转染反义微小RNA-155对人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431生长的影响

目的 观察转染反义微小RNA?155（miRNA?155）对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株增殖、凋亡以及细胞迁移和侵袭的影响。方法 A431细胞分为3组,采用脂质体介导法转染无义序列miRNA?155（无义序列组）、反义序列 miRNA?155（反义序列组）或仅用含Lipofectamine 2000的DMEM（空白对照组）处理。实时定量聚合酶链反应检测转染后各组A431细胞miRNA?155的表达水平,噻唑蓝法检测转染后24、36、72、96、120 h细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期变化和凋亡情况,Transwell法检测细胞迁移与侵袭力。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD?t检验。结果 转染后,无义序列组、反义序列组与空白对照组中A431细胞miRNA?155相对表达量分别为0.98 ± 0.02、0.28 ± 0.18、1.00 ± 0.01,3组差异有统计学意义（F = 634.57,P < 0.001）,反义序列组低于空白对照组和无义序列组,均P < 0.05。孵育72、96、120 h时,3组细胞存活率差异均有统计学意义（均P < 0.05）,反义序列组细胞存活率在3个时间点均低于空白对照组和无义序列组（均P < 0.05）;3组细胞G0/G1期细胞比例、S期细胞比例、细胞增殖指数差异均有统计学意义（F = 23.46、36.81、19.35,P < 0.01）。反义序列组G0/G1期细胞比例（74.63% ± 2.13%）高于空白对照组（62.92% ± 2.56%）和无义序列组（63.75% ± 3.06%）,均P < 0.05;S期细胞比例及细胞增殖指数（9.88% ± 1.83%、25.36 ± 2.13）低于空白对照组（18.86% ± 2.78%、37.08 ± 2.56）和无义序列组（18.33% ± 3.72%、36.25 ± 3.06）,均P < 0.05;反义序列组迁移细胞数和侵袭细胞数低于空白对照组和无义序列组（均P < 0.05）。结论 皮肤鳞状细胞癌A431细胞转染反义miRNA?155可减少miRNA?155的表达,有效抑制A431细胞增殖、迁移、侵袭,促进其凋亡。     

生存素小分子干扰RNA对皮肤鳞状细胞癌A431细胞生存素基因表达及生物学功能的影响

目的 探讨生存素小分子干扰RNA（siRNA）对皮肤鳞状细胞癌A431细胞生存素基因表达及细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭力的影响。方法 培养的A431细胞分为3组：生存素siRNA组、阴性对照组和空白对照组,分别用50.0 nmol/L脂质体包裹的生存素基因序列特异性siRNA、无关序列siRNA阴性脂质体及预制囊泡转染。实时定量反转录-聚合酶链反应（RT?PCR）、Western印迹法分别检测A431细胞生存素mRNA及蛋白的表达。采用MTT比色法检测细胞增殖,流式细胞仪膜联蛋白Ⅴ/碘化丙锭双染法检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭力,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果 转染后48 h,生存素siRNA组、阴性对照组、空白对照组A431细胞中生存素mRNA水平分别为0.56 ± 0.15、0.88 ± 0.37、0.90 ± 0.43,蛋白表达水平分别为0.59 ± 0.04、0.86 ± 0.05、0.91 ± 0.07,差异均有统计学意义（F = 276.67、243.61,均P < 0.001）,且生存素siRNA组生存素mRNA和蛋白表达水平均显著低于阴性对照组和空白对照组,差异均有统计学意义（P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（均P > 0.05）。重复测量方差分析显示,转染生存素siRNA能抑制A431细胞增殖（F = 13.19,P = 0.004）,且生存素siRNA组A431细胞增殖抑制率明显高于阴性对照组和空白对照组（均P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组比较,差异无统计学意义（P > 0.05）。转染后24 h, 3组间A431细胞凋亡率差异有统计学意义（F = 83.97,P = 0.002）,且生存素siRNA组A431细胞凋亡率显著高于阴性对照组（P < 0.05）和空白对照组（P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（P > 0.05）。转染后48 h,生存素siRNA组G2/M期细胞比例显著高于阴性对照组（P < 0.05）和空白对照组（P < 0.05）,而生存素siRNA组A431细胞迁移数及侵袭数均显著低于空白对照组（均P < 0.05）和阴性对照组（均P < 0.05）。结论 生存素序列特异性siRNA能抑制A431细胞生存素基因表达和细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭,提示生存素可成为皮肤鳞状细胞癌基因治疗的靶点。     

