GABA对胆管癌细胞株QBC939增殖及凋亡的影响

目的观察γ-氨基丁酸(GABA)对胆管癌细胞QBC939增殖及凋亡的影响。方法采用MTT比色法观察GABA对人系胆管癌细胞QBC939增殖的作用,流式细胞术检测GABA对胆管癌细胞QBC939凋亡及其细胞周期的影响,放射免疫分析法检测cAMP含量。结果GABA抑制胆管癌细胞的增殖,呈剂量依赖性,流式细胞仪检测结果显示,随药物浓度增加,细胞凋亡率显著增加(4.8%增至28.03%,P<0.05),同时促进胆管癌细胞内cAMP含量的增加。结论GABA抑制胆管癌细胞QBC939增殖,诱导细胞凋亡,可能机制是通过受体后信息介导的。     

光动力疗法对人胆管癌细胞QBC939凋亡的影响

目的 研究血卟啉衍生物(hematoporphyrin derivative,HPD)介导的光动力作用(photodynamic therapy,PDT)对人胆管癌细胞QBC939凋亡的影响及其作用机制.方法 体外培养人胆管癌QBC939细胞株,用不同浓度HPD处理,并用半导体激光治疗仪不同强度光照后,应用CCK8法检测PDT对QBC939细胞生长的相对抑制率.采用流式细胞术检测PDT作用前后QBC939细胞凋亡情况.应用RT-PCR检测PDT作用前后QBC939细胞中血管内皮细胞生长因子-C (VEGF-C)、环氧合酶-2 (COX-2)基因表达情况.用SP免疫细胞化学法测定PDT作用前后QBC939细胞质中VEGF-C、COX-2两种蛋白表达情况.用ELISA法测定PDT作用前后QBC939细胞上清中VEGF-C、COX-2两种蛋白分泌情况.结果 HPD-PDT在体外能够抑制QBC939细胞生长,HPD 10 mg/L经5 J/cm2光照强度时,实验组与空白组A值差异有统计学意义(P＜0.05),细胞生长抑制率达到70％.继续增加药物浓度或光照剂量,差异无统计学意义,细胞存活率降低不明显.流式细胞术显示HPD-PDT明显促进QBC939细胞早期凋亡.RT-PCR显示HPD-PDT能明显抑制QBC939细胞中VEGF-C、COX-2基因表达.SP免疫细胞化学法显示HPD-PDT能抑制QBC939细胞质中VEGF-C、COX-2两种蛋白表达.ELISA法显示HPD-PDT能抑制QBC939细胞VEGF-C、COX-2两种蛋白细胞外分泌.结论 HPD-PDT能抑制胆管癌QBC939细胞生长,促进胆管癌细胞早期凋亡.HPD-PDT对胆管癌QBC939细胞生长的抑制作用可能是通过促进早期凋亡实现的,而VEGF-C、COX-2从基因到蛋白水平低表达可能是促进胆管癌QBC939细胞早期凋亡的途径.     

shRNA 介导的NGF-β下调对人胆管癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨shRNA介导的神经生长因子β(NGF-β)下调对人胆管癌细胞系QBC939体外增殖与凋亡的影响.方法:构建稳定转染NGF-β shRNA的QBC939细胞系,将细胞分为干扰组(转染NGF-β shRNA组)和对照组(转染空质粒组).以Western blot方法检测细胞转染效果;细胞增殖实验(CCK-8实验)检测细胞增殖能力,单克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡.结果:干扰组细胞较之对照组的细胞增殖、克隆形成能力明显降低,S期细胞明显减少(P＜0.05),凋亡率明显增加(P＜0.05).结论:抑制NGF-β能降低QBC939细胞系的增殖和克隆形成能力,该作用与其阻滞细胞进入S期,促进细胞凋亡有关.     

