靶向CD147纳米微泡的制备及超声成像能力检测

目的 制备靶向CD147纳米微泡造影剂,并评价其理化性质、对肝细胞肝癌(肝癌)细胞的靶向能力及超声成像能力.方法 将PLGA-PEG、DSPE-PEG2000-COOH、全氟丙烷饱和水溶液混合,通过偶联反应与CD147抗体结合,制备靶向CD147纳米微泡.将靶向CD147及非靶向纳米微泡分别与MHCC-97H(肝癌细胞...     

靶向血管内皮生长因子受体2微泡造影剂评价肿瘤血管生成的实验研究

目的:探讨靶向血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)微泡造影剂用于肿瘤血管生成的超声分子成像。方法:用生物素-亲和素桥接法制备靶向VEGFR2超声微泡,免疫荧光法检测微泡与抗体的结合。建立裸鼠Hep G2肝癌皮下种植瘤模型,随机分成靶向组(n=5)和非靶向组(n=5),经尾静脉团注相同剂量靶向微泡或非靶向微泡,录像并绘制时间-强度曲线(time-intensity curve,TIC);注入造影剂5 min后利用高声压爆破技术清除肿瘤内部微泡,比较爆破前后两组造影图像灰阶强度的下降,估计靶向微泡在体内与靶点的结合能力。结果:靶向造影剂和非靶向造影剂均表现为裸鼠皮下瘤的显著增强,但TIC显示两组间曲线下面积差异有统计学意义[(3 940.4±200.9)dB·s vs.(2 796.8±452.3)dB·s,P=0.001];微泡爆破后靶向组灰阶强度降低显著大于非靶向组[(7.61±2.20)dB vs.(3.74±1.40)dB,P=0.010]。结论:靶向VEGFR2微泡造影剂在体内能显著增强肿瘤血管成像,可作为监测肿瘤血管生成的较可靠分子影像学探针。     

靶向BST2微泡造影剂的制备及其与肿瘤细胞的体外结合能力

目的 制备骨髓基质抗原蛋白(BST2)靶向微泡造影剂,观察其与小鼠前列腺癌细胞(RM-1)和小鼠乳腺癌细胞(4T1)的体外结合能力,探讨BST2作为前列腺癌潜在靶点的可行性.方法 通过免疫荧光染色和蛋白质印迹法对BST2在两种细胞中的表达进行对比分析.采用生物素-亲和素桥连技术制备BST2靶向脂质微泡,普通光镜下观察BST2靶向微泡造影剂,并采用Accu Sizer 780A粒度仪进行表征,以非靶向微泡作为对照,比较其与RM-1和4T1两种肿瘤细胞系的结合特性及结合率.结果 BST2在RM-1细胞中的表达高于在4T1细胞中的表达;BST2靶向微泡与RM-1细胞的黏附率明显高于其与4T1细胞的黏附率,并远远高于非靶向微泡的黏附率.结论 BST2靶向微泡造影剂可与RM-1细胞特异性结合,有望作为前列腺癌的特异性超声分子探针用于前列腺癌的靶向分子成像.     

携载PSMA单抗靶向前列腺癌的纳米级脂质微泡的制备及体外寻靶能力

目的制备携载PSMA单抗靶向人前列腺癌的纳米级脂质微泡,并观察其体外寻靶能力。方法利用静电吸附法制备携载PSMA单抗靶向前列腺癌的脂质纳米级微泡,检测其一般特性;免疫荧光法检测抗体与纳米级微泡的结合情况;用细胞免疫荧光分析鉴定PSMA的表达及其在细胞膜上的定位;普通光镜下观察靶向微泡对前列腺癌细胞的寻靶能力,同时以胃癌细胞作对照。结果携载PSMA单抗的靶向纳米级微泡分布均匀,平均粒径为(623.70±66.05)nm,免疫荧光法显示微泡表面可见绿色荧光,细胞免疫荧光检测前列腺癌细胞膜高表达PSMA,体外寻靶实验显示该靶向微泡可与人前列腺癌LNCAP及C4-2细胞牢固结合,而与胃癌MKN45细胞不结合。结论本实验成功制备的携载PSMA单抗靶向人前列腺癌的纳米级脂质微泡具有较强的体外寻靶能力,能特异性地与前列腺癌细胞结合。     

叶酸靶向超声造影剂的制备及体外寻靶实验研究

目的 制备偶联叶酸的靶向超声微泡造影剂,鉴定其基本性质,并探讨体外寻靶能力.方法 将DSPE-PEG(2000)Folate溶入微泡成膜材料中,制备叶酸靶向超声微泡造影剂.用DFY型超声图像定量分析诊断仪检测微泡粒径和浓度.通过光镜和激光共聚焦显微仪观察该靶向造影剂对SKOV3细胞的体外寻靶情况,以普通超声微泡作对照.结果 靶向超声微泡的大小、粒径及分布与普通超声微泡相似.体外寻靶试验显示,该靶向微泡可以较多并牢固地聚集到SKOV3细胞表面,而普通微泡对照组未见特异性结合.结论 成功制备出偶联叶酸的靶向超声微泡造影剂.该造影剂在体外对高表达叶酸受体的SKOV3细胞具有较强的特异性亲合力,有望成为靶向显像卵巢癌的理想造影剂.     