Hedgehog信号通路在皮肤鳞状细胞癌中表达

目的 探讨Hedgehog信号转导通路在皮肤鳞状细胞癌中的激活水平及抑制该信号通路对鳞状细胞癌增殖的影响。方法 免疫组化和原位杂交方法检测鳞状细胞癌皮损及正常皮肤中Hedgehog信号通路靶基因Ptch-1和Gli-1的表达水平和分布。MTT和BrdU掺入的方法,检测Hedgehog信号转导通路特异性抑制剂环巴胺对Tca鳞状细胞癌细胞生长和增殖的影响。结果 在鳞状细胞癌皮损中Ptch-1表达高于正常人皮肤（免疫组化χ2 = 5.656,P < 0.05;原位杂交χ2 = 6.787,P < 0.01）,Gli-1表达也高于正常人皮肤（免疫组化χ2 = 6.732,P < 0.01;原位杂交χ2 = 9.600,P < 0.01）,阳性颗粒主要分布于鳞状细胞癌细胞胞质中。MTT和BrdU掺入实验均显示环巴胺可以抑制Tca鳞状细胞癌细胞的生长和增殖。结论 鳞状细胞癌皮损中Hedgehog信号转导通路处于激活状态,抑制该通路可能对鳞状细胞癌起到一定的治疗作用。     

小檗碱对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖和凋亡的影响北大核心CSCD

目的 探讨小檗碱对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株增殖及凋亡相关信号通路中Bax与Bcl-2表达的影响.方法 体外培养A431细胞,分别用含12.5、25、50、100 mg/L小檗碱的培养液（实验组）、含250 mg/L顺铂的培养液（阳性对照组）、正常培养液（空白对照组）作用于A431细胞12、24、48、72 h后,用噻唑蓝（MTT）法测定小檗碱对A431细胞生长的抑制作用;倒置显微镜观察小檗碱作用后细胞形态学改变;实时定量RT-PCR法检测小檗碱对A431细胞Bax和Bcl-2基因表达的影响;免疫荧光法分析Bax和Bcl-2的表达情况.采用SPSS 13.0软件进行多因素方差分析.结果 MTT结果显示,小檗碱对A431细胞的生长抑制作用随作用时间的延长而增强（F=510.927,P〈0.001）,随浓度的增加而增强（F=1118.312,P＜ 0.001）,小檗碱浓度与作用时间的交互作用有统计学意义（F=70.239,P＜ 0.001）,表明不同浓度小檗碱组各时间点的变化趋势不完全一致.倒置显微镜下可见,随着药物浓度增加,A431细胞密度减少,由多角形变为圆顿皱缩.实时定量RT-PCR结果表明,小檗碱作用后,随着时间或浓度的增加,Bax/Bcl-2 mRNA相对表达量增加,同一浓度小檗碱（25、50、100 mg/L）作用4、8、12h组间比较,差异均有统计学意义（F=226.231、1 300.636、4 325.139,P＜ 0.001）.免疫荧光染色显示,小檗碱作用后A431细胞内Bax荧光增强,而Bcl-2减弱.结论 小檗碱对A431细胞的生长抑制作用呈时间和浓度依赖性,Bax和Bcl-2的表达改变可能是小檗碱诱导A431细胞凋亡的途径之一.     

西达本胺对恶性黑素瘤细胞系A375的体外抗增殖作用

目的 研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达本胺对体外培养的皮肤恶性黑素瘤细胞株A375细胞的抗癌作用。方法 用不同浓度的西达本胺和曲古抑菌素A处理A375细胞,以噻唑蓝法检测西达本胺和曲古抑菌素A对A375细胞体外增殖的影响;Annexin V-EGFP/PI双荧光活染-流式细胞测量法检测细胞凋亡率;DNA倍体分析检测细胞周期。结果 西达本胺和曲古抑菌素A可明显抑制A375细胞增殖,西达本胺在5 ~ 500 μmol/L浓度范围内呈量效关系,其中50 ~ 500 μmol/L浓度范围内在作用0 ~ 120 h时间内呈时效关系。曲古抑菌素A在0.1 ~ 1 μmol/L浓度范围内呈量效关系,其中在0.25 ~ 1 μmol/L浓度范围内作用0 ~ 120 h呈时效关系。西达本胺和曲古抑菌素A作用A375细胞48 h的IC50分别为250和0.7 μmol/L。西达本胺（62.5,125,250 μmol/L）作用48 h后诱导A375细胞的凋亡率分别为80.27% ± 3.06%、79.53% ± 5.70%、83.13% ± 6.90%,曲古抑菌素A（0.175,0.35,0.7 μmol/L）作用48 h后诱导A375细胞的凋亡率分别为16.27% ± 2.46%、28.83% ± 2.55%、83.40% ± 8.65%,显著高于空白对照组（10.43% ± 0.96%）（P < 0.01）。西达本胺（62.5,125,250 μmol/L）作用48 h后诱导A375细胞发生G0/G1期阻滞,G0/G1期细胞比例分别为76.30% ± 6.06%、82.79% ± 0.74%、88.91% ± 5.29%,与空白对照组（38.73% ± 3.36%）比较,差异有统计学意义（P < 0.01）;曲古抑菌素A（0.35,0.7 μmol/L）作用48 h后诱导A375细胞发生G2/M期阻滞,G2/M期细胞比例分别为25.15% ± 2.71%、58.71% ± 3.45%,与空白对照组（15.73% ± 0.23%）比较,差异有统计学意义（P < 0.01）。结论 西达本胺和曲古抑菌素A在体外能诱导A375细胞发生周期阻滞,促使细胞凋亡,抑制细胞生长。     

