携带人可溶性TRAIL基因的重组腺病毒在肺癌细胞中的转染效率及表达特性研究

目的研究重组腺病毒感染肺腺癌细胞A549的转染效率及重组腺病毒介导的人可溶性肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(hTRAIL95-281)基因的体外表达。方法用不同感染滴度(MOI)(0-10 000 VP/cell)的重组腺病毒Ad-CMV-EGFP转染A549细胞后48 h收集细胞,经流式细胞仪检测其转染效率,并在共聚焦荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达;用MOI为5 000 VP/cell的Ad-CMV-EGFP感染肿瘤细胞后不同时间(24 h、48 h、72 h和96 h)收集细胞,经流式细胞仪检测其转染效率;用重组腺病毒Ad-CMV-hTRAIL95-281感染293T细胞后不同时间收集培养物用ELISA方法检测上清中的TRAIL表达。结果重组腺病毒载体对A549细胞的转染效率和绿色荧光蛋白表达在一定范围内随着MOI的增加而增高,MOI为5 000 VP/cell时转染效率达峰值,MOI为10 000 VP/cell时转染效率反而降低。重组腺病毒转染A549细胞后72 h内转染效率随时间的变化而增高,峰值为98%,96 h有所降低(P0.05)。转染重组腺病毒Ad-CMV-hTRAIL95-281的293T细胞在转染后24 h表达量最高(P0.001),达到131.45 pg/ml,48 h时TRAIL蛋白表达量明显降低(P0.01),72小时也有继续降低的趋势。结论重组腺病毒在适宜的MOI值下,在A549细胞中96小时内均有较高的转染效率,且重组腺病毒介导的可溶性hTRAIL基因在体外能够有效表达。     

hTERT启动子调控的TRAIL基因对乳腺癌细胞株的杀伤作用

目的探讨hTERT、CMV启动子调控下TRAIL基因对乳腺癌细胞的生长抑制作用。方法脂质体法将pACCMV-EGFP-TRAIL、pAChTRET-EGFP-TRA／L转染至乳腺癌细胞MDA-MB-435,MTT法检测转染前后乳腺癌细胞的增殖变化,流式细胞术检测细胞凋亡变化。结果pACCMV-EGFP-TRAIL转染组和pAChTRET-EGFP-TRAIL转染组OD490值明显低于空白对照组和空质粒转染组,流式细胞术检测细胞凋亡率也明显增高,并且pAChTRET-EGFP-TRAIL转染组稍高于pACCMV-EGFP-TRAIL转染组。结论pAChTRET-EGFP-TRAIL、pACCMV-EGFP-TRAIL对乳腺癌细胞的生长有明显的抑制作用和诱导凋亡作用,为乳腺癌的基因治疗研究奠定基础。     

双靶向TRAIL过表达联合辐射对乳腺癌MDA—MB-435细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨Egr-1和hTERT双靶向介导TRAIL过表达联合辐射对乳腺癌细胞增殖和凋亡的作用,为肿瘤基因一放射治疗提供必要的参考。方法实验分为正常对照组（Contr01）、CRAd．pEgr-1-TRAIL组、2．0Gy照射组及CRAd．pEgr-1-TRAIL＋2．0Gy照射组。病毒感染和X射线照射后,分别采用CCK-8试剂盒和AnnexinV—FITC试剂盒检测细胞增殖和细胞凋亡。结果随着时间延长,各组细胞均表现增殖状态,control和CRAd．pEgr-1-TRAIL组MDA-M昏435细胞增殖较快,且无明显差异,而2Gy和CRAd．pEgr-1-TRAIL＋2．0Gy组细胞增殖较慢,且以CRAd．pEgr-1-TRAIL＋2．0Gy组更明显,48h时甚至出现增殖抑制;2．0Gy组（24和48h）和CRAd．pEgr-1-TRAIL＋2．0Gy组（12,24和48h）均较control组显著增加（P〈0．05,P〈0．01）,而且CRAd．pEgr-1-TRAIL＋2．0Gy组（24和48h）也较2．0Gy组显著增加（P〈0．05,P〈0．01）。与control组比较,CRAd．pEgr-1-TRAIL组细胞凋亡无显著变化,而2．0Gy组和CRAd．pEgr-1-TRAIL＋2．0Gy组细胞凋亡显著增加（P〈0．05,P〈0．01）,尤其以CRAd．pEgr-1-TRAIL＋2．0Gy组更明显,与2．0Gy组比较,具有统计学差异（P〈0．05）。结论电离辐射能诱导MDA—MB-435细胞增殖抑制和凋亡增加,双靶向介导的TRAII．过表达能增强这种作用。     

