HSP47在小鼠腭裂和短肢发生过程中的表达

背景与目的:研究热休克蛋白47基因(Heat shock protein 47,HSP47)在小鼠胚胎腭、前肢正常和异常的发育过程中的表达情况。材料与方法:在GD10经口一次分别给予各实验组孕鼠80mg/kg的全反式视黄酸,对照组孕鼠给予等体积的植物油,并分别于GD11~GD18取两组胎鼠的前肢,于GD15~GD17取两组胎鼠的腭,利用RT_PCR方法半定量检测HSP47的表达丰度。结果:HSP47在所有样品中均有表达,其在GD11~GD18正常、异常发育肢的表达均呈随胚龄增大而增加的趋势,对照肢和实验肢分别于GD16、GD17达到高峰,以后基本恒定;其在GD15~GD17正常腭中恒定表达、异常腭中以GD16表达最高;异常肢的表达丰度在GD11~GD18均高于正常肢,正常腭和异常腭的表达丰度在GD15无差异,但在GD16~GD17异常腭的表达丰度则高于正常腭。结论:全反式视黄酸所致的短肢和腭裂中,HSP47的表达呈应激性升高。     

未折叠蛋白反应关键基因在小鼠前肢正常发育和异常发生过程中的表达

背景与目的： 研究未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)关键基因在小鼠胚胎前肢正常发育和异常发生过程中的表达情况。 材料与方法： ICR小鼠受孕后,将其随机分为实验组和对照组,每组各64只。于孕第10 d(gestational day 10,GD10),经口灌胃1次给予实验组孕鼠80 mg/kg的全反式视黄酸、对照组孕鼠给予等体积的大豆油,并分别于GD11～GD18取两组胎鼠的前肢,利用实时荧光定量PCR检测UPR关键基因Atf6、Ire1、Perk、Grp78的表达丰度。 结果： 除Ire1在GD18未被检出外,UPR中的上述4个主要基因在GD11～GD18正常肢发育过程中均有表达,且在GD13、GD17时间点前后呈现两个表达峰;其中Grp78的表达丰度最高,Ire1的表达丰度最低。而在实验组异常前肢发育过程中GD15之前上述4个基因的表达丰度均高于对照组正常前肢发育过程中的表达丰度(P<0.05);而GD15后均低于对照组正常前肢的表达丰度(P<0.05),呈相对稳定的低水平状态;且在GD12～GD14上述4个基因有一非常明显的表达高峰,其表达时程比对照组正常肢长,且表达丰度远高于对照组正常肢(P<0.05)。 结论： 全反式视黄酸所致的短肢模型中, UPR关键基因的表达在GD11～GD14显著升高,而在GD16～GD18则受到抑制,推测UPR可能与致畸有关。     

AY245441基因在小鼠腭突发育和腭裂形成中的动态表达

背景与目的： 观察AY245441基因在正常腭组织和全反式视黄酸诱导的小鼠腭裂形成过程中的表达变化,探讨AY245441基因的表达在腭突正常发育和腭裂发生中的作用。 材料与方法： 利用Real-time PCR和原位杂交方法动态检测正常腭组织和全反式视黄酸诱导的腭裂组织中AY245441基因的表达情况。 结果： Real-time PCR结果表明,AY245441基因在GD11～16正常腭突和腭裂组织中均有表达,在正常腭中GD11,GD13和GD14时AY245441表达丰度最高,与其它胚龄相比较差异具有统计学意义(P<0.05);腭裂组中AY245441的表达丰度明显低于正常腭 (P<0.05),而在腭裂组织中各胚龄AY245441的表达丰度差异无统计学意义(P>0.05)。原位杂交结果显示,AY245441基因在GD13正常腭板前部的上皮细胞,GD14腭板前部上皮细胞和间充质细胞中均有表达 ;在GD14正常腭板后部上皮细胞中有少许表达,但间充质细胞中无表达。在GD13腭裂前部上皮细胞中表达量明显下降,在GD14腭裂前部上皮细胞和间充质细胞中表达受到明显抑制,几乎未检出阳性信号;在GD14腭裂后部上皮细胞和间充质细胞中均无表达。 结论： AY245441基因在小鼠腭突组织的生长发育中行使重要功能,与腭裂的发生有密切的关系。     