氨基酮戊酸光动力疗法对鳞状细胞癌细胞株A431蛋白激酶D1及其磷酸化位点的影响

目的 研究氨基酮戊酸光动力疗法（ALA-PDT）对皮肤鳞状细胞癌A431细胞蛋白激酶D1（PKD1）的影响,探讨ALA-PDT诱导A431细胞凋亡的机制。方法 体外培养A431细胞,用CCK-8法检测筛选出抑制作用最强的ALA浓度和光动力照射（PDT）剂量组合。将对数期生长A431细胞随机分为不予任何干预的对照组、ALA组、PDT组及ALA-PDT组,观察4组细胞接受相应干预12、24、36、48 h后细胞增殖抑制率和增殖抑制作用最强时间点的凋亡率。反转录PCR检测ALA-PDT作用A431细胞不同时间点后各组PKD1基因mRNA的表达。Western 印迹法检测各组A431细胞中PKD1及其磷酸化位点Tyr463蛋白（pTyr463）、Ser916蛋白（pSer916）表达。结果 ALA浓度1.5 mmol/L、光照剂量2 J/cm2为最佳剂量组合。4组细胞干预12、24、36、48 h的增殖抑制率差异有统计学意义（F = 39.56,P < 0.05）。孵育24 h时：ALA-PDT组细胞增殖抑制率（46.26% ± 1.25%）高于ALA组（14.65% ± 0.33%）、PDT组（14.96% ± 0.68%）和对照组（11.98% ± 0.32%）,差异有统计学意义（均P < 0.05 ）;ALA-PDT组细胞增殖抑制率高于12 h（P < 0.05）;4组细胞凋亡率差异有统计学意义（F = 16.32,P < 0.05）,ALA-PDT组（41.92% ± 3.23%）高于对照组（4.67% ± 0.88%）、ALA组（7.02% ± 1.52%）和PDT组（8.37% ± 0.59%）,均P < 0.05。ALA-PDT作用于A431细胞后0、6、12、24、36、48 h,细胞PKD1基因mRNA的相对表达量差异有统计学意义（F = 22.24,P < 0.05）,孵育24 h mRNA相对表达量低于0、6、12 h（均P < 0.05）,与36、48 h差异无统计学意义（均P > 0.05）。4组A431细胞中pSer916表达量差异无统计学意义（F = 1.53,P > 0.05）,PKD1和pTyr463表达量差异有统计学意义（F值为10.04、8.27,均P < 0.05）,ALA-PDT组PKD1、pTyr463的表达低于对照组、ALA组、PDT组（均P < 0.05）。结论 PKD1可能参与ALA-PDT疗法诱导A431细胞凋亡的光化学反应进程,且可能是通过Tyr463位点活化促进癌变的发展。     

曲古菌素A对A431细胞生长停滞与DNA损伤诱导蛋白45α表达及对细胞增殖凋亡的影响

目的 探讨不同浓度曲古菌素A对A431细胞生长停滞与DNA损伤诱导蛋白45α(Gadd45α)表达及对细胞增殖、凋亡的影响.方法 0.05、0.1、0.25、0.5、1μmol/L曲古菌素A处理A431细胞,采用CCK8法检测曲古菌素A对A431细胞增殖的影响;流式细胞仪检测药物处理后A431细胞周期、凋亡率的变化;RT-PCR及Western印迹法检测Gadd45α mRNA及蛋白的表达.结果 不同浓度曲古菌素A均能抑制A431细胞的增殖,在一定时间范围内(6、12、24、48 h),随药物浓度增加,细胞存活率下降,具有明显剂量依赖性;同一药物浓度下,细胞存活率随时间延长而下降,有时间依赖性.0.1、0.25、0.5 μmol/L曲古菌素A作用A431细胞24 h后,G1期细胞比例依次为26.910％±0.799％、30.406％±0.625％、32.896％±0.599％,较对照组(21.633％±1.144％)显著增高(F=105.93,P＜ 0.05);A431细胞早期凋亡率、晚期凋亡率均有递增的趋势;A431细胞Gadd45α mRNA表达随浓度增加而表达增强;Western印迹结果显示,A431细胞Gadd45α蛋白A值分别为0.6536±0.2193、0.6990±0.0110、0.9040±0.1971,较对照组(0.3766±0.0241)增高(F=332.88,P＜ 0.05).结论 曲古菌素A在体外可诱导A431细胞上调Gadd45α表达;Gadd45α可能参与了曲古菌素A处理后A431细胞的抑制增殖、诱导凋亡过程.     