携带TRAIL基因慢病毒载体的构建及其体外感染淋巴瘤细胞效率

本研究目的构建携带人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因的慢病毒载体,并研究其对不同细胞系的淋巴瘤细胞的感染效率。采用分子克隆技术,将针对TRAIL基因mRNA的cDNA片段插入到克隆载体pGM-T,构建pGM-T-TRAIL,然后将测序正确的TRAIL基因克隆至慢病毒表达载体pWPI,构建慢病毒表达载体pWPI-TRAIL。最后利用pWPI/VSV-G/Δ8.2慢病毒包装系统,通过转染293T细胞,制备重组慢病毒plenti-TRAIL,并进行浓缩和滴度测定。将重组慢病毒载体感染不同来源的淋巴瘤细胞系,测定荧光表达评价感染效率,利用RT-PCR和Western blot法评价TRAIL基因的表达情况。结果表明,酶切鉴定及测序结果表明pGM-T-TRAIL和pWPI-TRAIL载体构建成功,滴度测定结果显示浓缩的重组慢病毒plenti-TRAIL浓度可达109IU/ml。感染效率结果显示YTS细胞较DOHH2和Jurkat细胞更易被慢病毒感染(P<0.05)。RT-PCR和Western blot实验表明淋巴瘤细胞后plenti-TRAIL感染后可有效地表达TRAIL基因。结论:成功构建了慢病毒表达载体pWPI-TRAIL,并制备出重组慢病毒plenti-TRAIL。plenti-TRAIL可以有效感染不同细胞来源的淋巴瘤细胞系,同时感染后的淋巴瘤细胞可以有效表达TRAIL基因。     

TRAIL的研究现状及其在血液系统肿瘤治疗中的应用

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)是新近发现的肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员,它通过与特异性信号传导受体结合,激活caspase蛋白酶,诱导肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞无明显影响。同时它的杀伤作用与传统的化疗药物又具有协同性,这使其有可能成为一个具有很大潜力的化疗药物。     

重组分泌型TRAIL腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建表达分泌型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）基因的重组腺病毒载体。方法采用PCR技术从人肝脏cDNA文库中扩增出编码114-281位氨基酸的TRAIL基因片段。将扩增的TRAIL插入含有分泌性信号肽IL-2的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-IL-2中,将其命名为pAdTrack-CMV-IL-2-TRAIL。pAdTrack-CMV-IL-2-TRAIL经PmeⅠ线性化后,电转化入转化了pAdEasy-1的BJ5183细胞。筛选重组腺病毒质粒pAd-sTRAIL。经HEK293细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒Ad-sTRAIL,氯化铯密度梯度离心纯化Ad-sTRAIL病毒,并测定病毒滴度。采用RT-PCR法和免疫荧光技术分别检测目的基因的表达。结果纯化后的Ad-TRAIL病毒滴度为3.12×10^15pfu/L。经RT-PCR扩增出长104 bp的基因片段。免疫荧光检测到了目的基因在U251细胞的高效表达。结论成功构建了重组分泌型TRAIL腺病毒载体,为下一步应用于脑肿瘤的基因治疗打下了基础。     

TRAIL在白血病中的研究现状及药物干预

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apop-tosis inducing ligand,TRAIL)是TNF超家族成员。TRAIL能选择性诱导肿瘤细胞凋亡、而对正常细胞无凋亡作用,同时它的杀伤作用与传统的化疗药物又具有协同性,使其成为最具有潜力的肿瘤治疗药物。本文就TRAIL的生物学特点及其受体、TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的机制及采用药物干预提高TRAIL诱导白血病细胞凋亡的作用进行综述。1 TRAIL的生物学特点及其受体TRAIL是在已表达序列数据库(expressed seqencedtag,EST)中寻找TNF与Fas配体具有序列同源性的分子时发现的,最早由Wiley等…     

