肝细胞中固有干扰素调节因子7的表达及其抗病毒作用

目的：检测肝细胞中固有表达的干扰素调节因子7（IRF7）在免疫过程中的作用,揭示IRF7固有表达对肝细胞抵御病毒感染的影响。方法：以原代肝细胞、永生化肝细胞HuS-E/2以及肝肿瘤细胞株HuH-7细胞作为研究对象,利用仙台病毒（SV）感染原代肝细胞和HuH-7细胞,以RT-PCR法检测IFNα1、 IFNβ、 IFNλ3及 视黄酸诱导基因蛋白（RIG-I） 的诱导表达,以IRF7显性负性突变体表达载体pcDNA3-7DN转染HuS-E/2细胞,RT-PCR法及实时定量PCR检测上述基因的诱导变化。IRF7表达载体pcDNA3-IRF7转染HuH-7细胞后,进行2a型HCV病毒株JFH1感染,间接免疫荧光法检测HCV感染情况。结果： SV感染12 h内,HuH-7细胞中未检测到明显的IFNα1、 IFNβ、 IFNλ3和 RIG-I 的诱导表达;而在SV感染早期（3　h）,原代肝细胞中即可检测到上述基因的mRNA条带。IRF7功能受到抑制后,RT-PCR结果显示SV感染的肝细胞中上述基因表达在感染早期的mRNA条带灰度降低;实时定量PCR可见SV感染3 h内,上述基因mRNA诱导表达水平均显著降低（P<0.001）。异位表达IRF7的HuH-7细胞中JFH1感染后未检测到明显的HCV信号。结论：肝细胞中固有IRF7的表达与细胞感染后的免疫反应密切相关,对于防御病毒感染起到重要作用。     

多配体聚糖结合蛋白1过表达增加低密度丙型肝炎病毒颗粒的产生

目的　探讨syntenin-1蛋白对丙型肝炎病毒（HCV）颗粒组装的影响。 方法　用免疫印迹法分析人原代肝细胞中syntenin-1的含量。用慢病毒转染质粒在人肝癌细胞系Huh7.5.1构建syntenin-1过表达细胞系和绿色荧光蛋白（GFP）过表达细胞系。采用电转法将HCV RNA转入细胞后,通过荧光素酶分析、免疫印迹分析和病毒滴度测定方法分别从RNA复制、病毒蛋白表达和感染性病毒颗粒的分泌方面检测syntenin-1过表达对HCV的影响。用密度梯度分析法检测HCV RNA和感染滴度在不同密度组份的分布情况。 结果　人原代肝细胞中syntenin-1含量与实验室常用的肝癌细胞系Huh7.5.1相比较高。Syntenin-1过表达不影响HCV RNA在宿主细胞中的复制;syntenin-1过表达细胞来源的HCV 病毒的感染性与Huh7.5.1细胞或GFP过表达细胞的对照组相比差异无统计意义;在syntenin-1过表达细胞培养上清液中的HCV感染性颗粒从主要集中在1.08～1.16 g/mL区域变为有部分转移到密度为1.01～1.02 g/mL的低密度区域。 结论　Syntenin-1过表达改变了HCV感染性颗粒的密度组份分布,从主要集中在1.08～1.16 g/mL区域变为有部分转移到密度为1.01～1.02 g/mL的低密度区域,在低密度区域出现了具有更高单位RNA感染能力的病毒颗粒。     