microRNA let-7a对胆管癌细胞凋亡和周期的影响

目的:探讨microRNA(miRNA) let-7a在胆管癌组织中的表达及其意义.方法:用Real-time PCR检测let-7a在胆管癌与正常胆管组织中的表达;将胆管癌HuCCT-1细胞分为let-7a过表达组(转染let-7a mimics),阴性对照组(转染阴性对照序列)和空白对照组(无转染),分别用Real-time PCR和流式细胞仪检测各组细胞let-7a的表达,细胞凋亡和周期情况.结果:let-7a在胆管癌组织中表达较正常胆管组织明显下调(P＜0.01);与空白对照组比较,let-7a过表达组HuCCT-1细胞的let-7a表达明显升高,细胞凋亡率明显增加(均P＜0.01),而阴性对照组与空白对照组间无统计学差异(均P＞0.05);各组间细胞周期差异无统计学意义(P＞0.05).结论:胆管癌组织中let-7a表达下调,let-7a表达下调抑制了细胞凋亡,从而可能在促进胆管癌发生与发展中起了重要作用.     

LY294002对胆管癌细胞凋亡的影响

目的：观察PI3-Kinase抑制剂LY294002对人胆管癌细胞QBC939的作用。
方法：MTT法检测LY294002对QBC939细胞的生长抑制作用;流式细胞术检测LY294002诱导的细胞凋亡;免疫印迹法分析LY294002对于PI3-K/Akt信号通路中Akt磷酸化及caspase9的表达作用。
结果：LY294002可抑制胆管癌细胞QBC939的增殖,促进其凋亡。Western-blotting显示,LY2940022可抑制Akt磷酸化水平,促进caspase3,9的蛋白表达。
结论：LY294002可通过抑制Akt信号通路的活性,上调促凋亡分子caspase3,9的表达,抑制胆管癌细胞QBC939的增殖,诱导其凋亡。

     

靶向survivin的siRNA联合凋亡相关配体对肝癌细胞的影响

目的探讨靶向survivin的siRNA联合肿瘤坏死因子诱导凋亡相关配体(tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)对肝癌细胞增殖与凋亡的影响。方法构建靶向survivin基因的siRNA真核表达载体,观察可溶性TRAIL对肝癌细胞增殖与凋亡的影响。结果采用RT-PCR检测显示,siRNA在mRNA水平抑制survivin基因表达为73％。MTT法检测到可溶性TRAIL对HepG2、HepG2／Silence(-)细胞增殖无明显的抑制作用(P>0．05),通过抑制survivin表达,可使HepG2／Silence(+)细胞的12 h存活率明显降低,48 h降至最低[HepG2／Silence(+)0．518±0．017,对照组0．741±0．005,P<0．01]。荧光显微镜检测HepG2／Silence(+)细胞12 h、24 h、48 h的细胞凋亡率分别为:11．85％±0．72％、28．97％±0．43％、41．80％±0．90％,与对照组相比差异有统计学意义(F=22．37,P<0．05)。结论靶向survivin的siRNA在抑制肝癌细胞中survivin表达的同时可增强TRAIL作用的敏感性。     

Survivin 抑制人胆管癌细胞凋亡相关信号通路的实验研究

目的:探讨survivin基因对人胆管癌细胞凋亡信号通路的调节机制.方法:构建针对survivin基因的siRNA和对照siRNA,将QBC939人胆管癌细胞分为3组,分别为siRNA-survivin转染组,对照siRNA转染组和未转染组.转染后,首先用Western blot检测未转染QBC939细胞和QBC939/siRNA(-)细胞及QBC939/siRNA(+)细胞中survivin的表达,验证干扰效果,继而分别用流式细胞仪,激酶活性测定和Western blot检测以上3种状态的QBC939细胞的凋亡情况,caspase-3的活性和caspase-3,caspase-9及procaspase-9凋亡信号分子的表达.结果:QBC939/siRNA(+)细胞survivin蛋白表达量明显低于未转染的QBC939细胞(P＜0.05),而QBC939/siRNA(-)细胞survivin蛋白表达量无明显改变(P＞0.05).与未转染的QBC939细胞比较,QBC939/siRNA(+)细胞凋亡明显增加,caspase-3活性明显升高,caspase-3和caspase-9表达明显上调,而procaspase-9表达降低(均P＜0.05);上述指标在QBC939/siRNA(-)细胞与未转染的QBC939细胞间的差异无统计学意义(均P＞0.05).结论:survivin基因可能通过促进procaspase-9的活化阻止caspase-3和caspase-9的激活,从而抑制胆管癌细胞的凋亡.     