携Herceptin靶向高分子造影剂的制备及体外寻靶能力研究

目的 制备一种携Herceptin的靶向高分子造影剂,并研究其体外寻靶能力.方法 通过双乳化法制备出高分子PLGA-COOH造影剂,采用碳二亚胺法将高分子PLGA-COOH造影剂与Herceptin相连制备出靶向高分子造影剂,检测其一般性质,然后通过免疫荧光法检测其与抗体的连接情况,用光镜及激光共聚焦显微镜观察其与细胞的结合能力,并与普通高分子造影剂做比较.结果 靶向高分子造影剂的粒径范围为466.8～857.6 nm,平均粒径为(662.2±69.7)nm,有85.9%的微球粒径落于该范围内,通过免疫荧光法可在荧光显微镜下观察到许多绿色点状荧光,体外寻靶能力实验显示靶向高分子造影剂能与乳腺癌细胞较好的结合.结论 成功制备出的携Herceptin的靶向高分子造影剂在体外与人乳腺癌细胞有较好的结合能力.     

载ICAM-1抗体的靶向脂质纳米超声造影剂体外寻靶实验研究

目的 制备一种载细胞间黏附因子-1 (ICAM-1)单克隆抗体的脂质纳米超声造影剂,研究其体外寻靶能力.方法 采用机械振荡法制得普通脂质纳米超声造影剂和生物素化的脂质纳米超声造影剂,利用生物素-亲和素桥接法将ICAM-1抗体连接于脂质纳米超声造影剂上,制成靶向造影剂,检测两种造影剂的物理性质.将上述两种造影剂分别作用于普通HepG2细胞和经TNF-α处理的HepG2细胞,实时荧光定量PCR检测HepG2细胞上ICAM-1荧光表达强度,荧光显微镜观察造影剂与HepG2细胞靶向结合的情况.结果 普通造影剂粒径为(623.2±91.37) nm;靶向造影剂粒径为(760.6±145.0) nm.经TNF α刺激后HepG2细胞ICAM-1基因的表达量明显增高.普通造影剂组均未见造影剂与HepG2结合,而靶向造影剂组可见大量的造影剂聚集在经TNF-α刺激后的HepG2细胞周围.结论 本研究自制的载ICAM-1抗体的靶向脂质纳米超声造影剂,其粒径小,性质稳定,在体外能与高表达ICAM-1的HepG2细胞特异结合,可望成为一种良好的肝癌靶向造影剂.     

超声微泡连接特异性抗体的制备方法及靶向化处理因素对超声微泡物理性质的影响

目的 探讨超声微泡连接特异性抗体的制备方法及靶向化处理因素对超声微泡物理性质的影响.方法 应用生物素-链霉亲和素连接系统,使注射用六氟化硫微泡(SonoVue)与特异性抗血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)抗体相连接,用间接免疫荧光法检测抗体与微泡的连接,用马尔文激光粒径分析仪分别测定生物素化处理前后微泡的粒径,采用超声诊断仪评价微泡靶向化构建前后的显像效果.结果 SonoVue与特异性抗体成功连接,间接免疫荧光检测呈阳性.生物素修饰后的微泡粒径分布变窄,与普通微泡的超声显像效果略有差异.结论 通过生物素-链霉亲和素系统可以成功靶向化构建超声微泡,靶向化处理因素对微泡的粒径有一定影响,对微泡的超声显影效果略有影响.     