全反式视黄酸致ICR小鼠胎鼠短肢模型的建立

背景与目的：探索建立发生率高、畸形类型明确且易于获得的化学物致小鼠胎鼠短肢畸形的模型的方法。材料与方法：ICR小鼠合笼后,查到阴栓当天为孕期第0天（GDO）,孕鼠共50只,随机分为GD9、GD10、GD11、GD12给全反式视黄酸（all-trans-retinoicacid,atRA）实验组和对照组,共5组,每组10只,实验组经口灌胃1次给予孕鼠80mg／kgatRA,对照组则给予等体积的大豆油,于GD18将孕鼠处死并取出胎鼠,观察不同时间给予孕鼠atRA的胎鼠的短肢畸形情况。结果：于GD10给予孕鼠atRA,可致胎鼠双前肢短小,肱骨、桡骨、尺骨均较正常组短（P均〈0．05）;于GD11给予孕鼠atRA,可致胎鼠双前肢和双后肢短小,肱骨、桡骨、尺骨、股骨、胫骨均较正常组短（P均〈0．05）,腓骨常缺失;于GD12给予孕鼠atRA,可致胎鼠尺骨较正常组短（P〈0．05）。结论：成功建立了全反式视黄酸致小鼠短肢畸形的模型,为进一步研究肢体畸形的分子机制奠定了基础。     

先天性腭裂形成中胚胎腭器官的电镜观察

背景与目的： 建立先天性腭裂模型观察其形成过程中胚胎腭突细胞的超微结构改变。 材料与方法： 于NIH雌性小鼠受孕第12.5 d(GD12.5)通过腹腔注射磷酸地塞米松(50 mg/kg)诱发NIH小鼠胚胎先天性腭裂模型,同时设正常对照组注射生理盐水相同条件下饲养。实验组和对照组母鼠分别于GD13.5、GD14.5、GD15.5脱颈处死,剖腹取出胎鼠,切取胎鼠头部制作光镜和电镜样本,采用扫描电镜和透射电镜观察胚胎腭发育及先天性腭裂形成过程中腭突细胞的超微结构。 结果： 随着胚胎发育,对照组腭突双侧裂隙逐渐变小,上皮基底膜破坏,腭突中嵴上皮细胞(MEE)细胞核染色质呈块状并边集,并可见上皮细胞内出现分泌物质,胚腭间充质细胞(EPM)细胞之间基质丰富,胚胎GD15.5腭突完全融合;实验组腭突生长缓慢,体积较同期对照组小,随着腭突的发育,腭突表层MEE细胞仍然连接紧密,基底膜完整,上皮细胞多层化,细胞表面出现纤毛,EPM细胞之间基质较少,在GD15.5形成裂隙。 结论： 地塞米松作用后胚胎腭突细胞的正常发育分化受到影响,从而导致腭裂形成。     

水通道蛋白-4在小鼠肾脏发育中的表达

目的观察水通道蛋白-4(AQP-4)在小鼠肾脏发育中的表达,探讨其与肾脏发生发育的关系及作用。方法用免疫组织化学(SABC法)显色观察AQP-4从胚龄12 d胎鼠到生后42 d小鼠肾脏的表达部位,用体视学对AQP-4在小鼠肾脏不同发育阶段中的表达进行定量检测。结果AQP-4在胚龄14 d的胎鼠肾脏可见微弱表达,其后随胚(日)龄的增长而增加,到生后1 d达最高,以后无明显变化。AQP-4的表达部位在胚龄14 d、16 d的小鼠为输尿管芽细胞的侧膜和基底膜(侧基底膜),在集合管出现以后则还表达在集合管细胞的侧基底膜。结论AQP-4在生前小鼠水平衡的调节作用比较重要,对生后小鼠主要起辅助作用。     