姜黄素抑制人肾癌细胞769-P增殖及促凋亡的实验研究

【摘要】 目的 分析不同浓度姜黄素（curcumin,分子式C₂₁H₂₀O₆）对人肾癌细胞769-P的生物学作用及其调控机制。方法 体外培养人肾癌细胞769-P,用不同浓度姜黄素处理24 h后,采用MTT比色法测定姜黄素对细胞的增殖抑制作用,利用倒置显微镜观察细胞的显微形态结构,采用细胞划痕法观察细胞的迁移情况;Western Blot 法检测细胞内Caspase-3、 AIF蛋白质的表达情况;用反转录PCR法检测AIF、Bax mRNA的表达水平。结果 MTT法检测显示姜黄素能显著抑制人肾癌细胞系769-P的增殖,呈现浓度和时间效应关系;倒置显微镜结果显示姜黄素能够使肾癌细胞系的形态学发生改变,呈现出典型凋亡特征如核皱缩、核破裂、核肿胀等形态;细胞划痕实验显示,姜黄素抑制了肾癌细胞系的迁移;RT-PCR实验显示,姜黄素促进了BAX mRNA和AIF mRNA的表达;蛋白杂交实验显示,姜黄素促进了Caspase-3和AIF蛋白的活化,从而促进了凋亡。结论 姜黄素能显著抑制人肾癌细胞的增殖并促进其凋亡,这种生物学效应可能与激活Bax和AIF表达,活化Caspase-3的信号通路有关。     

RNA干扰诱导型一氧化氮合酶基因表达对人胆管癌细胞生长的影响

目的:探讨RNA干扰诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表达对人胆管癌细胞生长的影响。方法:针对iNOS设计并合成3种iNOS-siRNA序列(siRNA1、siRNA2、siRNA3)及阴性对照siRNA序列后,分别转染人胆管癌细胞QBC939细胞,用荧光显微镜下观察转染效率,通过iNOS mRNA与蛋白的变化分析干扰效果,选择干扰效果最为明显的iNOS-siRNA序列,观察其干扰后QBC939细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的变化。实验以无处理的QBC939细胞为空白对照。结果:合成的3种iNOS-siRNA序列均可有效转染人胆管癌QBC939细胞,且转染后均能明显降低QBC939细胞中iNOS mRNA与蛋白的表达(均P0.05),其中siRNA2对iNOS的抑制作用最为明显,阴性对照siRNA序列对QBC939细胞中iNOS mRNA与蛋白的表达无明显影响(均P0.05)。转染siRNA2后,QBC939细胞增值明显降低、出现明显的G0/G1期阻滞、凋亡率明显增加(均P0.05);转染阴性对照siRNA序列的QBC939细胞无上述改变(均P0.05)。结论:RNA干扰能有效降低iNOS基因在胆管癌细胞中的表达,从而抑制胆管癌细胞的增殖,并促进其凋亡。     