光诱导纳米二氧化钛抑制人表皮鳞状细胞癌细株A431的实验研究

目的 探讨纳米二氧化钛(TiO2)颗粒光催化活性对人表皮鳞状细胞癌细胞株A431的生长抑制效应及机制.方法 单纯紫外线(主要波长为253.7 nm,功率30 W,光距30 cm,照射时间15 min)、不同浓度(100、200、300、400、500、600 mg/L)纳米TiO2及纳米TiO2+紫外线作用于A431细胞,采用噻唑蓝(MTT)法检测上述因素对A431细胞生长抑制率的影响;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染法检测A431细胞凋亡率;罗丹明123(Rho123)染色法检测A431细胞线粒体跨膜电位的变化.采用SPSS13.0统计软件进行t检验和方差分析,组间比较采用SNK检验.结果 实验干预24、48、72 h后,100、200、300、400、500、600 mg/L纳米TiO2+紫外线组A431细胞的生长抑制率增高,且呈浓度依赖效应,3个时间点不同浓度组比较,F值分别为21.54、77.56、20.27,P值均＜0.05(n=6),SNK检验示各组间差异均有统计学意义;而不同浓度单纯纳米TiO2组细胞生长抑制率在3个时间点均无明显增高,差异均无统计学意义(P值均＞ 0.05).纳米TiO2联合紫外线照射可诱导A431细胞发生凋亡,并降低A431细胞线粒体跨膜电位,100、200、400 mg/L纳米TiO2+紫外线组凋亡率分别为8.86％±0.22％、11.72％±0.29％、31.24％±0.78％,空白对照组为2.69％±0.28％,经方差分析,差异有统计学意义(F=256.61,P＜0.05,n=3);以上3个浓度组线粒体跨膜电位总荧光强度值分别为758.48±15.42、676.60±14.35、557.71±13.12,空白对照组为2943.65±70.26,经方差分析,差异有统计学意义(F=208.57,P＜0.05,n=3),SNK检验示各组间差异均有统计学意义.结论 纳米TiO2+紫外线对A431细胞有生长抑制作用,并能诱导细胞凋亡,线粒体跨膜电位下降可能是其诱导细胞凋亡的机制之一;单纯纳米TiO2对A431细胞的生长无抑制作用.     

泛素结合酶2S在恶性黑素瘤中的表达及其对黑素瘤细胞生物学行为的影响

【摘要】 目的 探讨恶性黑素瘤（MM）组织中泛素结合酶2S（UBE2S）的表达及其对黑素瘤细胞生物学行为的影响。方法 应用免疫组化检测UBE2S在128例原发性MM、64例转移性MM、16份非瘤组织（8份瘤旁组织、8份正常表皮组织）芯片中的表达。实时定量PCR检测A375、MUM?2B及MUM?2C黑素瘤细胞株中UBE2S mRNA表达水平。将黑素瘤A375及MUM?2B细胞株分别分为两组,干扰组使用含有UBE2S RNA干扰序列的慢病毒转染,对照组使用含有对照序列的慢病毒转染, 72 h后实时定量PCR检测 A375和MUM?2B黑素瘤细胞株中UBE2S mRNA表达水平。用试剂盒检测各组细胞caspase3/7活性,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率及周期分布;应用Transwell法及Western印迹分别检测敲减UBE2S对A375细胞迁移侵袭能力及N-钙黏蛋白表达的影响。使用SPSS 22.0软件进行统计学分析,正态分布数据组间比较采用独立样本t检验,计数资料采用卡方检验,非正态分布数据比较采用Mann?Whitney U检验,通过Spearman系数评估UBE2S表达水平与T分期的相关性。结果 UBE2S在98例（51.0%）MM组织中高表达,16例非瘤组织中均低表达,两组间高表达率差异有统计学意义（χ2 = 11.905,P＜0.01）;UBE2S表达水平与肿瘤T分期呈负相关（ρ = -0.210,P = 0.043）。A375、MUM?2B、MUM?2C细胞间UBE2S mRNA相对表达量差异有统计学意义（F = 817.228,P＜0.01）。Caspase3/7活性在干扰组A375细胞（t = 17.572,P＜0.01）与干扰组MUM?2B细胞（t = 24.552,P＜0.01）分别较相应对照组明显增加;干扰组A375细胞较对照组G1期细胞比例明显升高（t = 7.365,P＜0.01）,而S期比例明显降低（t = -9.190,P＜0.01）,G2/M期无明显变化（t = -0.227,P＞0.05）;干扰组MUM?2B细胞G1期（t = 12.676,P＜0.01）、G2/M期（t = 13.045,P＜0.01）细胞比例高于对照组,但S期比例低于对照组（t = -15.718,P＜0.01）。Transwell实验显示,干扰组较对照组A375细胞迁移（t = -35.727,P＜0.05）及侵袭（t = -125.000,P＜0.01）能力降低。Western印迹检测显示,干扰组较对照组A375细胞N-钙黏蛋白表达下调。结论 UBE2S在黑素瘤组织过表达,其表达水平与肿瘤分期相关;敲减UBE2S对黑素瘤细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移及侵袭能力均有影响,并且可能通过调控N-钙黏蛋白表达促进MM细胞转移。     