DMSO、地塞米松对于HBV感染HepCHLine-4细胞能力的影响

目的 评价二甲基亚砜（DMSO）、地塞米松对于乙型肝炎病毒（HBV）感染HepCHLine-4细胞能力的影响。方法 HBV感染前将HepCHLine 4细胞分为DMSO处理组（A组）、地塞米松处理组(B组)、DMSO及地塞米松处理组(C组)和对照组(D组)。含胎牛血清100mL/L 的细胞培养基中,A组添加20mL/L DMSO,B组添加5×10-5 mol/L 地塞米松,C组添加20mL/L DMSO及5×10-5 mol/L地塞米松,D组不添加上述两种试剂。用相应培养基培养各组细胞4d以备病毒感染。将HBV病毒颗粒加入各组细胞中于37℃中孵育24h。电化学发光法检测感染后各组细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的滴度;荧光定量PCR检测感染后各组细胞培养上清的HBV DNA。结果 DMSO处理组HBsAg和HBeAg的滴度相对较高;地塞米松处理组HBV DNA值相对较高;DMSO及地塞米松处理组HBsAg和HBeAg的滴度及HBV DNA值均较高,其最高值分别是125.790 IU/mL, 4.784 S/Co, 5.930×105 copies/ mL;对照组HBsAg和HBeAg的滴度及HBV DNA值均较低,其最高值分别是85.490 IU/mL,1.896 S/Co,3.729×104 copies/mL。 结论 DMSO、地塞米松有提高HepCHLine 4细胞被HBV自然感染能力的趋势。     

体外感染细胞表达HCV-NS5和复制HCV RNA的实验研究

为了研究 HCV- NS5 和 HCV RNA在体外感染细胞培养系统中的表达和复制情况 ,选用 HCV RNA水平为2× 10 4拷贝 / m l的阳性血清感染人肝癌细胞株 (Hep G2细胞株 )。应用胶体金标免疫电镜法和原位杂交法检测 HCV在被感染细胞中 NS5 蛋白表达和 RNA复制的情况。结果在细胞浆内有电子密度大的金标颗粒的吸附 ,在感染后的第 1至第 9代细胞中均有发现。感染后的细胞超微结构完整 ,未发现 HCV颗粒。在感染后的第 1至第 7代细胞内出现特异性杂交信号 ,HCV RNA阳性物呈蓝紫色细小颗粒分布在细胞浆和细胞核内。因此 ,HCV能够在 Hep G2细胞中表达 NS5抗原和复制 RNA,而细胞超微结构完整。     

新疆地区HIV/AIDS患者与合并感染HCV患者间病毒载量和T淋巴细胞亚群相关分析

目的：探讨新疆感染人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）/人类获得性免疫缺陷综合征（acquired im－munedeficiency syndrome,AIDS）患者与合并感染丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）患者间病毒载量水平和体内T淋巴细胞数量的相关性变化。方法：依据患者感染程度分为HIV/AIDS单纯感染组（68例）与HIV/HCV合并感染组（80例）,分别对CD4+ T淋巴细胞、CD8+ T淋巴细胞、HIV RNA、HCV RNA进行检测,分析2组患者指标的相关性。结果：HIV/AIDS单纯感染组CD4+与CD8+ T淋巴细胞数量明显高于HIV/HCV合并感染组[（352.691±216.324）个/?滋L vs. （164.488±101.447）个/?滋L,t=6.585,P=0.000;（1 102.088±578.909）个/?滋L vs.（760.65±491.962）个/?滋L,t=3.879,P=0.000];2组间HIV RNA载量无统计学差异（9.871±3.487 vs. 10.737±3.095,t=-1.600,P=0.112）。单纯HIV/AIDS组CD4+ T淋巴细胞数量与HIV RNA载量[（9.871±3.487）log10 copies/mL]呈负相关（r=-0.433,P=0.000）,CD8+ T淋巴细胞数量与HIV RNA载量无相关性（P=0.696）;HIV/HCV合并组中CD4+、CD8+ T淋巴细胞数量与HIV RNA载量[（10.737±3.095）log10 copies/mL]均无相关性（P=0.148,P=0.114）。HIV/ HCV合并感染组中CD4+ T淋巴细胞数量与HCV RNA载量[（15.046±2.654）log10 copies/mL]呈正相关（r=0.242,P=0.031）,CD8+ T淋巴细胞数量与HCV RNA载量无相关性（P=0.154）,HIV RNA载量与HCV RNA载量水平呈负相关（r=-0.533,P=0.000）。结论：当HIV/AIDS患者合并感染HCV后,患者CD细胞数量明显降低,但HIV RNA与HCV RNA水平无统计学差异,且两者间为负相关变化。     

