人鼻咽癌CD133+干细胞的生物学特性及意义**

背景：有研究表明肿瘤细胞株中存在肿瘤干细胞,是肿瘤复发、转移的根源,但人鼻咽癌细胞株CNE-2中肿瘤干细胞的表达及生物学特性至今少有报道。 目的：观察人鼻咽癌CD133+干细胞生物学特性及意义。 方法：采用流式细胞仪检测人鼻咽癌细胞株CNE-2中CD133的表达情况。免疫磁珠分选技术获得人鼻咽癌CD133+干细胞,分别采用无血清培养法、CCK-8法、平板克隆形成试验及裸鼠体内成瘤实验检测CD133+干细胞的体外增殖及体内成瘤能力,并将其与CD133-及未分选鼻咽癌细胞进行比较,以了解CD133+干细胞的生物学特性。 结果与结论：免疫磁珠富集的CD133+细胞在无血清培养基中呈悬浮生长,并可以形成肿瘤干细胞球。CD133+细胞与CD133-细胞比较具有较高的克隆形成能力(P < 0.01);CD133+细胞在裸鼠体内的成瘤率高于CD133-细胞(P < 0.05)。结果证实,鼻咽癌CD133+干细胞能在体外分离培养,形成干细胞球,增殖能力强,在裸鼠体内具有极强的成瘤能力。 关键词：鼻咽癌;肿瘤干细胞;增殖;生物学特性;干细胞培养 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.06.013     

人鼻咽癌细胞株中肿瘤干细胞分离鉴定方法及肿瘤多药耐药机制

目的:研究人鼻咽癌细胞株中肿瘤干细胞分离鉴定方法及对肿瘤多药耐药机制。 方法:取鼻咽癌细胞株（SUNE）,进行细胞的培养、传代及鉴定,采用免疫荧光细胞化学技术联合流式细胞仪检测SUNE中CD133-及CD133+细胞体外分化能力。利用免疫磁珠分选技术完成CD133+肿瘤细胞纯化,测定CD133+细胞体外增殖能力,将其与未分选及CD133-细胞进行比较。取顺铂、紫杉醇化疗药物,采用CCK-8法测定CD133+细胞耐药性。取10只4周龄ICR小鼠,皮下注射人鼻咽癌细胞株和普通细胞株,分析耐药性。 结果:分离培养的SUNE在含有血清的培养基中呈贴壁生长,并且生长活跃,培养2~3 d后倒置显微镜下显示细胞呈梭形、扁平状,光泽度良好,培养2 周左右细胞融合瓶底80.00%;流式细胞仪检测结果显示:约0.35%细胞表面膜存在抗原CD133。免疫细胞化学显示:SUNE细胞贴壁爬行,部分细胞能与SUNE中的CD133-相互结合,荧光显微镜下显示呈现橙红色,球状;向经免疫磁珠分选后的细胞中加入培养基,细胞呈单细胞,球形,悬浮生长。随着培养时间的不断延长,细胞开始出现团状生长,体积增加,细胞数量增多,培养24 h后细胞开始贴壁生长,培养7 d后呈串状生长;CD133+肿瘤细胞、CD133-肿瘤细胞及未分选细胞随着时间的延长细胞均出现增长,且CD133+肿瘤细胞增殖能力显著高于CD133-肿瘤细胞及未分选细胞（P<0.05）。10只小鼠均可见瘤体形成,种植人鼻咽癌细胞株组的瘤体体积显著大于普通细胞株组（P<0.05）。结论:鼻咽癌干细胞中CD133+对化疗药物的耐药性强。     