重楼皂苷Ⅰ对人黑素瘤A375细胞增殖和凋亡的影响北大核心CSCD

目的 研究重楼皂苷Ⅰ对人黑素瘤A375细胞增殖和凋亡的影响及相关机制。方法 采用CCK8法测定0（对照组）、1.5、3.0、6.0 mg/L重楼皂苷Ⅰ对正常人黑素细胞和A375细胞增殖的影响;Hoechst33258荧光染色法观察细胞凋亡形态;流式细胞仪检测A375细胞周期变化及细胞凋亡水平;荧光染料（DCFH？DA）测定A375细胞内活性氧的变化;罗丹明123染色测定线粒体膜电位变化;利用分光光度法检测重楼皂苷Ⅰ处理后的A375细胞内ATP和上清液中乳酸、葡萄糖含量;Western印迹法检测A375细胞内Bcl？2、Bcl？2相关X蛋白（Bax）、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3、细胞周期蛋白D1、丙酮酸激酶同工酶2（PKM2）表达。多组均数比较采用单因素方差分析,组间多重比较采用SNK？q检验。结果 在工作浓度内重楼皂苷Ⅰ对正常人黑素细胞增殖无明显影响,但能明显抑制 A375 细胞的增殖（P 〈 0.01）;荧光显微镜下发现,重楼皂苷Ⅰ处理后的 A375 细胞出现明显的凋亡形态。0（对照组）、1.5、3.0、6.0 mg/L重楼皂苷Ⅰ分别处理A375细胞后,随重楼皂苷Ⅰ浓度增加,细胞凋亡率（分别为4.25% ± 1.27%、10.03% ± 1.49%、36.62% ± 1.97%、44.11% ± 2.47%）逐渐升高（F = 665.7,P 〈 0.01）,G0/G1期细胞比例（分别为54.13% ± 2.57%、67.35% ± 3.79%、74.39% ± 3.29%、82.29% ± 3.99%）亦渐增多（F = 71.81,P 〈 0.01）;细胞内活性氧呈明显上升趋势,细胞线粒体膜电位呈明显下降趋势（P 〈 0.01）;细胞内ATP含量下降（P 〈 0.01）,培养液中乳酸含量下降,葡萄糖含量上升（P 〈 0.01）;细胞Bax、cleaved？caspase？3蛋白表达增多,但Cyclin D1、Bcl？2和PKM2蛋白表达下降（P 〈 0.01）。结论 重楼皂苷Ⅰ可能通过激活细胞内活性氧的产生,引起线粒体膜电位下降,诱导A375细胞凋亡,并通过抑制PKM2、细胞周期蛋白D1表达,使细胞阻滞于G0/G1期。     