阿霉素增强TRAIL诱导的人骨髓瘤细胞系KM3细胞凋亡的分子机制研究

目的探讨阿霉素增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导人骨髓瘤细胞系KM3细胞凋亡的分子机制。方法采用TUNEL法和流式细胞术比较单独TRAIL及联合应用阿霉素对KM3细胞凋亡率的影响。Westem blot法检测阿霉素诱导前后KM3细胞核内转录因子NF-κB亚单位蛋白P65以及死亡受体DR5表达的变化。结果流式细胞术分析显示，10、20、50、100ng／ml的TRAIL联合应用1μg／ml阿霉素诱导KM3细胞后，细胞凋亡率分别为20．88％、40．03％、57．87％和60．82％，显著高于单独应用阿霉素或TRAIL诱导的细胞凋亡率；与TUNEL法检测结果一致。KM3细胞经不同浓度阿霉素（0．5、1．0、2．0、4．0μg／m1）联合20ng／ml TRAIL处理后，DR5受体的表达量随应用阿霉素浓度的增加而上升，而细胞核内P65蛋白表达量则随阿霉素浓度的增加而下降。结论骨髓瘤细胞膜DR5表达量提高和NF-κB的核转移是阿霉素协同TRAIL诱导凋亡反应的重要分子机制。     

TRAIL的研究现状及其在血液系统肿瘤治疗中的应用

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）是新近发现的肿瘤坏死因子（TNF）超家族成员，它通过与特异性信号传导受体结合，激活caspase蛋白酶，诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无明显影响。同时它的杀伤作用与传统的化疗药物又具有协同性，这使其有可能成为一个具有很大潜力的化疗药物。     

TRAIL联合化疗药物对人宫颈癌Hela细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体 (TRAIL)对人宫颈癌Hela细胞的作用 ,以及与化疗药物的协同作用。方法将Hela细胞接种至 96孔培养板后分别加入浓度为l.0、10 .0、10 0 .0 μl/L的TRAIL、0 .1、1.0、10 .0mg/L的阿霉素 (ADM )和丝裂霉素 (MMC) ,及不同匹配的TRAIL MMC和TRAIL ADM ,采用四甲基偶氮唑盐 (MTT)比色法分别检测肿瘤细胞的生存率 ;将Hela细胞接种至 12孔板 ,培育 2 4h后加入不同浓度的TRAIL、ADM、MMC、TRAIL ADM、TRAL MMC ,用流式细胞术检测不同处理组肿瘤细胞的凋亡率和死亡率。结果 10 0 μg/LTRAIL引起细胞的凋亡率为 2 0 .1% ,与无药物组 1.1%的凋亡率有非常显著性差异 (P <0 .0 1) ;单独采用 10mg/LMMC、ADM对细胞的抑制率为 3 6.0 %和 44 .1% ,而 10 0 μg/LTRAIL与 10mg/LMMC、ADM联合后对细胞的抑制率分别达到 5 8.4%和 73 .7% ,两者有协同作用 (P <0 .0 5 )。结论在体外实验中 ,TRAIL可通过诱导宫颈癌Hela细胞的凋亡而产生抗肿瘤作用 ;TRAIL与化疗药物ADM、MMC有协同抗肿瘤作用。     

TRAIL联合药物诱导肿瘤细胞凋亡协同机制的研究

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis inducingligand,TRAIL）能选择性诱导肿瘤细胞和恶性转化细胞凋亡,对大多数正常细胞却无杀伤作用,被认为是一种非常具有发展潜力的抗肿瘤因子,近年已成为国内外研究的热点。许多学者发现在TRAIL联合各种药物作用于肿瘤细胞的过程中二者有协同效应,但不同药物与TRAIL协同诱导肿瘤细胞凋亡的机制各不相同。     