慢性HCV感染患者PBMC体外Th1类细胞因子分泌及其相关因素分析

目的：研究慢性HCV（丙型肝炎病毒）感染患者外周血单个核细胞（PBMC）体外Th1细胞因子的分泌，进一步了解HCV感染慢性化和肝损伤机制．方法：体外培养慢性HCV感染患者PBMC72h后，ELISA检测培养上清Th1类细胞因子（IL-2，IFN-γ，TNF-α），荧光定量PCR检测患者血清HCVRNA含量，RT-PCR检测HCVRNA亚型．结果：与正常人相比，IFN-γ在HCV RNA阴性患者中明显增高，而在RNA阳性患者中无明显升高．TNF-α则不论RNA滴度的高低均较正常人显著增高．RNA阳性患者ALT（丙氨酸氨基转移酶），AST（门冬氨酸氨基转移酶）水平明显高于阴性患者．不同HCV基因型感染的患者IFN-γ，TNF-α的分泌无显著差异．结论：IFN-γ在清除病毒中起重要作用，TNF-α是引起肝脏损伤的重要因素之一．     

人肝癌细胞系7721与原代人胎肝细胞用于体外培养HCV的对比研究

目的 研究丙型肝炎病毒（HCV）在体外培养原代人胎肝细胞和人肝癌细胞系7721中复制和表达的异同,探讨HCV体外培养条件。方法 原代人胎肝细胞系7721分别与HCV感染血清共孵育后,用逆转录-聚合酶链反应、原位杂交、免疫组化检测细胞和培养上清中的HCV RNA和抗原表达。结果 从孵育的2～3天,即可在细胞内和/或培养上清中间断地检出HCV RNA（其中HCV在7721细胞株中的复制至少可达66d,HCV在 人胎肝细胞中的复制持续25d）;HCV抗原可在感染细胞内得到稳定表达,感染细胞内存在HCV负链RNA杂交信号,且多位于细胞浆。结论 两种肝细胞对HCV易感,尤其是7721细胞可以稳定地支持HCV体外复制,可用于HCV体外长期培养的靶细胞。     

慢性HCV感染患者PBMC体外Th1类细胞因子分泌及其相关因素分析

目的:研究慢性HCV(丙型肝炎病毒)感染患者外周血单个核细胞(PBMC)体外Th1类细胞因子的分泌,进一步了解HCV感染慢性化和肝损伤机制. 方法:体外培养慢性HCV感染患者PBMC 72 h后,ELISA检测培养上清Th1类细胞因子(IL-2,IFN-γ,TNF-α),荧光定量PCR检测患者血清HCV RNA含量,RT-PCR检测HCV RNA亚型. 结果:与正常人相比,IFN-γ在HCV RNA阴性患者中明显增高,而在RNA阳性患者中无明显升高. TNF-α则不论RNA滴度的高低均较正常人显著增高. RNA阳性患者ALT(丙氨酸氨基转移酶),AST(门冬氨酸氨基转移酶)水平明显高于阴性患者. 不同HCV基因型感染的患者IFN-γ,TNF-α的分泌无显著差异. 结论:IFN-γ在清除病毒中起重要作用,TNF-α是引起肝脏损伤的重要因素之一.     

苏拉明对黄病毒类NS3蛋白质合成的影响

寻找有效的抗黄病毒类药物，为临床应用提供理论依据。在病毒吸附培养细胞HepG2后加入不同浓度的苏拉明，48h后采取培养上清液及感染细胞，运用病毒滴度测算（plaque法）、Western blot法及RT－PCR法，检测其对病毒增殖的影响。结果显示用苏拉明50μg/ml处理后产生的病毒量是对照组的51.8%，同时显示病毒NS3蛋白质合成量减少，而对病毒RNA无任何影响。提示苏拉明抑制病毒复制作用主要是阻碍了病毒NS3蛋白质的合成。     

慢性HCV感染患者RNA、ALT、AST水平以及细胞因子之间的关系

目的：研究慢性HCV感染患者HCV RNA水平，ALT、AST以及外周血单个核细胞（PBMCs）体外细胞因子分泌之间的关系。方法：体外培养慢性HCV感染患者PBMCs72小时后，ELISA检测培养上清细胞因子（IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF—α）含量，荧光定量PCR检测患者血清HCV RNA含量。结果：RNA阳性患者ALT、AST水平明显高于阴性患者，但阳性患者之间，ALT、AST水平无显著差异。不论RNA滴度高低，细胞因子分泌水平均无差异。相关性分析表明IFN-γ与ALT、AST有一定相关性（r=-0．8178，P=0．02；r=0．7517．P=0．04）。结论：血清HCV RNA水平与肝损伤有关，INF-γ在抗HCV免疫应答的同时可能对肝脏也造成了一定损伤。     