从PBMCs及CD133免疫磁珠分选获得内皮祖细胞的体外研究

目的：比较从外周血单个核细胞(PBMCs)和CD133免疫磁珠分选体外培养人外周血内皮祖细胞(EPCs)的表型、分化、扩增、功能特点,为EPCs细胞治疗提供临床参考。方法： 健康成年人外周血,经Ficoll密度梯度离心法得PBMCs,经直接接种法或免疫磁珠分选CD133阳性细胞后置于M199培养基中培养,于第7、14 d比较2组细胞表型变化及细胞因子分泌、扩增、体外血管形成及趋化能力。结果：相同血量标本PBMCs组早期集落数高于CD133+组(P<0.01),随着培养时间的推移,流式细胞检测2组细胞均显示造血干细胞标志的表达下调和内皮细胞标志表达上升,但CD133+组内皮标志CD144表达率低于PBMCs组(P<0.01),ELISA法检测到在PBMCs组早期EPCs分泌VEGF的水平高于CD133+组(P<0.01),MTT法显示PBMCs组有较强的增殖能力,基质胶及Transwell实验表明PBMCs组细胞参与血管形成的能力较强。结论： CD133+来源的EPCs分化、分泌、增殖及血管形成能力相对较低,推断PBMCs中CD133-细胞可能在形成功能性的EPCs中发挥更重要的作用。     

人胎儿脑室区神经前体细胞的分离纯化、培养及鉴定

目的建立有效的人胎儿神经前体细胞分离及纯化系统。方法取人自然流产胎儿脑室区(VZ)并制备单细胞悬液,采用免疫磁珠法分离CD133阳性及CD133阴性细胞群,体外培养并比较两者增殖能力。用免疫荧光化学方法检测CD133阳性细胞群中神经上皮干细胞蛋白(nestin)的表达及诱导分化后的多向分化潜能。结果纯化后CD133阳性细胞群体外扩增能力强,在无血清培养体系中能形成神经球并可连续传代,免疫荧光化学法检测表明其nestin抗原阳性,诱导分化后可分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。而CD133阴性细胞在培养体系中多呈单个分散状态,神经球形成数目与CD133阳性细胞有显著性差异(P<0.05)。结论免疫磁珠法可有效分离人胎儿脑内CD133阳性细胞,且该细胞在体外培养体系中具有神经前体细胞的特征。     

X射线增强CD133~-鼻咽癌细胞干样能力的研究

目的探讨CD133~-鼻咽癌细胞经X射线处理后,其干样相关潜能是否得到增强。方法采用免疫磁珠法分选人鼻咽癌CNE-1细胞株,采用流式细胞仪检测分选后细胞CD133的表达率,并通过侵袭能力分析及体内成瘤实验鉴定其干性。采用4 Gy的X射线照射非肿瘤干细胞的CD133~-鼻咽癌细胞,通过侵袭能力分析及体内成瘤实验观察照射前后其干性特征变化,采用RT-PCR检测其CD133、SOX2及OCT4 mRNA表达变化。结果流式细胞仪检测结果提示CD133~+细胞及CD133~-细胞亚群,其CD133表达分别为97.72%±0.82%和1.63%±0.66%。CD133~+细胞亚群其侵袭能力及体内成瘤能力明显强于CD133~-细胞亚群。经电离辐射后,CD133~-细胞亚群其侵袭能力及体内成瘤能力明显增加。RT-PCR结果显示,照射后CD133、SOX2及OCT4 mRNA的表达水平明显上调。结论在体外,X射线可通过上调干样相关基因表达,从而增强CD133~-鼻咽癌细胞的干样相关潜能。     