黄芩素对A431细胞埃兹蛋白表达及侵袭力的影响

目的 探讨黄芩素是否通过抑制埃兹蛋白来实现抑制A431细胞增殖、细胞周期进程及伪足的形成。方法 采用细胞划痕、微孔滤膜法（Transwell）检测黄芩素对A431细胞爬行的影响;RT－PCR检测黄芩素对A431细胞埃兹蛋白mRNA表达量的影响;Western印迹检测黄芩素及siRNA对A431细胞埃兹蛋白表达及其磷酸化的影响;扫描电镜观察黄芩素及siRNA对A431细胞伪足形成的影响。结果 细胞划痕实验显示,培养24 h时,黄芩素 5、10、20 μmol/L组细胞闭合宽度占原宽度的比例分别为13.3% ± 1.7%、7.6% ± 1.6%和5.9% ± 1.3%,黄芩素呈浓度依赖性抑制A431细胞爬行运动,黄芩素各组与阴性对照组（16.3% ± 2.3%）比较,差异均有统计学意义。Transwell实验证实,5、10、20 μmol/L黄芩素处理A431细胞48 h后,穿过人工基底膜的细胞数量分别为（46.5 ± 3.8）、（34.3 ± 3.4）和（25.3 ± 2.3）个/Hp,各处理组与阴性对照组（56.3 ± 3.8个/Hp）经方差分析,P < 0.01;而与siRNA组（28.3 ± 2.1个/Hp）比较,P > 0.05。Western印迹及RT－PCR检测显示,0、5、10、20、40 μmol/L黄芩素处理A431细胞48 h后,黄芩素呈浓度依赖性地抑制A431细胞埃兹蛋白/磷酸化埃兹蛋白及埃兹蛋白mRNA表达,埃兹蛋白mRNA与β-肌动蛋白mRNA灰度值之比值与阴性对照组比较,P值均 < 0.01;而与siRNA组比较,P > 0.05;埃兹蛋白、磷酸化埃兹蛋白在A431细胞中的表达量（与β-肌动蛋白灰度值之比）与阴性对照组比较,P值均 < 0.01;而40 μmol/L黄芩素处理组与siRNA处理组比较,P > 0.05。扫描电镜显示,48 h后20 μmol/L黄芩素组A431细胞伪足数量为（5.3 ± 1.9）个,长度明显缩短,与阴性对照组（22.6 ± 2.8个）比较,P < 0.01;siRNA组为（4.5 ± 2.8）个,与阴性对照组比较,P > 0.05。结论 黄芩素可能通过直接或间接抑制埃兹蛋白表达及其磷酸化而抑制A431细胞的增殖、爬行,从而达到抗肿瘤增殖及浸润转移的目的。     

三种黄芩提取物诱导人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞凋亡的研究

目的 探讨黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素3种黄芩提取物对人皮肤鳞状细胞癌细胞株SCL-1细胞凋亡的影响。 方法 将培养的SCL-1细胞分别用浓度为12.5、25、50、75、100 μmol/L的3种黄芩提取物作用12、24、48 h后,噻唑蓝（MTT）法检测上述药物对SCL-1细胞的生长抑制作用。膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭双染法和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测SCL-1细胞凋亡率。流式细胞仪检测细胞周期。应用线性内差法,测定半数抑制浓度（IC50）;两样本均数比较用Student t检验;多样本均数比较采用方差分析,各样本之间多重比较采用SNK-q检验。 结果 3种黄芩提取物均可抑制SCL-1细胞的生长,并具有浓度及时间依赖性（均P ＜ 0.01）;在相同的药物浓度及作用时间下,黄芩素对SCL-1细胞生长抑制作用最强,黄芩苷抑制作用最弱,汉黄芩素抑制作用介于二者之间,差异具有统计学意义（均P ＜ 0.01）。12.5 μmol/L黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素分别作用SCL-1细胞48 h均可诱导SCL-1细胞凋亡并阻滞细胞周期的进程,其中G1期细胞比例分别为56.37% ± 2.41%、74.23% ± 2.02%、64.15% ± 1.87%,早期凋亡率分别为8.09% ± 1.02%、24.13% ± 0.76%、14.45% ± 1.57%,与对照组（45.04% ± 1.93%,4.12% ± 0.29%）比较,差异均有统计学意义（F = 83.29,186.37,均P ＜ 0.01）;其中黄芩素作用最强,其次为汉黄芩素,黄芩苷作用最弱。 结论 黄芩能抑制SCL-1细胞生长并诱导其凋亡,为皮肤鳞状细胞癌的中药治疗开拓新的思路。     

特异性抑制Hedgehog信号通路对鳞状细胞癌Tca细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨特异性抑制Hedgehog信号通路对人鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)细胞增殖抑制及诱导凋亡的作用。方法用Hedgehog信号通路的特异性抑制剂KAAD-cyclopamine处理Tca细胞,采用MTT法观察KAAD-cyclopamine对Tca细胞增殖的影响,倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪测定细胞凋亡率和细胞周期的变化,凋亡率检测使用Annexin-V-FITC/PI双染法,细胞周期采用PI染色法。结果随着KAAD-cyclopamine作用时间的延长及浓度的增加,其对Tca细胞增殖的抑制作用增强(F=25.39,P<0.01)。流式细胞仪检测显示:随着KAAD-cyclopamine浓度的增加,细胞凋亡率逐渐增加(F=43.67,P<0.01);细胞周期表现为G2/M期阻滞。结论KAAD-cyclopamine通过下调Hedgehog信号通路的活性,抑制人鳞状细胞癌Tca细胞增殖并促进其凋亡,诱导细胞发生G2/M期阻滞为其可能机制之一。     

