeAg）阳性37例,HBeAg阴性20例;肝组织炎症轻度33例,肝组织炎症中度24例。采用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）同时定量检测其血清HBVDNA和cccDNA。结果HBeAg阳性组血清HBV cccDNA对数值和阳性率分别高于阴性组,8.1±1.3vs6.5±1.9,73.0%vs30.0%（均P〈0.01）。肝组织炎症轻度组（G1～G2）血清HBVcccDNA对数值低于中度组（G3）,7.1±0.4vs8.5±0.4（P〈0.01）。血清cccDNA与丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶呈正相关（r=0.612、0.632,均P〈0.05）。结论血清HBVcccDNA为病毒复制的标志物,与肝组织细胞损伤相关。     

PCR-反向点杂交法检测 HBV 耐药变异与基因型的探讨

目的：探讨 PCR-反向点杂交法检测 HBV 耐药变异与基因型的相关性及 HBV 变异位点与肝功能指标、HBVDNA病毒载量的关系。方法筛选符合条件的462例服用核苷类药物治疗的慢性乙型肝炎患者血清标本,用 PCR-反向点杂交法检测 HBV 的耐药突变位点以及基因型,并对 HBV 耐药变异与基因型、肝功能检测指标、HBV DNA 病毒载量等指标进行相关性分析。结果在462例服用核苷类药物治疗的慢性乙型肝炎患者血清中检测耐药变异株45例,变异率约为9．74％;其中180M 和204I/V 突变株16例,35．5％;204V 突变株6例,13．3％;204I 突变株13例,28．9％;180V 突变株3例,6．7％;181V 突变株3例,6．7％;207I 突变株1例,2．2％,236T 突变株3例,6．7％。HBV 基因型中 B 基因型105例,C 基因型337例,B 基因型和 C 基因型联合感染4例,D 基因型0例,其他基因型2例。将检测结果与临床资料进行相关性分析：乙肝患者的耐药变异位点与基因型、肝功能指标 ALT 无相关性（P ＞0．05）,与 HBVDNA 病毒载量有一定相关性（P ＜0．05）。结论1．茂名地区的 HBV 基因型可能与其他南方地区的基因型有差异,以 HBV-C 基因型为主;2．PCR-反向点杂交法是一种快速、准确发现核苷类药物治疗后耐药位点的检测方法;3．通过临床资料分析显示乙肝患者的耐药变异位点与肝功能指标 ALT 间差异无统计学意义（P ＞0．05）,即无相关性,HBV-DNA 病毒载量间差异有统计学意义（P ＜0．05）,即有一定相关性。     

PCR测定乙型肝炎病毒DNA弱阳性质控血清的适用性研究

为确定目前国内PCR测定乙型肝炎病毒 (HBV)DNA弱阳性质控血清的浓度水平 ,将已知浓度的 10倍系列稀释的 5份质控血清寄发给全国 91个临床和试剂生产厂家实验室 ,让其以室内常规方法检测 ,回报测定结果由我处统计分析。结果表明 ,目前全国PCR测定HBVDNA灵敏度不高 ,当样品HBVDNA含量低于 5× 10 5拷贝 /ml时 ,大部分实验室 (5 6 0 % )测不出来 ,不同厂家试剂对上述样品的检出差异较大。因此 ,目前国内PCR测定HBVDNA弱阳性质控血清的浓度以 10 5拷贝 /ml为宜     

荧光定量PCR法检测HBV DNA同血清标志物关系的探讨

目的　探讨荧光定量PCR法 (FQ PCR)检测HBVDNA同血清标志物的关系。方法　将FQ PCR法检测HBVDNA的标本用ELISA法重新测定HBV血清标志物前S1抗原 (PreS1 )及乙型肝炎病毒标志物。结果 1 86份HBVDNA阳性标本中 ,HBsAg阳性率 98.92 % ,抗 HBc阳性率 94 .0 9 % ,有 2例HBsAg阴性 ,其中 1例为抗 HBc单独阳性。PreS1阳性率为 6 1 .83% ,HBeAg阳性率为6 6 .6 7% ,后二者同时检出率 4 2 .4 7% ,联合检出率 86 .0 2 % ,PreS1和HBeAg阳性率无显著性差异 (P>0 .0 5 ) ;HBVDNA阴性而HBsAg阳性标本 1 1 4例 ,抗 HBc阳性率为 96 .4 9% ,PreS1阳性率为 2 2 .81 % ,HBeAg阳性率为 5 .2 6 % ,后二者同时检出率 3.5 1 % ,PreS1和HBeAg阳性率差异非常显著 (P<0 .0 0 1 ) ;HBV低水平和高水平复制标本PreS1和HBeAg检出率无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;HBVDNA阳性标本中 ,对于PreS1和HBeAg而言 ,PreS1单独阳性者HBVDNA对数值为 6 .6 5 4± 2 .2 0 3(x±s) ,HBeAg单独阳性者为 6 .892± 1 .5 79,同时阳性者 6 .70 6± 1 .6 4 3,均阴者为6 .32 1± 1 .76 3,四组间无显著性差异。结论　血清PreS1和HBeAg与HBVDNA关系密切 ,可作为HBV复制的标志物 ,尤其二者联合检测效果更好 ,但以HBeAg特异性较高。二者存在状态与HBV复制程度关系不     

慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞内乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸与肝组织损伤程度相关性分析

目的研究慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)内乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)与肝组织损伤程度的相关性。方法采用聚合酶链反应方法测定119例慢性乙型肝炎患者PBMC内HBV-DNA定量,并对肝组织进行病理学诊断。结果119例乙型肝炎患者PBMC内HBV-DNA检出率为71.4%,轻度、中度、重度慢性乙型肝炎患者PBMC内HBV-DNA阳性率分别为58.1%、69.4%、84.6%;慢性乙型肝炎患者PBMC内HBV-DNA检出率与肝组织损伤程度呈正相关(rs=0.912,P<0.05)。结论PBMC中HBV-DNA阳性率随肝损害加重而升高。     

多对型特异性引物巢式PCR检测乙型肝炎病毒基因型分析

目的采用多对型特异性引物通过巢式PCR法检测HBeAg阳性患者血清中乙肝病毒(HBV)基因型的分布情况。方法根据从前S1基因到S基因中的保守序列设计出10条内外引物,并将其中8条内引物分成A、B两组分别扩增A、B、C和D、E、F型HBV,然后将第2轮PCR的两组产物分别用3%琼脂糖进行电泳,根据PCR产物片段大小直接判定HBV基因型。用该法检测15例慢性乙肝患者血清中HBV基因型,了解HBV基因型分布情况。结果 HBV基因分型结果为B型7例(46.7%)、C型4例(26.7%)、B+C型2例(13.3%),另有2例未能分型。结论人群HBV优势基因型以B型为主,C型次之。     

乙型肝炎病毒DNA与血清标志物的关系

目的探讨乙型肝炎(下称乙肝)免疫标志物(HBV-M)两对半模式与乙肝病毒核酸(HBV DNA)阳性率及复制水平之间的关系和临床意义。方法乙肝患者血清分别采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测乙肝两对半免疫指标(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc),实时荧光定量-聚合酶链反应(FQ-PCR)检测HBV DNA含量,并对结果进行对比分析。结果在HBV-M不同模式中,HBV DNA的阳性率不同,HBV DNA含量也不相同;在HBV-M中HBeAg阳性与HBV DNA检出率呈正相关。以HBsAg(+)HBeAg(+)抗-HBc(+)组(大三阳组)HBV DNA的阳性率最高,病毒载量较高。结论不同HBV-M具有不同的临床意义,而HBV DNA是衡量乙肝传染性的最精确指标,是确定HBV感染不同复制状态的检测手段,HBV DNA阳性表明有完整的病毒颗粒复制,即有传染性。因此,联合检测HBV-M和HBV DNA,不仅可以提高检出率,避免漏诊,而且为临床对HBV感染、复制、传染性判定以及抗病毒治疗的疗效评估提供了更为可靠的判定依据。     

两种核酸提取方法检测血清丙型肝炎病毒核糖核酸的比较

目的比较两种不同核酸提取方法检测血清丙型肝炎病毒核糖核酸（HcuRNA）对临床诊断的应用价值。方法对128份HcV抗体阳性的患者血清,同时用两种实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）方法检测HCV—RNA并检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平,这两种方法分别是用二氧化硅微粒法提取RNA和纯化柱法提取RNA。结果128份HCV抗体阳性的血清中二氧化硅微粒法HCV—RNA阳性率41．41％,纯化柱法HcV—RNA阳性率59．38％,纯化枉法优于二氧化硅微粒法,差异有统计学意义（x2=8．27,P〈0．05）。49份HCV抗体阳性的血清中ALT异常,且ALT浓度变化与纯化柱法HCV—RNA水平呈正相关性（r=0．95,P〈0．05）。结论血清HCV—RNA检测对丙型肝炎诊断和病情监测均有重要的临床意义,采用纯化柱法提取RNA具有更优的临床价值。