磁珠分选U251细胞系中的CD133+细胞及其生物学特性

背景：脑肿瘤干细胞理论认为,脑肿瘤干细胞是脑肿瘤细胞中“种子”细胞,是脑肿瘤发生、浸润和复发的关键细胞。 目的：观察人多形性胶质母细胞瘤U251细胞系中CD133⁺细胞的增殖、分化及体内致瘤性等生物学特性。 方法：运用磁珠分选技术分选U251细胞系中的CD133⁺和CD133^-细胞亚群;MTT法绘制两个亚群细胞的生长曲线;单克隆形成率实验检测2个亚群细胞的增殖能力;免疫荧光检测CD133⁺细胞亚群的多向分化能力;裸鼠移植实验检测2个亚群细胞在裸鼠体内致瘤性的差异。 结果与结论：U251细胞系中只有约4.5%的CD133⁺细胞;分选后的CD133⁺细胞能增殖形成典型的脑肿瘤干细胞球,生长曲线显示CD133⁺细胞增殖能力明显强于CD133^-细胞;单克隆形成率实验显示CD133⁺细胞能形成脑肿瘤干细胞球的细胞比率达到78.5%~92.4%,而CD133^-细胞仅有0.8%~2.4%;CD133⁺细胞能分化为具有GFAP和NeuN成熟表型的肿瘤细胞;CD133⁺的致瘤率为71.42%,而CD133^-细胞无致瘤性。提示U251细胞系中存在少量具有增殖、多向分化与体内致瘤能力的CD133⁺细胞,CD133⁺细胞是符合肿瘤干细胞定义的细胞亚群。     

干细胞表面标志CD133在肝癌中的表达及其阳性亚群增殖特性北大核心

背景:以CD133为标志物,利用其蛋白特异性特征可对不同的肿瘤干细胞进行分选和研究。目的:探讨干细胞表面标志CD133在肝癌中的表达及其阳性亚群的体外增殖特性。方法:对人肝癌MHCC97-H细胞株进行培养和分选,分别获得CD133^+与CD133^-MHCC97-H细胞,检测CD133表达及细胞迁移侵袭能力;培养14 d,检测细胞克隆形成率;培养7 d,检测细胞增殖及Notch基因蛋白表达。将CD133^+与CD133^-MHCC97-H细胞分别接种于裸鼠背部皮下,4周后,检测成瘤情况。结果与结论:(1)CD133表达与细胞克隆形成率:CD133^+MHCC97-H细胞CD133表达率、克隆形成率均显著大于CD133^-MHCC97-H细胞(P<0.05);(2)细胞增殖:CD133^+MHCC97^-H细胞培养3-7 d的吸光度值大于CD133^-MHCC97-H细胞(P<0.05);(3)细胞迁移侵袭:CD133^+MHCC97-H细胞迁移与侵袭实验的透膜细胞数均显著多于CD133^-MHCC97-H细胞(P<0.05);(4)Notch基因蛋白:CD133^+MHCC97-H细胞Notch基因蛋白表达多于CD133^-MHCC97-H细胞(P<0.05);(5)成瘤实验:CD133^-MHCC97-H细胞组成瘤体积大于CD133^-MHCC97-H细胞组(P<0.05);(6)结果表明:CD133阳性肝癌细胞亚群具有较强的体外增殖特性,具有一定的肿瘤干细胞特性,并有较强的侵袭、转移及致瘤能力。     

小鼠髓母细胞瘤干细胞分离培养及干细胞标记物的分析

目的 旨在建立自发髓母细胞瘤模型小鼠肿瘤干细胞分离培养方法,观察其在体外形成克隆的能力,对可能的肿瘤干细胞标志分子CD44、CD133和CD15进行流式细胞术分析鉴定.方法 将小鼠髓母细胞瘤组织通过温和消化液消化分离成单细胞悬液,于干细胞培养基中培养.计算其细胞球形成率.于含血清培养基中培养观察分化能力.利用流式细胞术对其表面可能的干细胞表面标记分子进行分析鉴定.结果 从模型小鼠髓母细胞瘤组织中成功分离培养髓母细胞瘤原代细胞,原代细胞可形成具有高度的自我更新和增殖能力的细胞球;细胞球可在含血清培养基中贴壁分化成为神经元样细胞;干细胞表面标记分子流式细胞术分析表明髓母细胞瘤干细胞中CD44表达较高,CD133及CD15的表达无差异或者降低.结论 髓母细胞瘤肿瘤细胞中存在一定量的具有自我更新增殖能力、高表达CD44的肿瘤干细胞,并能在体外将其分离培养、连续传代及诱导发生分化.     