1,25二羟维生素D3对胆管癌细胞系QBC939增殖和凋亡的影响

目的 探讨1,25二羟维生素D3[1,25(OH)2 D3]对胆管癌细胞系QBC939的体外增殖及凋亡的影响.方法 将不同浓度的1,25(OH)2 D3与胆管癌细胞系QBC939共同培养,采用MTT法测定细胞增殖能力、显微镜观察细胞形态学的改变、流式细胞仪检测细胞周期与凋亡、免疫细胞化学观察bcl-2的表达.结果 0.1～0.5μmol/L的1,25(OH)2 D3对胆管癌细胞QBC939有抑制作用,呈剂量依赖性.经1,25(OH)2 D3作用72h后细胞G1期比例升高,S期比例下降,其中0.5μmol/L组细胞G1期由(50.3±1.0)%上升至(65.5±3.2)%,S期由(39.4±0.5)%下降至(23.6±0.7)%;并且可诱导细胞产生凋亡,0.5μmol/L组作用后细胞凋亡率由0.5%上升至24.6%;bcl-2的表达下调.结论 1,25(OH)2 D3能抑制胆管癌细胞系QBC939增殖并诱导细胞凋亡,其引起凋亡的机制可能与下调bcl-2的表达相关.     

Survivin siRNA纳米载体的制备及其对胰腺癌细胞生物学特性的影响

目的：利用纳米技术和基因干扰技术设计并合成携载survivin siRNA的纳米载体,探讨survivins iRNA纳米微粒对人胰腺癌细胞BXPC-3增殖和凋亡的影响。方法：体外培养人胰腺癌BXPC-3细胞,将BXPC-3细胞随机分为4组：生理盐水组、不含基因的纳米微粒组、survivin siRNA组和s urvivins iRNA纳米微粒组。RT-PCR检测survivin mRNA的表达;Wes tern blot法检测s urvivin蛋白的表达;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;MTT法检测细胞增殖情况。结果：细胞培养72 h后,survivin siRNA纳米微粒组细胞的survivin mRNA和蛋白表达均低于其他3组（P〈0.05）。survivin siRNA纳米微粒组细胞增殖明显受抑制,生长缓慢,而细胞凋亡率高于其他3组（P〈0.05）。结论：survivin siRNA纳米微粒能够有效减少胰腺癌BXPC-3细胞survivin mRNA和蛋白的表达,提高肿瘤细胞的凋亡,显著抑制BX-PC-3细胞的增殖。     

pEGFP-survivin对GBC-SD细胞生长的抑制及对化疗敏感性的影响

目的 观察pEGFP-survivin对GBC-SD细胞化疗敏感性的影响.方法 以MTT法检测GBC-SD、GBC-SD/EGFP和GBC-SD/survivin三种细胞的增殖活性;用RT-PCR和Western印迹、检测各组细胞中survivin mRNA和蛋白质水平的表达;以合适浓度的DDP作用相同的时间后,用MTT法检测3种细胞存活率,流式细胞仪测细胞凋亡,并用MTT法筛选IC_(50)值,TUNEL法观察细胞核改变;另外检测DDP作用后各组细胞的caspase-3蛋白酶活性的变化.结果 GBC-SD和GBC-SD/EGFP细胞的增殖活性大致相同,而GBC-SD/survivin细胞的增殖活性则明显下降;RT-PCR和Western印迹均发现GBC-SD/survivin细胞中的survivin表达水平较其余两种细胞明显下降;在给与DDP作用后,GBC-SD/survivin细胞存活率和IC_(50)明显较低,细胞凋亡率较高,而3种细胞用TUNEL法染色后均可见棕色凋亡细胞核.给与DDP作用后,各组细胞caspase-3活性均呈现先升高后下降的趋势,但GBC-SD/survivin细胞中caspase-3的活性明显高于另外两种细胞.结论 pEGFP-survivin表达的survivin shRNA能明显降低GBC-SD细胞中survivin的表达,提高对化疗药物的敏感性.     

