脱细胞尿道及其海绵体基质制备的实验研究

目的探索脱细胞尿道及其海绵体基质的制备方法.方法取健康壮年兔完整尿道及其海绵体组织,以Triton-X 100与NH3H2O联合提取法进行脱细胞处理.标本做HE染色,组织学观察分析脱细胞效果.结果脱细胞处理11天后,成功获得脱细胞及其海绵体基质,所得基质外观良好.HE染色观察无细胞存在,弹力纤维排列规整,间隙较大,结构无破坏.结论利用Triton-X 100与NH3H2O联合提取法可成功制备完整无细胞尿道及其海绵体基质,为尿道再造修复提供崭新思路.     

脱细胞尿道及其海绵体基质制备的实验研究

目的 探索脱细胞尿道及其海绵体基质的制备方法。方法取健康壮年兔完整尿道及其海绵体组织，以Triton-X100与NH3H2O联合提取法进行脱细胞处理。标本做HE染色，组织学观察分析脱细胞效果。结果脱细胞处理11天后，成功获得脱细胞及其海绵体基质，所得基质外观良好。HE染色观察无细胞存在。弹力纤维排列规整，间隙较大，结构无破坏。结论利用Triton-X100与NH3H2O联合提取法可成功制备完整无细胞尿道及其海绵体基质，为尿道再造修复提供崭新思路。     

人脐动脉平滑肌细胞复合脱细胞基质构建海绵体平滑肌的动物实验研究

目的 探讨脐动脉平滑肌细胞(HUASMC)与阴茎海绵体脱细胞基质(ACCM)复合构建海绵体平滑肌的可行性.方法 以1%的Triton-X100与0.1%NH3H2O混合液对兔阴茎海绵体进行脱细胞处理,制备ACCM.采用贴块法分离、培养、扩增HUASMC.HUASMC以30×10<'6>/ml密度接种ACCM,细胞-ACCM体外复合10 d后将复合物植入9只5周龄BALB/C裸鼠背部皮下,术后10、20和40 d分别对移植物进行HE染色、免疫组织化学染色和器官浴槽实验,评价其裸鼠体内构建情况.结果 ACCM为白色圆柱状,镜下为富含胶原的疏松多孔结构,不含细胞成分.HUA-SMC与ACCM相容性良好,HUASMC在与ACCM接触部位充分伸展,并沿ACCM窦隙活跃生长.9只裸鼠均存活,植入部位无感染,无植入物排斥发生.随培育时间延长,裸鼠体内ACCM逐渐降解,植入的HUASMC分化形成结构良好、交错排列的平滑肌组织.器官浴槽实验显示,构建组织对去氧肾上腺素和电刺激均表现出收缩功能,去氧肾上腺素和电刺激所诱导的最大收缩力分别为(3.64±0.18)和(2.50±0.21)g.结论 HUASMC作为种子细胞与ACCM复合可构建出具有一定形态和功能的组织工程海绵体平滑肌.     

海绵体脱细胞基质和平滑肌细胞相容性的研究

目的探讨海绵体脱细胞基质（ACCM）与人脐动脉平滑肌细胞（HUASMCs）的相容性。方法以1％的Triton-X100与0．1％NH3H2O制备ACCM。异体肌肉内埋植实验评价ACCM的生物相容性。分离培养HUASMCs，噻唑蓝（MTT）法测定ACCM浸提液对HUASMCs增殖的影响。将3—5代的HUASMCs接种ACCM，共培养3、5、10d后观察HUASMCs与ACCM复合情况。结果ACCM无细胞残留，异体肌肉内埋植实验证实ACCM生物相容性良好。浸提液实验显示体外培养第4天和第6天，浸提液组A值明显高于对照组（P〈0．05）。HUASMCs能渗人ACCM内部，并分化形成平滑肌柬。结论ACCM与HUASMCs相容性良好，两者复合有望构建组织工程海绵体平滑肌。     