hTR反义寡核苷酸对不同鼻咽癌细胞生长分化的影响

目的 :研究端粒酶反义寡核苷酸对鼻咽癌细胞生长分化的影响。方法 :脂质体介导反义寡核苷酸转染鼻咽癌CNE1和CNE2Z细胞株 ,用细胞体外增殖实验、免疫组织化学S P法 ,观察细胞生长分化的变化情况。结果 :针对端粒酶RNA模板区的反义寡核苷酸可抑制CNE1和CNE2Z细胞的增殖并呈剂量和时间依赖性 ,反义寡核苷酸组细胞角蛋白表达高于其它处理组及空白对照组 (P <0 0 1) ,细胞形态趋向分化成熟。结论 :端粒酶反义寡核苷酸可抑制鼻咽癌CNE1和CNE2Z细胞的生长 ,并促进细胞分化。     

免疫磁珠体外纯化人胎脑中CD133阳性干细胞的实验研究

为了探讨免疫磁珠体外纯化人胎儿脑内 CD13 3阳性细胞的可行性 ,本研究取人胎儿脑室下区并制备单细胞悬液 ,采用磁珠分选法选择 CD13 3阳性细胞群 ,台盼蓝染色观察活力并采用流式细胞仪鉴定纯化前后 CD13 3的阳性表达率。结果显示 ,分选后所得细胞纯度为 ( 85 .5 7± 1.66) % ,回收率为 ( 62 .3± 18) % ,纯化前后细胞活力无显著性差异 ( P>0 .0 5 )。结论 :联合应用CD13 3表面标志及免疫磁珠分选系统可有效地从人胎儿脑组织中直接分离得到高纯度的 CD13 3阳性干细胞 ,细胞活力不受影响     

恶性肿瘤干细胞标记物CD34在鼻咽癌细胞系的表达

BACKGROUND:Previous research have confirmed that CD34 is closely related to oncogenesis, progress, recurrence, metastasis and drug-resistance of various cancers, but its role in nasopharyngeal carcinoma remains unclear. OBJECTIVE:To sort cells positive and negative for CD34 in nasopharyngeal carcinoma cell lines and to detect cell proliferation and migration. METHODS:Expressions of CD34 in nasopharyngeal carcinoma cell lines 5-8F, 6-10B, CNE1 and CNE2 were detected by flow cytometry. And CD34+ and CD34^- cells were sorted based on cell surface markers for purity identification. Afterwards, proliferation and migration of CD34⁺ and CD34^- cells were detected by MTT assay, colony-formation assay and scratch assay. RESULTS AND CONCLUSION:All four nasopharyngeal carcinoma cell lines expressed CD34 in 0.1%-0.2%, and the level of CD34 was closely related to the cell growth density. The purity of CD34⁺ cell was more than 98% in the sorted CD34⁺ cell populations, but no CD34⁺ cells were found in the sorted CD34^- cell populations. At 1, 3, 5 and 7 days the proliferation rate of CD34⁺ cell, populations was significantly higher than that of CD34^- cells (P < 0.05). Consistently, the colony-formation efficiency of CD34⁺ cell was significantly higher than that of CD34^- cells (P < 0.05). Moreover, CD34⁺ cells migrated significantly faster than CD34^- cells by scratch assay (P < 0.05). In conclusion, CD34⁺ cells cultured in vitro display higher proliferation and migration capacities, indicating that CD34⁺ cells have the potential of nasopharyngeal carcinoma stem cells.     