人结肠癌相关成纤维细胞对结肠癌Lovo细胞生物学行为的影响

目的探讨人结肠癌相关成纤维细胞（CAF）对结肠癌Lovo细胞增殖、黏附、迁移和侵袭等生物学行为的影响。方法收集人结肠CAF及正常成纤维细胞（NF）条件培养基,建立结肠CAF、NF与Lovo细胞间的共培养模型,以无血清培养基处理的Lovo细胞作为空白组．进行细胞增殖、黏附、迁移及Transwell侵袭能力检测。结果Lovo细胞与结肠CAF共培养后。增殖48和72h反映细胞增殖的吸光度（A）值分别为（0．667±0．059）和（0．709±0．030）,明显高于空白组[（0．574±0．031）和（0．593±0．031）]和NF组[（0．597±0．036）和（0．652±0．029）],差异均有统计学意义（P〈0．01）;黏附细胞的A值为（0．588±0．067）,也明显高于空白组（0．226±0．039）和NF组（O．375±0．059）,差异也均有统计学意义（P〈O．01）;12h和24h细胞迁移率分别为（35．2±8．7）％和（64．6±7．1）％,明显高于空白组[（14．7±3．6）％和（26．3±10．3）％]和NF组[（14．1±7．3）％和（35．2±9．8）％]（P〈O．01）;透膜细胞数为（56．2±4．8）个,多于空白组的（14．6±2．2）个和NF组的（22．9~4．5）个（P〈O．01）。结论人结肠CAF具有增强结肠癌Lovo细胞增殖、黏附、迁移和侵袭的能力。     

靶向沉默Notch1基因对人膀胱癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨沉默Notch1基因对人膀胱癌细胞生物学行为的影响. 方法 将靶向Notch1的siRNA真核表达载体psiRNA Notch1-1转染膀胱癌细胞株T24和BIU-87,噻唑盐法、流式细胞术检测沉默Notch1后膀胱癌细胞生长、细胞周期和凋亡情况.RT-PCR和蛋白质印迹法检测转染前后Notch1基因mRNA和蛋白表达的变化. 结果 转染后72 h,T24和BIU-87细胞G0/G1期细胞比例明显增加,分别为(80.13±2.69)%和(69.44±2.41)%,与T24对照组(23.89±1.32)%和BIU-87对照组(24.63±1.68)%比较差异有统计学意义(P值均<0.05).转染后72 h,T24和BIU-87细胞凋亡率分别为(13.75±1.23)%和(8.72±1.01)%,与T24对照组(1.28±0.14)%和BIU-87对照组(1.01±0.27)%比较差异均有统计学意义(P值均<0.05).转染后24 h细胞生长明显受到抑制,该抑制作用持续到转染后96 h.转染后72 h,T24和BIU-87细胞中Notch1基因mRNA和蛋白表达明显下调(P<0.05). 结论 Notch1在膀胱癌细胞株中可能起致癌作用.沉默Notch1基因能够抑制膀胱癌细胞的增殖.     

WWOX在胆管癌组织中的表达及其对胆管癌细胞生物学行为的影响

目的 研究抑癌基因WWOX表达对胆管癌RBE细胞生长的影响.方法 采用免疫组化方法检测2005年7月至2010年5月54例胆管癌组织、12例正常胆管组织中WWOX蛋白表达水平.将携有WWOX基因的真核表达载体转染胆管癌细胞系RBE细胞(RBE/WWOX组),筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染空载质粒(RBE/con组)及未经转染(自然生长组)的RBE细胞作为对照.荧光定量RT-PCR和Western Blot法检测WWOX在RBE细胞中的表达情况;噻唑蓝实验检测转染前后各组细胞增殖活性;FCM法检测各组细胞的凋亡;JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位;Transwell小室侵袭实验检测各组肿瘤细胞侵袭力;荧光定量RT-PCR和Western Blot法检测胆管癌细胞bcl-2、bax、FasL、caspase-3表达的变化.结果 WWOX在胆管癌中的表达低于正常胆管组织(P＜0.05),蛋白表达的缺失频率为40.7%.建立稳定表达WWOX基因的RBE/WWOX细胞株,mRNA及蛋白表达明显增加.转染后的RBE细胞噻唑蓝吸光度明显下降(P＜0.05).与自然生长组和RBE/con组比较,FCM显示RBE/WWOX组细胞的凋亡率明显增高(P＜0.01),JC-1显示转染后的线粒体膜电位下降(P＜0.01),侵袭实验显示转移至下室滤膜的细胞数明显减少(P＜0.01).荧光定量RT-PCR结果显示bcl-2 mRNA表达是自然生长组的0.12倍,bax、caspase-3 mRNA分别是自然生长组的4.72和2.57倍,FasL mRNA的表达无明显变化;Western Blot法检测发现bcl-2蛋白的表达降低,bax、caspase-3蛋白表达升高,FasL无明显变化.结论 抑癌基因WWOX通过诱导胆管癌细胞凋亡发挥抗肿瘤增殖的作用.