携VEGFR2靶向超声微泡在肾癌裸鼠模型中的显像研究

目的评价携血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抗体的靶向超声微泡在原位移植裸鼠肾癌模型中的显像效果。方法建立人肾透明细胞癌原位移植裸鼠模型,制备携VEGFR2抗体的靶向微泡(MBV)及携同型抗体IgG的对照微泡(MBC),每只裸鼠分别注射MBV及MBC(顺序随机,注射时间间隔30min)后行超声造影检查,比较注射两种微泡后10min内肿瘤的增强强度,并对肿瘤组织行VEGFR2免疫组化检测。结果超声造影示注射微泡后10s时两种微泡增强强度上升百分比比较差异无统计学意义,注射微泡后1,2,4,6,8,10min时MBV增强强度上升百分比明显高于MBC(P<0.05)。免疫组化显示肾肿瘤血管内皮VEGFR2高表达。结论应用携VEGFR2抗体的靶向微泡与肾癌新生血管内皮靶点特异性结合,能持续增强显像,可作为评价肿瘤新生血管及监测抗血管治疗疗效的重要分子成像方法。     

叶酸介导靶向高分子造影剂的制备及体外识别研究

目的 合成叶酸介导靶向的聚乳酸共聚物,以其为靶向膜材制备靶向造影剂,表征造影剂性质.方法 以自制的叶酸-脯氨酸-乳酸共聚物(Fa-PLLA-Hpr)为膜材,应用双乳化-冷冻干燥法制备叶酸介导靶向高分子造影剂(MB-Fa-PLLA).采用激光粒径测量仪检测微泡的粒径,通过光镜观察该靶向造影剂(靶向造影剂实验组)对人卵巢癌SKOV3细胞的体外寻靶情况,并与游离叶酸干预组及空白对照组(普通微泡)比较.结果 FT-IR表征了靶向膜材的结构.成功制备叶酸介导靶向聚乳酸共聚物MB-Fa-PLLA.MB-Fa-PLLA在光镜下大小分布均匀,形态圆整,65％的微粒直径分布为500～800 nm,呈单峰分布,其亲水性较普通高分子微泡更好.体外寻靶实验显示,MB-Fa-PLLA可以较多并牢固地聚集到SKOV3细胞表面,而普通微泡未见特异性结合.结论 MB-Fa-PLLA亲水性好,对高表达叶酸受体的SKOV3细胞具有较强特异性亲合力,其有望成为靶向显像叶酸高表达肿瘤的理想造影剂.     

抗VEGF抗体介导靶向超声造影剂的体外实验研究

目的以抗血管内皮因子（VEGF）抗体为配体研制能与血管内皮细胞特异性结合的靶向脂质体超声造影剂并检测其体外寻靶能力。 方法以静电吸附法将抗VEGF抗体连接到脂质体造影剂微泡的表面；体外培养ECV304人血管内皮细胞，用免疫荧光法检测靶向造影剂与其体外结合能力，以普通造影剂为对照组。 结果所制备的靶向超声造影剂与普通微泡无显著差异；免疫荧光实验结果显示靶向造影剂能在体外与血管内皮细胞特异性结合。 结论携抗VEGF抗体的脂质体靶向造影剂能通过静电吸附法成功制备，且在体外能与血管内皮细胞特异性结合。     

PSMA单抗靶向人前列腺癌纳米级脂质微泡制备和体外寻靶能力实验研究

目的探究前列腺特异性膜抗原(PSMA)单抗靶向人前列腺癌纳米级脂质微泡的制备方法,对其体外寻靶能力予以观察。方法采用静电吸附法对PSMA单抗靶向人前列腺癌纳米级脂质微泡进行制备,观察其特性,对抗体与纳米级微泡结合情况予以免疫荧光法检测,采用细胞免疫荧光法对PSMA表达以及在细胞膜上的定位予以鉴定,观察靶向微泡对前列腺癌细胞的寻靶能力,并将胃癌细胞作为对照。结果 PSMA单抗靶向纳米级微泡呈现出均匀分布状态,平均粒径为(626.25±66.02)nm;经过免疫荧光法试验,显示微泡表面存在绿色荧光;对前列腺癌细胞膜给予细胞免疫荧光检测其PSMA呈现出高表达;体外寻靶实验显示靶向微泡能够实现与人前列腺癌LNCAP、C4-2细胞的结合,但其与胃癌MKN45细胞无法结合。结论 PSMA单抗靶向人前列腺癌纳米级脂质微泡体外寻靶能力强,能够实现与前列腺癌细胞的有机结合。     

含氟烷人血白蛋白靶向超声造影剂的制备研究

目的为靶向超声造影剂的制备进行基础实验研究。方法将含氟烷人血白蛋白超声造影剂与ICAM-1抗体混合,加入0.1%戊二醛,4℃孵育2h,促使抗体与微泡外壳充分交联。普通光镜评估靶向微泡的大小、形态。免疫荧光法进行靶向微泡的鉴定。结果普通光镜下可见携ICAM-1抗体的靶向微泡大小、形态与普通白蛋白微泡对照无明显改变。荧光显微镜证实微泡与ICAM-1抗体整合成功。结论戊二醛交联法适用于白蛋白靶向超声造影剂的制备,方法简便,成本低,重复性好。     