血管紧张素Ⅱ受体1和受体2在小鼠肾小管发育中的表达

目的探讨血管紧张素Ⅱ受体1（AngiotensinⅡ receptortype 1，AT1R）和受体2（（Angioten．sinⅡreceptor type2，AT2R）在小鼠肾小管发育中的表达及其与肾脏发育的关系。方法采用免疫组织化学方法和体视学方法检测胚龄14、15、16、18天胎鼠及生后1、3天仔鼠肾小管AT1R和AT2R的表达。结果AT1R于胚龄15天开始出现在肾小管，胚龄16天达到高峰，随后表达逐渐减弱，生后3天微量表达；AT2R于胚龄16天开始出现在肾小管，胚龄18天达到高峰，以后表达逐渐减弱，至生后3天基本消失。结论小鼠肾脏发育早期AT1R和AT2R与肾小管的增殖和分化密切相关。     

维生素A缺乏对小鼠胚胎Hox-3.5 mRNA表达与胚胎发育关系的研究

目的 :探讨Vit.A缺乏对胚胎Hox-3.5mRNA表达的影响及其与胚胎发育的关系。 方法 :初断乳的昆明种雌鼠 ,随机分为正常对照组(N)、Vit.A缺乏组(A)、妊娠第0d补充Vit.A组(B)和妊娠第7d补充Vit.A组(C)。按AOAC方法建立孕鼠Vit.A缺乏模型。在妊娠第12d ,一半孕鼠剖腹取出胎鼠 ,采用原位杂交方法检测小鼠胚胎Hox-3.5mRNA的表达 ,同时检测孕鼠血清Vit.A水平。另一半孕鼠在妊娠第19d剖腹取胎 ,用于检查胚胎发育。 结果:孕鼠血清Vit.A缺乏时 ,孕12d胚胎组织Hox-3.5mRNA的含量明显减少 ;妊娠第0d补充Vit.A ,Hox-3.5mRNA的含量与N组无显著性差异 ;妊娠第7d补充 ,Hox -3.5mRNA的含量虽比A组增加 ,但仍明显低于N组。此外 ,Vit.A缺乏使胎鼠的体重、身长、尾长明显小于正常对照组(P<0.05) ,且出现脑膨出及细小肾等畸形。GD7补充Vit.A组明显好于Vit.A缺乏组 ,但与正常对照组相比仍有差异。交配后0d补充Vit.A组与正常对照组无差异。 结论 :Vit.A缺乏对胚胎发育的影响可能与Vit.A在转录水平调控Hox-3.5mRNA的表达有关。     

己烯雌酚致胚胎期睾丸引带形态结构发育异常的研究

背景与目的 :研究环境外源性雌激素己烯雌酚(Diethylstilbestrol,DES)对胚胎小鼠睾丸引带形态发育的影响 ,探讨DES影响睾丸以及生殖系统发育的机制。 材料与方法 :昆明雌性小鼠60只 ,随机分成6组 ,于孕9～17d每天分别给予DES25、50、100、200μg·kg-1·d-1和等体积的DMSO、生理盐水作空白和正常对照。孕l9d处死母鼠 ,取出活胎、取其下腹部 ,分别作光镜和电镜固定。观察睾丸引带的组织形态学及细胞超微结构变化。结果 :DES可致睾丸引带发育不良 :体积缩小 ,形态异常 ,组织结构紊乱 ,细胞内肌丝细小 ,排列紊乱 ,密体不明显 ,胞浆中细胞器散在分布。DES剂量越大 ,睾丸引带形态异常及组织细胞结构紊乱现象越明显。 结论 :DES可致胎鼠睾丸引带形态异常、组织细胞结构紊乱 ,且有剂量效应关系。     