Abstract：

Objective To study the effects of anti-oncogene WWOX on cell growth of cholangiocarcinoma. Methods The expression of WWOX protein was detected with immunohistochemical method-SP in 54 patients with cholangiocarcinoma from July 2005 to May 2010 and 12 samples of normal bile duct tissues. The recombinant WWOX eukaryotic expression plasmid was introduced into RBE cells by liposome-mediated transfection and positive cell clones were selected and amplified. The mRNA and protein expressions in RBE cells stably transfected with WWOX were investigated by quantitative RT-PCR and Western Blot before and after transfection. Cell proliferation was tested by MTT, cell apoptosis was assessed by FCM, the alteration of mitochondria membrane potential (△Ψm) was detected by JC-1 staining method,cell invasion was determined by Transwell chamber assay. The expression change of bcl-2, bax, FasL,caspase-3 mRNA and protein was detected by quantitative RT-PCR and Western Blot. Results The expression of WWOX protein was significantly lower in cholangiocarcinoma than that in normal bile duct tissues and loss of WWOX protein expression was found in 40. 7% of cholangiocarcinoma specimens ( P ＜0.05). RBE cells with stable transfection of WWOX were established. Quantitative RT-PCR showed that the expression of WWOX mRNA was significantly enhanced and Western Blot demonstrated that WWOX protein expression was markedly increased. MTT showed that WWOX gene transfection significantly decreased the proliferation of RBE cells ( P ＜ 0. 05 ). FCM analysis showed that the apoptosis rate after transfection was significantly promoted [( 1.1 ± 0. 6 ) % vs. ( 1.7 ± 0. 5 ) % vs. ( 35.2 ± 4. 4 ) %, P ＜ 0. 01], JC-1 staining method indicated that the experimental group was loss of △Ψm [( 12. 6 ± 1.9 ) % vs. ( 13.6 ± 1.8 ) % vs.(48. 7 ± 2. 9 ) %, P ＜ 0. 01], transwell chamber assay showed that the number of transfected cells that passed the transwell membrane was significantly less than those of control groups ( 77 ± 6 vs. 72 ± 8 vs. 48 ±6, P ＜0. 01 ). Quantitative RT-PCR and Western blotting showed that the expression of bcl-2 mRNA and protein was markedly decreased and the expression of bax, caspase-3 were significantly increased. There was no significant change in the expression of FasI. Conclusion WWOX exerts its antitumor effect against proliferation through inducing cell apoptosis in cholangiocarcinoma.     