原发性胆汁性肝硬化患者外周血TRAIL基因表达水平初探

目的建立检测人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）mRNA的实时荧光相对定量方法,探讨其基因表达与原发性胆汁性肝硬化（PBC）的相关性。方法基于TaqMan—MGB探针技术,以B—actin基因为内参照,通过目的基因与内参基因荧光强度达到一定阈值时的循环数之差,即△Ct值定量原始模板浓度,建立实时荧光逆转录聚合酶链反应（FQ—RT—PCR）相对定量方法,检测30例PBC患者、25例乙型肝炎（简称乙肝）后肝硬化患者及30名正常人外周血单个核细胞（PBMC）TRAIL基因的表达,同时检测血浆γ－谷氨酰转肽酶（GGT）和碱性磷酸酶（ALP）浓度,并作相关性分析：结果PBC患者PBMCTRAIL基因检测的△Ct值为2．4±1．2,其相对表达量是正常对照组的6．96倍,差异有统计学意义（P〈0．05）,乙肝后肝硬化患者TRAIL基因△Ct值为3．3±1．7,其相对表达量是正常对照组的3．73倍,差异有统计学意义（P〈0．05）,而PBC组与乙肝后肝硬化组比较,差异无统计学意义（P〉0．05）。PBC患者TRAIL的△Ct值与GGT浓度的对数值呈显著相关（r=－0．396,P〈0．05）。结论PBC患者及乙肝后肝硬化患者PBMC TRAIL基因表达水平明显升高,提示TRAIL在自身免疫性肝病及肝脏病毒损伤中均具有重要作用。     

原发性胆汁性肝硬化患者外周血TRAIL基因表达水平初探

目的建立检测人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)mRNA的实时荧光相对定量方法,探讨其基因表达与原发性胆汁性肝硬化(PBC)的相关性。方法基于TaqMan-MGB探针技术,以β-actin基因为内参照,通过目的基因与内参基因荧光强度达到一定阈值时的循环数之差,即△Ct值定量原始模板浓度,建立实时荧光逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)相对定量方法,检测30例PBC患者、25例乙型肝炎(简称乙肝)后肝硬化患者及30名正常人外周血单个核细胞(PBMC)TRAIL基因的表达,同时检测血浆γ-谷氨酰转肽酶(GGT)和碱性磷酸酶(ALP)浓度,并作相关性分析。结果PBC患者PBMC TRAIL基因检测的△Ct值为2.4±1.2,其相对表达量是正常对照组的6.96倍,差异有统计学意义(P<0.05),乙肝后肝硬化患者TRAIL基因△Ct值为3.3±1.7,其相对表达量是正常对照组的3.73倍,差异有统计学意义(P<0.05),而PBC组与乙肝后肝硬化组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。PBC患者TRAIL的△Ct值与GGT浓度的对数值呈显著相关(r=-0.396,P<0.05)。结论PBC患者及乙肝后肝...     

肝病患者血清肿瘤标记物含量及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体表达在癌变中的临床意义

目的 探讨血浆透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型胶原(ⅢC)、Ⅳ型胶原(ⅣC)、甲胎蛋白(AFP)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)受体-2(DR5)、诱捕受体-1(DcR1)的表达与肝纤维化及肝癌变的关系.方法 用ELISA方法测定正常对照组(A 组)、肝炎组(B 组)及肝硬化并发肝癌组(C 组)的HA、ⅢC、ⅣC 及LN 和AFP 的含量,用WesternBlotting 检测肝癌手术的癌组织、癌旁组织AFP、DR5 和DcR1 的表达.结果 HA、LN、ⅢC、ⅣC 和AFP 的血清含量由高到低:C 组＞B 组＞A 组;(1)ⅢC、ⅣC、LN 的相关性:A、B、C 组ⅢC、ⅣC、LN 表达呈正相关,r 分别为0.623、0.651、0.714 (P 均＜0.05).(2)C 组的各个观察指标均高于B 组和A 组,特别是血清AFP 和HA 含量,在A 组和B 组之间尽管也有统计学的意义(P ＜0.05),但是C 和A、B 组比较,这两者的含量显著性升高(P ＜0.001).(3)Western Blotting 分析显示,癌旁组织的AFP 和DcR1 表达明显低于癌组织(P 均＜0.05);而DR5 在癌旁组织表达则明显高于癌组织(P 均＜0.05).结论 由肝炎到肝硬化、肝癌的过程中HA 的累聚以及LN、ⅢC、ⅣC 和AFP 的表达是一个渐进的基因激活过程;AFP、DR5 和DcR1 在肝癌组织的表达变化预示癌细胞耐受凋亡诱导.     