环孢素A抑制丙型肝炎病毒JFH-1复制的实验研究

目的 探讨环孢素A(cyclosporine A,CsA)对全基因组丙型肝炎病毒JFH-1(hepatitis C virus,HCV JFH-1)在肝细胞中复制的影响.方法 以体外转录的HCV JFH-1 RNA转染Huh7细胞,制备含HCV病毒颗粒的感染上清,建立全基因组HCV JFH-1感染Huh7细胞模型,分为...     

Characteristics of HCV replication and expression in a cultured human liver carcinoma cell line in vitro

ProgressonhepatitisCresearchhasadvancedquickly.However,theabsenceofcellculturesystemofHCVinfectionhashamperednotonlytheunder-standingofitslifecycle,butalsotheanalysisofthemoleculardeterminantsofitspersistence.Toidentifycriticalepitopesthatelicitaneutralizingantibodyre-sponseandtounderstandthepathogenesisofpersis-tentHCVinfection,efficientcellmodelsofHCVin-fectionisneeded[1].HumanT-lymphocytecelllines[2-5],humanfibroblastcells[6](VH3),peripheralbloodmono-nuclearcells[7](PBMCs)andhepatocy…     

丙型肝炎病毒全基因组培养细胞中转录调节基因的差异表达

目的利用基因芯片的高通量分析性能和丙型肝炎病毒(HCV)全基因组细胞培养系统,研究HCV对宿主细胞转录调节基因的影响和机制.方法用人工构建的HCV感染Huh-7肝癌细胞株,待其发生细胞病变后收集培养细胞,以同步培养但不感染HCV的细胞作为阴性对照.提取感染细胞和对照细胞的总RNA、总蛋白和细胞培养上清.总蛋白用于Western blotting鉴定HCV蛋白在感染细胞内的表达情况.细胞培养上清用于检测HCV在感染细胞内合成后的释放情况.总RNA 用10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定抽提情况,再纯化后进行逆转录cRNA合成、荧光标记和纯化后用于基因芯片分析,检测宿主细胞转录调节基因的差异表达.结果在细胞培养上清液中可检测到HCV,感染细胞内可检测到HCV蛋白表达.基因芯片检测2倍差异表达转录调节基因发现,上调基因11个,下调基因11个.结论HCV全基因组细胞培养系统为研究HCV对感染细胞转录调节基因表达的影响提供了良好工具.利用基因芯片技术,筛选出HCV全基因组细胞培养系统中差异表达的转录调节基因,为研究HCV感染对细胞基因转录的影响提供了重要资料,加深了对HCV和宿主细胞相互作用机制的认识.     

体外培养人肝癌细胞系7721中HCV复制和表达特性

建立支持ＨＣＶ体外长期复制的细胞培养体系,研究其体外复制和表达特性。方法：将ＨＣＶ感染血清接种人肝癌细胞系７７２１后,以逆转录－聚合酶链反应、免疫组化、原位杂交检测细胞内ＨＣＶ的感染和复制情况。结果细胞内和培养上清中在孵育后的３月余均可间断地检测出ＨＣＶ正链和／或负链ＲＮＡ,多种ＨＣＶ抗原在细胞内能稳定有达;ＨＣＶ ＲＮＡ和抗原多位于胞浆中,结论ＨＣＶ在７７２１细胞系中的复制和表达与体内感染状态接     

丙型肝炎病毒体外细胞转染模型的研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)自1989年由美国学者Choo等首次从受感染的黑猩猩血清中分离得出,学者们对HCV体外培养体系进行了大量相关研究。从HCV动物模型到细胞模型,从HCV细胞感染模型到转染模型,从HCV亚基因组复制子到全基因组细胞培养体系,期望找到一种能够支持HCV体外复制的稳定可行的培养体系,来研究HCV复制机制和致病机制,尽早开发出新的抗HCV药物和有效的疫苗。     