生物素-亲和素介导以KDR为靶点的脂质体超声造影剂体外靶向实验研究

目的 以与VEGF的主要受体KDR特异性结合的小肽K237为配体研制靶向脂质体超声造影剂并进行体外性能鉴定.方法 采用"生物素一亲和素"桥接法构建靶向微泡(P-Bio-Av-Bio-Mbs),将KDR不同程度表达的细胞LOVO、HUVECs和LS174T分别与P-Bio-Av-Bio-Mbs孵育,同时另将荧光标记生物素-亲和素桥接靶向脂质体微泡(FITC- P-Bio-Av-Bio-Mbs)、荧光标记的单纯小肽微泡复合物(FITC-P-Mbs)及荧光标记的普通脂质体微泡(FITC-Mbs)分别与LOVO细胞孵育,光镜及荧光显微镜观察微泡与细胞结合的花环形成率及荧光强度;分别以10 ?g、50 ?g的小肽K237预先与LOVO细胞孵育,再将P-Bio-Av-Bio-Mbs与LOVO细胞孵育,观察细胞周围微泡分布.结果 KDR强阳性表达的LOVO细胞周围花环形成率高达90.52%,荧光强度3级,KDR阳性表达的HUVECs周围花环形成率53.46%,荧光强度2级,KDR阴性表达的LS174T细胞周围少数微泡黏附,花环形成率5.57%.荧光强度0～1级,组间花环形成率比较差异有统计学意义(P<0.05).FITC-P-Bio-Av-Bio-Mbs、FITC-P-Mbs及FITC-Mbs与LOVO细胞结合,花环形成率分别为89.62%、7.56%、0%,组间比较差异有统计学意义(P<0.05),荧光强度分别为3级、0～1级、0级.10?g预处理组靶细胞周围花环结构明显减少,50 ?g封闭组靶细胞周围无花环形成.结论 以KDR为靶点携小肽K237的靶向脂质体造影剂通过生物素-亲和素桥介导成功制备,在体外能与靶细胞高效特异结合.针对KDR为靶点进行肿瘤新生血管分子靶向显像可能为肿瘤早期诊断提供新的思路.     

靶向纳米脂质超声造影剂制备及其体外寻靶能力实验研究

目的 制备一种靶向乳腺癌的纳米脂质超声造影剂,并观察其体外寻靶能力.方法 制备生物素化抗人乳腺癌细胞单克隆抗体Neu(F-11),并检测其生物素化程度和活性;通过生物素-亲和素系统制备靶向纳米脂质超声造影剂,用免疫荧光染色定性检测造影剂与抗体的连接情况,通过靶向造影剂与不同细胞的结合实验检测其寻靶能力.结果 每分子抗体可结合的生物素数目平均为7个,生物素化抗体的活性与游离单抗相比未见明显降低;免疫荧光染色显示靶向纳米脂质超声造影剂表面可见明亮的红色环状荧光,细胞结合实验显示其可与乳腺癌细胞特异性牢固结合.结论 生物素-亲和素系统可使造影剂与抗体牢固结合,所制得的靶向纳米脂质超声造影剂在体外具有较强的寻靶能力.     

mAb2G4修饰靶向超声造影剂的特性及体外寻靶作用的研究

目的制备mAb2G4修饰的靶向超声造影剂,并研究其体外寻靶能力。方法采用机械振荡法及碳二亚胺法制备mAb2G4修饰的靶向超声造影剂,检测其基本特性。通过免疫荧光法及流式细胞仪检测其与抗体的连接情况。制备人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧模型,光镜观察该靶向超声造影剂与缺氧HUVEC的结合情况。结果成功制备mAb2G4修饰的靶向超声造影剂,平均粒径为(2.19±0.45)μm,平均Zeta电位为(-2.86±0.57)m V,浓度为(2.58±0.34)×107个/ml。通过免疫荧光法在荧光显微镜下观察到mAb2G4修饰的靶向超声造影剂表面呈绿色荧光,抗体结合率高达99.35%。体外寻靶实验显示mAb2G4修饰的靶向超声造影剂能较好地黏附在缺氧的HUVEC表面,与非靶向超声造影剂比较差异有统计学意义(P0.05)。结论采用机械振荡法及碳二亚胺法成功制备mAb2G4修饰的靶向超声造影剂,并具有较强的靶向结合能力。     