转酮酶样蛋白1在人类鼻咽癌细胞生长增殖中的作用

目的:探讨转酮酶样蛋白1(TKTL1)在体外培养的人类鼻咽癌细胞生长增殖中的作用.方法:构建针对TKTL1 mRNA 的干扰RNA质粒,转染人类鼻咽癌细胞(CNE细胞系);检测转染前后CNE细胞中转酮酶活性的变化;实时定量RT-PCR检测转染前后CNE细胞转酮酶基因家族(TKT、TKTL1、TKTL2)mRNA表达水平的变化;通过流式细胞术和MTT实验检测转染前后CNE细胞增殖和细胞周期的改变.结果:实验组CNE细胞中转酮酶活性(携带有pEGFP-C1-U6/TKTL1)明显低于质粒对照组(携带有pEGFP-C1-U6/UC)和空白对照组(未转染细胞);实时定量RT-PCR结果显示转染前后CNE细胞中TKT和TKTL2 mRNA的表达水平均无显著差异.然而,实验组细胞中TKTL1的表达水平明显低于对照组,且实验组CNE细胞增殖明显被抑制,癌细胞被阻滞在G0/G1期.结论:转酮酶蛋白TKTL1在人类鼻咽癌细胞的生长增殖中起重要作用,TKTL1可能成为肿瘤治疗研究的新靶点.     

基于CRISPR/Cas9技术构建SETD2基因敲除鼻咽癌细胞株并分析其增殖特性

目的:基于CRISPR/Cas9技术构建SETD2基因敲除鼻咽癌(NPC)细胞株,并对该细胞株的增殖特性进行分析。方法:采用RT-PCR及Western blot检测永生化鼻咽黏膜细胞系NP-69及不同分化NPC细胞系CNE1、CNE2Z和C666-1中SETD2的表达情况,筛选出SETD2高表达细胞系CNE1。应用CRISPR/Cas9技术敲除CNE1细胞中的SETD2基因,筛选SETD2稳定敲除细胞株。采用CCK-8和平板集落形成实验分析SETD2基因敲除前后CNE1细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞周期的分布,Western blot检测细胞周期相关蛋白的表达。结果:与NP-69细胞相比,随着细胞分化程度的降低,SETD2在CNE1、CNE2Z和C666-1细胞中的表达逐渐下降(P 0. 01)。基于CRISPR/Cas9方法成功地从15个转染了小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)的CNE1细胞单克隆中筛选出2个SETD2稳定敲除的细胞株CNE1-SETD2-KO-#5和#9。CCK-8及平板集落形成实验结果证实,相对于CNE1-WT细胞,CNE1-SETD2-KO-#5和#9细胞的增殖能力增强(P 0. 05);流式细胞术分析表明,CNE1-SETD2-KO-#5和#9细胞G1期减少而G2/M和S期均增加(P 0. 05); Western blot证实,SETD2敲除后增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期素D1(cyclin D1)、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、细胞周期素依赖性激酶2(CDK2)和CDK4表达增加,p21表达减少(P 0. 05)。结论:基于CRISPR/Ca9技术成功构建SETD2基因敲除NPC细胞株。NPC细胞中SETD2表达与细胞分化程度有关; SETD2表达缺失通过上调cyclin D1、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、CDK2和CDK4并下调p21表达而促进细胞增殖。     

重楼皂苷Ⅰ抗肝癌细胞作用的初步研究

目的:本文旨在研究重楼皂苷Ⅰ对肝癌细胞株Huh7和HepG2的抑制作用并探讨其是否具有抑制肝癌干细胞的功效.方法:不同剂量的重楼皂苷Ⅰ处理肝癌细胞后,MTT方法检测细胞存活情况;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Transwell实验检测细胞迁移能力;磁珠分选出CD133+-Huh7和CD133--HepG2细胞后,成球实验...     

EB病毒潜伏膜蛋白对人鼻咽癌细胞系CNE1生长分化的影响

目的 研究ＥＢ病毒潜伏膜蛋白（ＥＢＶ－ＬＭＰ）对人高分化鼻咽癌细胞生长分化的影响。方法 以人高分化鼻咽癌细胞株（ＣＮＥ１）为对象,采用电穿孔基因转染技术,将重组ＥＢＶ－ＬＭＰ表达质粒转染ＣＮＥ１细胞。以载体质粒转染及ＣＮＥ１细胞为对照,用细胞体外增殖实验、流式细胞信（ＦＣＭ）和裸鼠体内丰瘤实验等,观察细胞生长分化的变化。结果 ＥＢＶ－ＬＭＰ在体外可明显促进ＣＮＥ１细胞地增殖,实验组平均吸光度（Ａ）     