PCR检测丙型肝炎病毒感染各高危人群

用ＰＣＲ方法克隆了中国丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染者的５’端非编码区（５’－ｎｏｎｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎ，５’－ＮＣＲ）序列，并根据此序列合成引物检测我国ＨＣＶ各高危感染人群的病毒复制情况，结果显示ＨＣＶＲＮＡ在慢性丙型肝炎患者的血清标中的阳性率为８１．８％（９／１１），在ＨＣＶ抗体阳性的血液透析患者血清标本中的阳性率为６３．６％（７／１１），在ＨＣＶ抗体阳性的献血员血清标中的阳性率为２０％（４／     

聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗不同基因型慢性丙型肝炎疗效分析

目的:探讨聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗不同基因型慢性丙型肝炎（丙肝）的疗效。方法:80例丙肝患者,采用特异性探针杂交法进行丙肝病毒（HCV）基因型分型,根据病毒基因型分型结果分成HCV 1b型组和非1b型组,2组均给予聚乙二醇干扰素（1.5 μg/kg皮下注射）和口服利巴韦林,治疗前后及随访中检测高灵敏HCV RNA作为疗效评价的指标。获得各组持续病毒学应答率,并比较2组持续病毒学应答率。结果: HCV 1b型组与非1b型组获得持续病毒学应答率分别为58.1%和86.5%,2组比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论:聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗HCV1b基因型疗效不佳,丙肝的疗效与基因型密切相关。     

干扰素α对丙型肝炎病毒复制子的抑制作用

目的 利用丙型肝炎病毒（HCV）复制子细胞模型,体外研究干扰素α（IFN-α）对HCV复制子的抑制作用,并探讨IFN-α信号传导与激活转录分子（STAT）及介导IFN-α抗病毒作用的干扰素刺激基因（ISGs）的表达水平。方法 以HCV复制子质粒为模板体外转录合成HCV复制子RNA,将此RNA转染Huh7肝癌细胞并经G418筛选,建立HCV复制子细胞株;用不同剂量（0—5000 IU／m1）IFN-α处理HCV复制子细胞72h或用1000 IU／ml IFN-α处理细胞不同时间（0、24、48、72、96h）,通过半定量RT—PCR及实时定量PCR同时检测HCVRNA,Western印迹检测HCVNSSA蛋白表达水平,研究IFN-α对HCV复制子的抑制作用。结果 IFN-α能明显抑制HCVRNA的复制,10IU／ml及25 IU／mlIFN-α可使HCVRNA较无IFN-α处理的对照细胞分别降低约68％及75％;IFN-α 1000IU／ml作用24h或96h导致HCVRNA较对照组分别降低75％及88％,同样,IFN-α对HCVNSSA蛋白的合成也有明显抑制作用,说明IFN-α的抗HCV作用呈剂量及时间依赖性;HCV复制子细胞中有抗病毒作用的ISG（PKR、2′5′OAS、G1P3、ISG20及ISGF3γ）呈明显的IFN诱导性表达。结论 IFN-α能明显抑制HCVRNA的复制,其抑制作用与IFN-α剂量及作用时间有关,PKR、2′5′OAS、G1P3、ISG20及ISGF3γ等ISG可能介导IFN-α的抗HCV作用。     

HCV的新型体外细胞模型:复制子系统

自1989年丙型肝炎病毒(HCV)被分子克隆后,其流行病学、基因组学的相关研究取得了一定的进展,然而由于缺乏有效的体外细胞复制模型,HCV的研究长期以来受到阻碍. 1999年Lohmann等在Science上首先报道了选择性双顺反子亚基因组HCV RNA复制子系统,其被公认为是HCV RNA体外复制模型研究获得突破进展的里程碑. 复制子在人肝癌细胞株Huh-7细胞株中能高水平的自主复制. 研究发现复制子在细胞中复制对宿主细胞生长和代谢无明显影响,高水平复制与病毒基因组的适应性突变和宿主细胞的容受性有关. 这些研究结果为选择性HCV全序列基因组复制子的研究奠定了基础. 复制子系统的建立对HCV致病机制、治疗药物筛选及疫苗方面的研究具有重要的意义.