应用显性致死试验检测西番莲果汁的遗传毒性

目的： 应用小鼠显性致死试验评价西番莲果汁的遗传毒性。方法：西番莲果汁7.2～28.8 g/kg剂量对NIH种雄性小鼠连续灌胃染毒5 d,再与雌性小鼠连续同笼交配7周,每批雌性小鼠在妊娠第13～14天处死,观察胚胎着床数、活胎数和死胎数。同时设置对照组。对所有计数、计量资料进行统计学处理。结果：环磷酰胺(CP)和丝裂霉素C(MMC)阳性对照小鼠除平均着床数正常外,其余各项指标在不同周次中均存在异常(P<0.05或<0.01)。阴性对照组和西番莲果汁各剂量组的小鼠交配率>133%,妊娠率在60%～93%,窝平均着床数>8.6只,平均死胎数<0.8只,平均活胎数>8.1只,均在正常数值范围内;各剂量西番莲果汁均未诱发有死胎孕鼠率、显性致死率和突变指数的增高及着床卵生存率的降低(P>0.05)。结论：西番莲果汁在本试验剂量(7.2～28.8 g/kg)范围内,小鼠显性致死试验为阴性结果,提示其无遗传毒性。     

全反式维甲酸对EC9706荷瘤裸鼠抑瘤作用的实验研究

目的：观察全反式维甲酸的体内抗肿瘤作用，探讨其体内抑瘤的作用机制。方法：采用裸鼠EC9706人食管癌细胞实体瘤模型进行体内抑瘤实验研究，应用全反式维甲酸10d后处死裸鼠，观察荷瘤裸鼠的肿瘤生长情况，测定肿瘤生长抑制率；HE染色对肿瘤组织进行细胞形态学观察，TUNEL法检测肿瘤组织中细胞凋亡，免疫组织化学法检测凋亡相关基因bax及bcl-2蛋白的表达情况。结果：全反式维甲酸对裸鼠EC9706人食管癌细胞实体瘤生长具有明显的抑制作用，抑瘤率达60％以上。组织学观察及TUNEL检测结果显示，肿瘤组织中散在凋亡细胞和凋亡小体。免疫组织化学检测结果显示，凋亡相关基因bax蛋白表达增加，bcl-2蛋白表达下降。结论：全反式维甲酸具有较强的体内抗肿瘤作用，作用机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关。     

Expression of heat-shock protein Hsp60 correlated with the apoptotic index and patient prognosis in human oesophageal squamous cell carcinoma

Cellular stress response and apoptosis are two highly conserved mechanisms for maintaining homeostasis. Hsp60 and Hsp90 have been shown to play pro- and anti-apoptotic roles, respectively. Our present study examined whether there is a correlation between the expression of Hsp60 and Hsp90, clinical parameters, the apoptotic index (AI), and the prognosis of patients with oesophageal squamous cell carcinoma (ESCC). We immunohistochemically stained cells for Hsp60, Hsp90, and single-stranded DNA (ssDNA), which acts as an apoptotic marker. In normal oesophageal epithelium tissue, Hsp60 and Hsp90 were expressed in the cytoplasm and membrane from the basal cell layer to the supra-basal cell layers. Hsp60 and Hsp90 positive stainings (+) were found in 63 of 123 cases (51%) and 62 of 123 cases (50%), respectively. There was no correlation between Hsp60 and Hsp90 expression levels and any of the clinical parameters examined. The five-year survival rate for ESCC patients with Hsp60 (+) expression was significantly higher than for those patients with Hsp60 (−) expression (P = 0.0371). Five-year survival rates of patients with Hsp60 (+) and (−) were 49% and 33%, respectively. By contrast, Hsp90 expression failed to predict patient prognosis (P = 0.7965). The high-AI group did not have a significantly better prognosis than the low-AI group (P = 0.2218). Statistical analysis showed a significant correlation between the expression of Hsp60 and AI in ESCC patients (P = 0.008). Thus, the five-year survival rate for the high-AI/Hsp60 (+) group was statistically significantly better than for the other groups (P = 0.0281). The results obtained in this study indicate that positive Hsp60 expression is a good prognostic indicator. This may be due to its role as a chaperone in contributing to the induction of apoptosis. These data suggest that Hsp60 expression correlates with the AI and patient prognosis in human ESCC.     