超声波与微泡声学造影剂增强体外培养肿瘤细胞基因转染实验研究

目的观察超声波与微泡声学造影剂能否增强体外培养肿瘤细胞基因转染及其转染效率,初步摸索适宜的超声辐照条件.方法将培养的HepG2细胞分为3组,第1组为单纯造影剂转染组:加入5 μg绿色荧光蛋白质粒(PEGFP-C1)与微泡声学造影剂混合液进行转染;第2组为脂质体转染组:用相同浓度PEGFP-C1质粒进行常规脂质体转染;第3组为造影剂加超声辐照转染组:加入5 μg PEGFP-C1质粒与微泡声学造影剂混合液,然后分别用0.25 W/cm2、0.5 W/cm2、1.0 W/cm2超声波经培养板底部辐照10 s.24 h后用荧光显微镜观察各转染组细胞荧光蛋白表达情况,计录每高倍视野(400×)荧光蛋白表达阳性细胞数.结果单纯造影剂转染组未见荧光蛋白表达阳性细胞,造影剂加超声辐照转染组可见不同程度荧光蛋白表达,其中以0.5 W/cm2超声辐照组表达最强,每高倍视野绿色荧光蛋白表达阳性细胞数为(20.7±3.2)个/HP,高于0.25 W/cm2与1.0 W/cm2超声辐照组[分别为(4.8±1.9)个/HP;(9.9±2.3)个/HP],与脂质体转染组[(22.1±3.5)个/HP]比较无显著差异(P>0.05).结论微泡声学造影剂加一定强度的超声辐照能显著增强体外培养肿瘤细胞的基因转染与表达,超声辐照条件是影响转染率的重要因素,适宜条件时其转染效率与常规脂质体转染方法无显著差异.     

携VEGFR2单抗靶向微泡评价小鼠肿瘤新生血管

目的 探讨携带抗血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)单克隆抗体的超声微泡造影剂(MBv)评价小鼠肿瘤新生血管的可行性.方法 以生物素-亲和素桥接法构建MBv.免疫荧光法体外鉴定其性质.建立小鼠H22肿瘤模型,分别注射MBv和普通脂质微泡(MBc)进行超声造影检查.定量分析造影图像视频强度变化,描绘时间-强度曲线,并行肿瘤组织VEGFR2免疫组化检测.结果 成功构建偶联抗小鼠VEGFR2单抗的MBv.造影结果 表明MBv组较MBc组达峰时间提前,峰值较高,持续时间更长.免疫组化证明瘤体内新生血管内壁VEGFR2高度表达.结论 应用MBv结合超声造影可较好地评估肿瘤新生血管状况.MBv是良好的肿瘤靶向造影剂.     

脂质超声造影剂携半乳糖化多聚赖氨酸靶向结合HepG2细胞的实验研究

目的 探讨连接以半乳糖化多聚赖氨酸作为配体的脂质微泡超声造影剂的细胞靶向能力,为体内靶向显影及治疗肝癌寻求新方法.方法 用还原胺化法将多聚赖氨酸进行半乳糖化,人工合成小分子量的靶向配体,在室温下与自制脂质微泡发生化学结合制备成靶向脂质微泡,于荧光显微镜下观察体外靶向效果.结果 半乳糖与多聚赖氨酸在摩尔比为1:100,室温下反应24 h时,能进行高效连接;靶向脂质微泡粒径平均为2.05弘m,大小均一;激光共聚焦荧光显微镜见HepG2肝癌细胞能与靶向造影剂特异性结合.结论 连接有以半乳糖化多聚赖氨酸为靶向配体的脂质微泡在HepG2肝癌细胞的内吞作用下能与之有效结合.     

靶向肿瘤血管αvβ3整合素的脂质声学造影剂体外研究

目的制作靶向脂质声学造影剂并评估其体外靶向造影成像的可行性。方法制作高表达αvβ3的黑色素瘤细胞K1735的肿瘤细胞模型,利用新桥医院自行研制的脂质造影剂“脂氟显”,通过碳化二亚胺偶合技术,将单克隆抗体与微泡表面物质结合,制作成靶向微泡。分别与高表达αvβ3的黑色素瘤细胞和低表达αvβ3的黑色素瘤细胞进行体外结合实验,同时使用水流冲刷实验来验证靶向微泡与靶标结合后的抗流体剪切力的能力,从而在体外条件下研究微泡的靶向特性。结果建立αvβ3高表达的肿瘤细胞模型,并成功地制作出靶向肿瘤血管αvβ3整合素的微泡,加入抗体在45ug以上时靶向抗体结合更加充分,体外试验结果提示靶向微泡与靶标有特异性结合能力,具有一定的抗流体剪切力能力。结论靶向微泡体外试验结果提示进一步的体内靶向诊断和治疗是可行的。