携带Pdcd5基因的三调控增殖性腺病毒的构建及鉴定

本研究旨在构建一种表达pdcd5基因的三调控增殖性腺病毒。应用DNA重组技术将pdcd5cDNA插入三调控条件增殖性腺病毒SG600的E3区,SG600病毒系统是运用人端粒酶反转录酶基因启动子（hTERTp）和缺氧反应元件（HRE）分别调控病毒复制必须基因E1a和E1b的表达,去除E1a基因CR2区中24个核苷酸而构建成的靶向肿瘤细胞增殖的病毒系统。采用酶切及PCR鉴定并筛选重组成功的质粒。荧光显微镜下观察带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的重组腺病毒SG611—EGFP对白血病细胞系的感染效率。实时定量PCR检测感染重组腺病毒SG611．pdcd5的K562细胞pdcd5的表达水平。结果显示,构建的se611-pdcd5病毒能扩增出hTERTp、HRE、pd—cd5基因以及腺病毒骨架和11型纤突结基因序列。SG611-EGFP对白血病细胞系K562和MEG-01的感染效率均能达到70％以上。感染SG611-pdcd5的K562细胞pdcd5的表达水平较SG611空载体和携带pdcd5的非增殖性腺病毒（Ad-pdcd5）明显增加（P〈0．001）,其表达水平随感染复数增加而升高。结论：成功构建了三调控增殖性腺病毒SG611-pdcd5,后者能高效感染白血病细胞系并高效表达pdcd5,为进一步运用pdcd5靶向肿瘤细胞进行基因治疗的研究提供了基础。     

乳腺癌的基因治疗研究

乳腺癌的发生、发展是一个复杂的过程,涉及多种基因的改变。随着越来越多的乳腺癌相关基因被确认,基因治疗成为乳腺癌治疗的一个新途径和研究热点。乳腺癌基因治疗的方法主要有癌基因治疗、抑癌基因治疗、免疫基因治疗、多药耐药基因治疗、自杀基因治疗、抗血管生成治疗、miRNA治疗、联合基因治疗等。     

肝细胞癌患者肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的基因多态性与血清水平的临床意义

目的探讨肝细胞癌(HCC)患者肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因多态性及血清可溶性TRAIL(sTRAIL)水平及临床意义。方法收集HCC患者173例和健康人对照170例,提取全血基因组DNA,用测序法和PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法分析TRAIL基因第5外显子3'端非编码区(UTR)1289C/T、1525G/A、1588G/A、1595C/T基因多态性;用ELISA法检测血清sTRAIL浓度;用电化学发光法和生化定量分析法分别检测血清甲胎蛋白(AFP)和α-L岩藻糖苷酶(AFU)浓度。结果 HCC组与对照组比较,1289C/T、1588G/A、1595C/T基因型分布差异均有统计学意义(P0.05);HCC组1289C、1525G、1588G、1595C等位基因频率明显高于对照组(P0.05)。HCC组血清sTRAIL水平(78.8±49.2)pg/mL明显低于对照组(106.2±64.4)pg/mL(P0.05);根据TNM分期,Ⅰ、Ⅱ期HCC患者sTRAIL浓度明显高于Ⅲ、Ⅳ期(P均0.05)。HCC组根据TNM分期和肿瘤大小分组,TRAIL基因1289C/T、1525G/A、1588G/A、1595C/T位点基因型分布差异无统计学意义(P均0.05);根据TRAIL基因各位点基因型分组,组间血清sTRAIL水平差异均无统计学意义(P均0.05);HCC患者sTRAIL浓度与血清AFP、AFU浓度无相关性(P0.05)。结论 TRAIL基因(1289C/T、1525G/A、1588G/A、1595C/T)多态性及血清sTRAIL水平与HCC发生、发展可能相关,此结论还需继续研究。