HL-60细胞向单核系和粒系分化的比较蛋白质组学研究

背景与目的：已有研究发现NSC67657和全反式维甲酸可以诱导HL-60细胞分别向单核系和粒系分化。本研究比较分析不同诱导剂诱导HL-60细胞向单核系和粒系分化前后以及分化中的蛋白表达差异,发现与单核系和粒系分化有关的关键蛋白。方法：分别采用粒系分化诱导剂全反式维甲酸和单核系分化诱导剂NSC67657诱导HL-60细胞分化,MTT法检测细胞增殖情况：流式细胞技术分析细胞表面特异性分化抗原（CD11b／CD14）的表达,根据CD14表达情况计算细胞分化百分率;细胞化学染色对HL-60的两系分化进行验证。改良双向电泳分离技术对HL-60细胞全蛋白进行分离,PDQuest软件分析寻找差异蛋白点,基质辅助激光解吸-飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）对蛋白点进行分析,RT-PCR和免疫印迹对差异蛋白ICAT进行验证。结果：全反式维甲酸和NSC67657均抑制HL-60细胞增殖,并分别诱导HL-60细胞向粒系和单核系分化。在2μmol／LATRA和10μmol／LNSC67657作用5d后．CD11b和CD14的表达均在90％以上,细胞化学染色支持细胞两系分化的结论。蛋白质组学分析表明,HL-60细胞分别向粒系和单核系分化后,有25个差异蛋白点的变化趋势在两系分化中是相同的,有10个差异蛋白点在单核系分化后表达有差异。有15个差异蛋白点在粒系分化后表达有差异：ICAT是其中差异蛋白之一,通过基因和蛋白水平验证．发现ICAT在NSC67657诱导HL-60细胞单核系分化过程中表达升高,而在粒系和非处理细胞中表达无显著性差异。结论：双向电泳／MOLDI-TOFMS对HL-60细胞分化前后细胞全蛋白进行分析．发现了一批与两系分化有关的蛋白分子．为关键蛋白的筛选及其功能研究提供了重要的启示。     

Influence of regenerative capacity and innervation on oncogenesis in the adult frog (Rana pipiens).

Twenty-two sarcomas were induced in 19 adult frogs (Rana pipiens) treated with 3-methylcholanthrene pellets. Thirteen of these tumors arose first in a denervated forelimb, and only 2 arose first in normal or nerve-supplemented control forelimbs (P = 0.004). The remaining tumors developed either as a second tumor in a tumor-bearing frog or in hindlimbs. The critical role of innervation in regenerative capacity suggests that the predilection to tumor formation in the denervated limbs may have resulted from their lessened regenerative capacity.     

Alterations in neuroblastoma ganglioside synthesis by induction of GD1b synthase by retinoic acid

Recent findings link increased expression of the structurally complex 'b' pathway gangliosides GD1b, GT1b, GQ1b (CbG) to a favourable clinical and biological behaviour in human neuroblastoma (NB). Seeking a model to probe these observations, we evaluated four human NB cell lines. Very low CbG content (4-10%) in three of the four cell lines (LAN-5, LAN-1, SMS-KCNR) reflected the ganglioside pattern observed in the most aggressive NB tumours. Pharmacological alterations of complex ganglioside synthesis in vitro by a 5-7 day exposure to 5-10 microM retinoic acid, which is employed in maintenance therapy of disseminated NB, included markedly increased (i) relative expression of CbG (6.6+/-2.0-fold increase, P=0.037), (ii) relative expression of the analogous 'a' pathway gangliosides, termed CaG (6.4+/-1.4-fold increase in GM1a and GD1a; P=0.010), and (iii) total cellular ganglioside content (2.0-6.3-fold), which in turn amplified the accumulation of structurally complex gangliosides. Substantial increases (2.7-2.9-fold) in the activity of GD1b/GM1a synthase (beta-1,3-galactosyltransferase), which initiates the synthesis of CbG and CaG, accompanied the all-trans retinoic acid (ATRA)-induced ganglioside changes. Thus, increased CbG synthesis in NB cell lines is attributable to a specific effect of ATRA, namely induction of GD1b/GM1a synthase activity. Since the shift towards higher expression of CbG and CaG during retinoic acid-induced cellular differentiation reflects a ganglioside pattern found in clinically less-aggressive tumours, our studies suggest that complex gangliosides may play a role in the biological and clinical behaviour of NB.