黄芩素、阿维A诱导人皮肤鳞状细胞癌SCL-12细胞凋亡的研究

目的 探讨黄芩素、阿维A对人皮肤鳞状细胞癌细胞株SCL-12细胞凋亡的影响。方法 不同浓度黄芩素、阿维A单独及联合作用于SCL-12细胞,噻唑蓝（MTT）法检测上述药物对SCL-12细胞的生长抑制作用;膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）双染法和ELISA法检测SCL-12细胞凋亡率;实时荧光定量RT-PCR法检测Fas mRNA的表达。结果 黄芩素、阿维A单独及联合应用均可抑制SCL-12细胞的生长,除3.125 μmol/L黄芩素与2.5 μmol/L阿维A联合用药组外,其余各联合用药组与单药作用组相比,抑制作用明显增强,且抑制作用随用药浓度的增加而增强。3.125 μmol/L黄芩素、5.0 μmol/L阿维A单独及联合应用48 h后均可诱导SCL-12细胞凋亡,早期凋亡率分别为9.39% ± 1.52%、20.86% ± 2.16%、36.85% ± 3.26%,与对照组（4.39% ± 0.64%）比较,差异均有统计学意义（P值均 < 0.05）;联合用药组对SCL-12细胞凋亡的诱导作用显著强于单药作用组,差异有统计学意义（F = 138.44,P < 0.05）。黄芩素、阿维A单独及联合应用48 h后均可上调SCL-12细胞Fas mRNA表达水平,联合用药组SCL-12细胞的Fas mRNA表达水平显著高于单药作用组。结论 黄芩素、阿维A单独及联合应用均能抑制SCL-12细胞生长并诱导其凋亡,两种药物的联合应用对SCL-12细胞具有协同效应,其发生机制可能与上调Fas凋亡调控基因的表达有关。     

辛伐他汀对缺氧黑素瘤细胞A375增殖凋亡及迁移的影响

目的 探讨辛伐他汀对缺氧黑素瘤细胞A375增殖、凋亡、迁移调控的分子机制.方法 在常氧或缺氧环境下体外培养A375细胞,细胞分为辛伐他汀处理的辛伐他汀组与二甲基亚砜处理的对照组,通过CCK-8细胞计数试剂盒检测细胞活力,Annexin V/PI凋亡实验检测细胞凋亡,插入式细胞培养皿transwell迁移实验检测细胞迁移.RT-PCR法、Western印迹法检测辛伐他汀组与对照组细胞低氧诱导因子(HIF)-1α、生存素、细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子(P27),以及沉默缺氧A375细胞的HIF-1α后的生存素、p27 mRNA与蛋白表达水平.结果 常氧或缺氧环境下,辛伐他汀组与对照组A375细胞增殖活力、凋亡细胞比例、细胞迁移数组间差异均有统计学意义(F值95.84、37.22、177.5,均P＜0.001),缺氧对照组A375细胞的增殖活力(1.391±0.129)、细胞迁移数(322.550±26.226)均高于常氧对照组(0.807±0.049、125.583±17.256)、缺氧辛伐他汀组(0.685±0.417、115.167±12.050)(P＜ 0.001);缺氧对照组细胞凋亡比例(6.167％±2.714％)均低于常氧对照组(11.833％±2.483％)、缺氧辛伐他汀组(17.833％±2.714％)(P＜0.01).缺氧辛伐他汀组HIF-1αmRNA与蛋白水平、生存素mRNA与蛋白水平均低于对照组(P＜ 0.05);P27mRNA与蛋白水平均高于对照组(P＜0.05).沉默缺氧A375细胞中HIF-1α后,生存素mRNA与蛋白水平均低于对照组(t值为5.346、8.281,P＜0.05),P27 mRNA与蛋白水平高于对照组(t值为31.37、9.954,P＜0.01).结论 辛伐他汀可抑制缺氧A375细胞的增殖及迁移,促进凋亡,其机制可能与HIF通路有关.     