EBV-LMP及二甲基亚砜对人鼻咽癌细胞生长分化的影响

目的：研究ＥＢＶ－ＬＭＰ及二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）对人鼻咽癌（ＮＰＣ）细胞体外生长分化的影响。方法：以人高分化鼻咽癌细胞株（ＣＮＥ１）为对象，采用电穿孔基因转染技术，将重组ＥＢＶ－ＬＭＰ表达质粒转染ＣＮＥ１细胞，以载体质粒转染及ＣＮＥ１细胞为对照，用细胞体外增殖实验、流式细胞仪和免疫组化等方法，观察细胞生长分化的变化情况。结果：ＥＢＶ－ＬＭＰ在体外可明显促进ＣＮＥ１细胞的增殖，实验组与空白组及阴性对照组比较Ｐ＜０．０１，实验组Ｓ期细胞明显增多，细胞角蛋白表达显著下降（Ｐ＜０．０５），有向低分化鳞癌发展倾向；ＤＭＳＯ诱导后ＣＮＥ１细胞增殖力明显下降（Ｐ＜０．０１），细胞角蛋白表达显著增高（Ｐ＜０．０１）；ＬＭＰ可明显抑制ＤＭＳＯ对ＣＮＥ１细胞的诱导分化作用，转染细胞诱导后增殖力和角蛋白表达无显著改变（Ｐ＞０．０５）。结论：ＤＭＳＯ可在一定程度上诱导ＣＮＥ１细胞分化；ＥＢＶ－ＬＭＰ对ＣＮＥ１细胞生长有明显的促进作用，可抑制细胞分化及降低细胞对终末分化信号的反应，有助于深入研究ＮＰＣ的发生机理及防治     

CD44和CD24在鼻咽癌细胞系HK-1中调控STAT3发生磷酸化的分子机制研究

目的 研究CD44和CD24在鼻咽癌细胞系HK-1中调控STAT3发生磷酸化的分子机制.方法 采用流式细胞仪对培养的鼻咽癌HK-1高分化NPC细胞进行分选以获得CD44 +/CD24+ HK1细胞及CD44-/CD24-HK1细胞,通过Western blot、MTT和肿瘤微球形成等实验,分析鼻咽癌阳性肿瘤细胞中P-STAT3的表达,以及STAT3被抑制剂Stattic沉默后,对CD44+/CD24+ HK1和CD44-/CD24-HK1细胞增值能力和肿瘤微球形成能力的影响.结果 鼻咽癌HK-1细胞中可以提取到34.7％的CD44 +/CD24+ HK1细胞和41.5％的CD44-/CD24-HK1细胞,CD44+/CD24+ HK1细胞比CD44 /CD24-HK1细胞表达磷酸化STAT3水平高.STAT3的抑制剂Stattic可以抑制CD44+/CD24+ HK1和CD44-/CD24-HK1细胞磷酸化STAT3的表达,MTT实验显示16μmol/L Stattic明显抑制CD44+/CD24+ HK1和CD44-/CD24-HK1细胞增殖,肿瘤微球形成实验表明Stattic可明显抑制CD44+/CD24+ HK1和CD44-/CD24-HK1细胞微球形成能力,即STAT3在CD44+/CD24+ HK1细胞增殖和鼻咽癌进程中发挥重要的作用.结论 CD44和CD24在鼻咽癌侧群细胞HK-1细胞中,CD44 +/CD24+阳性细胞通过诱导STAT3发生磷酸化来促进鼻咽癌发展,为鼻咽癌肿瘤干细胞的靶向治疗提供了新的靶点,临床治疗可靶向抑制STAT3的表达,从而抑制CD44+/CD24+ HK1细胞增殖和肿瘤微球的形成,最终达到降低鼻咽癌的发生率.