IL-18基因转染大肠癌细胞及对其肿瘤原性改变的研究

目的：建立转染人白细胞介素-18（hIL-18）基因的大肠癌细胞株,并研究IL-18基因转染后SW480细胞肿瘤原性的改变。方法：将携带hIL-18的质粒pcDNA3.1-hIL-18转导入人大肠癌细胞系SW480细胞中,通过药物G-418进行筛选,利用RT-PCR和ELISA法对IL-18的表达进行检测;通过裸鼠致瘤实验观察肿瘤原性的改变。结果：IL-18基因成功转导入SW480细胞中并能顺利表达;RT-PCR电泳结果显示IL-18基因在mRNA水平有表达;ELISA结果显示,106个转染细胞在24 h内分泌IL-18的含量是（145.71±4.42）pg;空载体转染的细胞未检测到hIL-18;生长曲线显示转染hIL-18基因后的细胞生长明显减慢;黏附曲线显示SW480-hIL-18组的黏附率在各个时相点均明显升高,而空载体组和空白对照组之间差异无统计学意义（P〈0.05）。裸鼠致瘤实验表明,接种SW480-hIL-18细胞的裸鼠肿瘤体积明显小于SW480组和SW480-pcDNA3.1组;抗瘤实验结果显示,放射灭活的SW480-pcDNA3.1细胞和SW480-hIL-18细胞免疫接种裸鼠后,再接种SW480细胞于裸鼠左侧背部皮下,SW480-hIL-18细胞免疫接种组肿瘤长出的时间比SW480-pcDNA3.1细胞免疫接种组明显延长,并且肿瘤的生长速度明显低于SW480细胞免疫接种组。结论：hIL-18基因能成功整合到SW480细胞基因组中,并且能在转染的肿瘤细胞中持续表达。hIL-18基因转导后的SW480细胞生长受到抑制,黏附能力增强h,IL-18基因转染降低了SW480细胞的肿瘤原性;hIL-18基因修饰的SW480细胞具有明显的抗肿瘤作用,为大肠癌基因工程肿瘤疫苗的研制提供了实验基础。     

Survivin反义寡核苷酸转染对肝门部胆管癌细胞FRH-0201侵袭性的影响

目的：观察Survivin反义寡核苷酸转染对肝门部胆管癌细胞FRH-0201侵袭能力的影响。方法：针对Survivin基因序列设计合成反义寡核苷酸,阳离子脂质体包裹转染胆管癌细胞株FRH-0201。观察转染后癌细胞生长增殖情况,酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶抑制因子-2（TIMP-2）含量,侵袭小室检测细胞侵袭能力的改变。结果：反义转染组细胞生长及增殖减缓并趋向凋亡,细胞上清液中MMP-2因子较正义转染组及阴性对照组少,且差异有统计学意义（P〈0.05）,TIMP-2因子较另2组有所增加,且差异有统计学意义（P〈0.05）,Transwell实验中反义转染组穿过小室细胞数目较另2组减少（P〈0.05）。结论：Survivin反义寡核苷酸转染可有效抑制肝门部胆管癌细胞增殖,并降低癌细胞的侵袭能力。     

survivin shRNA表达质粒对GBC-SD细胞生长的抑制及对化疗敏感性的影响

目的：构建针对survivin基因的shRNA真核表达载体，观察重组质粒pEGFP-survivin对胆囊癌细胞（GBC-SD）化疗敏感性的影响。
方法：设计、合成包含BbsI酶切位点的针对survivin的shRNA，与BbsI酶切后真核表达载体pEGFP-H1连接，将其定向克隆至H1启动子下，构建成重组载体pEGFP-survivin；采用脂质体法将pEGFP-H1和重组质粒导入GBC-SD细胞中；用G418对转染的细胞进行稳定筛选。用RT-PCR测各组细胞中survivin mRNA的表达；以合适浓度的顺铂（DDP）（3.0 μg/mL）作用相同时间后，用MTT法检测GBC-SD,GBC-SD/EGFP,GBC-SD/survivin 3种细胞存活率，TUNEL法观察细胞调亡。
结果：pEGFP-survivin成功构建。GBC-SD/survivin细胞中的survivin表达水平较其余2种细胞明显下降（分别下降74.7%和71.5%）；经DDP作用后，GBC-SD/survivin细胞存活率较其他2组明显降低，3种细胞均可见棕色凋亡细胞核。
结论：成功构建了针对survivin基因的shRNA真核表达载体，并获得稳定表达survivin shRNA的细胞株GBC-SD/survivin。survivin shRNA能明显降低GBC-SD细胞中survivin的表达，提高其对化疗药物的敏感性。