InnVit基因对B10BR细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的 分析InnVit基因的抑制和过表达对永生化黑素细胞株B10BR细胞增殖、周期及凋亡的影响,探讨InnVit基因的生物学功能及其对白癜风中黑素细胞缺失的影响。方法 化学合成InnVit基因特异性siRNA片段以及构建过表达质粒载体P3XF-P120,lipofectamineTM 2000脂质体方法转染B10BR细胞。半定量RT-PCR法检测InnVit基因mRNA水平;Western印迹检测该蛋白水平变化;MTT法测定细胞增殖情况;流式细胞技术分析细胞周期和凋亡的变化。结果 InnVit基因抑制后mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组,InnVit基因过表达质粒组mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组;转染后24、48、72 h抑制组的细胞存活量极显著下降（P < 0.01）,过表达质粒组的细胞存活量在48和72 h极显著增加（P < 0.01）。转染后48 h基因抑制组的早期凋亡率从（10.24 ± 1.00）%升至（37.34 ± 3.26）%,过表达质粒组早期凋亡率从（14.58 ± 1.49）%降至（8.43 ± 0.86）%,与对照组比较,差异均有统计学意义（P < 0.01）;转染48 h基因抑制组的G1期细胞由（56.11 ± 5.46）%增至（69.76 ± 6.08）%（P < 0.05）,过表达质粒组的G1期细胞由（55.14 ± 5.65 ）%降至（29.33 ± 3.01）%（P < 0.01）。结论 InnVit基因抑制使细胞增殖能力下降,促进细胞凋亡;InnVit基因的过表达增强了细胞的增殖能力,抑制细胞凋亡。其增殖能力的改变可能是通过细胞周期的调控调节的。     

槲皮黄酮通过Sphk2抑制人皮肤鳞状细胞癌A431细胞的增殖

目的：研究槲皮黄酮（Quercetin, Qu）对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖活性的影响。方法：采用CCK8法、Western blot实验和流式细胞术检测不同浓度下（10、50、100、200 μg/mL）A431细胞活力、增殖及凋亡相关指标;Western blot检测Qu对A431细胞中Sphk2信号通路的影响。结果：10、50、100、200 μg/mL Qu作用96 h后,细胞OD值分别为（0.654±0.098）、（0.527±0.089）、（0.412±0.076）、（0.309±0.054）;细胞活力分别为（81.3±4.6）%、（56.3±4.9）%、（37.4±4.2）%、（19.4±3.6）%;细胞凋亡率分别为（6.43±1.09）%、（14.77±1.26）%、（21.30±1.36）%、(29.84±1.26)%。Qu呈浓度依赖性的抑制细胞中Sphk2蛋白表达,且Qu+Sphk2 mimics组细胞活力明显高于于Qu,细胞凋亡率明显低于Qu组(Ps<0.05)。结论：Qu可能通过抑制Sphk2信号通路降低人皮肤鳞状细胞癌细胞的增殖活性。     

CDK2基因沉默联合达卡巴嗪对B16-F1黑素瘤的生长抑制作用

目的 探讨CDK2基因沉默后对达卡巴嗪(DTIC)治疗B16-F1黑素瘤抑瘤效应的影响.方法 实验设对照组、CDK2-shRNA组、DTIC组、CDK2-shRNA+ DTIC组,MTT法检测各组细胞生长抑制情况,计算药物相互作用指数(CDI值),AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况.建立C57 BL/6小鼠B16-F1细胞移植瘤模型,分组实验,持续观察18d,绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤生长抑制率,TUNEL检测肿瘤组织细胞凋亡情况.结果 与对照组相比,CDK2-shRNA组、DTIC组、CDK2-shRNA+ DTIC组在72h的细胞相对存活率分别为(40.6±2.8)％、(45.2±3.7)％、(28.7±2.1)％,细胞凋亡率分别为(25.1±3.3)％、(15.6±2.2)％和(45.6±3.5)％,细胞相对存活率显著降低(F=458.04,P＜ 0.05)而细胞凋亡率显著升高(F=115.46,P＜0.05),其中CDK2-shRNA+ DTIC组比DTIC组的细胞相对存活率显著降低(P＜0.01),而细胞凋亡率显著升高(P＜0.01);两药相互作用指数(CDI值)＜0.7.治疗第6天,对照组、CDK2-shRNA组、DTIC组及CDK2-shRNA+ DTIC组的肿瘤体积分别为(185.44±68.97) mm3、(83.91±14.33)mm3、(123.70±20.85) mm3、(34.54±10.72) mm3.从治疗的第6天开始,与对照组相比,CDK2-shRNA组、DTIC组及CDK2-shRNA+ DTIC组的肿瘤生长速度明显降低(F=11.819,P＜0.05),而CDK2-shRNA+ DTIC组的肿瘤生长速度明显低于DTIC组(P=0.04);与对照组相比,CDK2-shRNA组、DTIC组、CDK2-shRNA+ DTIC组的肿瘤生长抑制率分别为52.2％、41.2％、86.4％,组织细胞凋亡指数分别为(32.93±3.72)％、(21.62±3.54)％、(63.29±4.74)％,组织细胞凋亡指数显著升高(F=222.25,P＜0.05),其中CDK2-shRNA+ DTIC组的组织细胞凋亡指数显著高于DTIC组(P＜0.01).结论 沉默CDK2基因的表达可以增加DTIC对黑素瘤的生长抑制作用,二者体外有协同效应,通过增加肿瘤细胞的凋亡是其机制之一.