     

富血小板血浆对大鼠许旺细胞生物学行为的影响

目的 观察不同浓度的富血小板血浆(PRP)对体外培养的许旺细胞(SCs)增殖、分泌功能及迁移的影响,探讨其促进周围神经再生的可能作用机制. 方法 从SD大鼠心脏穿刺取血,利用二次离心法制备PRP,对全血和PRP中血小板计数和血小板源性生长因子BB (PDGF-BB)和转化生长因子(TGF-β1)浓度测定;取3～5d龄的大鼠坐骨神经培养纯化SCs,将P1细胞分为实验组与对照组分别进行处理,实验组以含40.0％、20.0％、10.0％、5.0％和2.5％ PRP的条件培养液干预,并设立空白对照组.于干预不同时间点采用CCK-8法测定SCs增殖活性情况,用实时荧光定量PCR方法检测细胞神经生长因子(NGF)和胶质细胞源神经营养因子(GDNF) mRNA表达的变化,ELISA检测SCs分泌NGF和GDNF的水平,Transwell小室检测各组SCs的迁移能力. 结果 PRP血小板回收率达65％,PDGF-BB和TGF-β1浓度明显高于血清(P＜0.01);与空白对照组相比,低于20 0％浓度的PRP呈浓度依赖性促进SCs增殖和迁移,而40.0％浓度组细胞增殖和迁移受到抑制;SCs分泌的NGF和GDNF和其mRNA表达均较对照组明显增加,同样在低于20.0％浓度的范围内呈现量效关系,40.0％浓度组则显示抑制作用.结论 PRP在适当浓度范围可以促进SCs的分裂增殖,合成分泌NGF和GDNF以及迁移的能力,具有潜在的促周围神经再生的作用.     

基底刚度对成纤维细胞生物学行为的影响

目的 了解基底刚度对Fb增殖、迁移和整合素β1表达的影响. 方法 将Fb接种于刚度为(16.2±0.5)、(19.8±1.1)、(200.1±2.6)kPa的硅胶基底上.进行如下检测.(1)分别连续培养5 d或6d,进行细胞计数、噻唑蓝法检测细胞增殖活性(吸光度值表示).(2)培养3d,检测细胞周期,计算增殖指数(PI).(3)划痕实验后培养0(当日)、1、2、3 d,测定Fb迁移率.(4)培养2 d,流式荧光法检测细胞中整合素β1表达.对部分数据进行单因素方差分析. 结果 (1)细胞计数、噻唑蓝法检测均显示,Fb增殖速度及活性均随着硅胶基底刚度的增强而增加.细胞周期检测显示:在刚度为(16.2±0.5)、(19.8±1.1)(200.1±2.6)kPa的硅胶基底上,细胞的PI分别为24.8％、27.4％、32.4％.(2)培养2d,在刚度分别为(19.8±1)、(200.1±2.6) kPa的硅胶基底表面上,Fb迁移率分别为(91.4±5.1)％(100.0±1.3)％,均明显高于刚度为(16.2±0.5)kPa硅胶基底表面的Fb迁移率[(55.8±6.8)％,F值分别为3.5、4.0,P值均小于0.01].(3)刚度为(16.2±0.5)kPa硅胶基底表面的Fb中整合素β1表达率最低,仅43.2％；刚度为(200.1±2.6)kPa硅胶基底表面的Fb中整合素β1表达率最高(81.3％]. 结论 基底刚度对Fb在创面愈合和瘢痕形成过程中的增殖迁移有较大影响,这一效应与其调控Fb整合素β1表达作用相关.