比较不同处理方法对脱细胞真皮渗透性的影响

目的比较不同处理方法对猪脱细胞真皮渗透性的影响。方法对猪脱细胞真皮分别进行冷冻干燥、机械打孔、戊二醛交联三种处理，比较处理前后孔隙率的变化，并将100出浓度为1&#215;10^6／ml的成纤维细胞悬液分别接种于无处理脱细胞真皮基质（ADM）及经3种处理后ADM上，于1、3、5、7d用MTT法测定其OD值，每组各取接种1周后的复合皮行HE染色观察。结果猪脱细胞真皮的平均孔隙率为65．61％，冷冻干燥后为67．85％。机械打孔后为71．37％，经戊二醛交联后为66．11％。MTT试验的生长曲线图显示，成纤维细胞在打孔后ADM上黏附增殖优于其他组。切片HE染色显示，经打孔处理后，细胞可部分渗透至ADM内，其他组细胞仅在其表面爬行且膜片不完整。结论机械打孔法能提高猪脱细胞真皮的渗透性，可用于组织工程皮肤的构建。     

MSCs与CD34~+单核细胞共培养联合脱细胞支架植入体内构建兔阴茎海绵体

目的研究将异体骨髓间充质干细胞(MSCs)和CD34~+单核细胞(MNCs)共培养体系种植于脱细胞海绵体支架上在兔体内构建阴茎海绵体组织的可行性。方法分别从兔骨髓与兔外周血中提取并鉴定MSCs与CD34~+MNCs,将两种细胞组分以107/mL的密度种植于制备好的兔阴茎海绵体脱细胞胶原支架上,同时将相同密度的MSCs、CD34~+MNCs分别种植于支架上,培养4天后植入一种兔阴茎海绵体缺损模型中。3个月后对工程化组织进行取材,行HE及Masson三色染色等组织学检测。结果 MSCs和CD34~+MNCs共培养组近白膜处的海绵体保留了正常海绵体结构,而MSCs组、CD34+单核细胞组及空白支架组以疤痕增生为主,尽管较之CD34~+单核细胞组及空白支架组,间充质干细胞组疤痕组织中的血管数目较多(P0.05)。结论我们的研究证明了将MSCs和CD34~+MNCs的共培养体系种植于脱细胞支架上植入兔体内可以构建出一段组织学上与原生海绵体相似的组织;CD34~+MNCs在体内主要通过协同MSCs而非单独发挥其促血管化的生物学效应。     

基于心脏全器官脱细胞基质的组织工程支架材料制备与生物学评价北大核心CSCD

目的探讨一种心脏全器官脱细胞方法,并对制备的心脏脱细胞基质支架进行检测与评价。方法通过联合使用胰蛋白酶、Triton X-100等洗涤剂,对成年SD大鼠离体心脏进行主动脉逆行灌流脱细胞处理。对制备的心脏脱细胞基质支架进行大体观察、甲苯胺蓝灌流染色、HE染色、扫描电镜观察、阿利新蓝染色、细胞外基质组分免疫组织化学染色等观察。结果成功制备心脏全器官脱细胞基质支架材料,其保留了原心脏的大体形态;HE染色、甲苯胺蓝染色及扫描电镜观察显示其保留了较好的脉管结构与超微空间构象;阿利新蓝染色及免疫组织化学染色结果显示,其主要的细胞外基质成分,包括Ⅰ型胶原、糖氨聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白保留良好。结论制备的大鼠心脏脱细胞基质支架保留了心脏原有的结构与细胞外基质成分,有望作为全器官心脏体外再造的良好组织工程支架材料。     

海绵体神经在前列腺尖部及远端的行程与分布

目的 观察海绵体神经在前列腺尖部及其远端的行程和分布,探讨海绵体神经与周围 组织的关系.方法 3具成年男性尸体尿道和阴茎标本,自前列腺尖部至阴茎头连续切片行HE染色和神经纤维嗜银染色,观察海绵体神经在前列腺尖部及其远端尿道膜部阴茎的行程与分布.结果 海绵体神经纤维束行于前列腺尖部和尿道膜部约3点到9点处,距离尿道腔约3～5 mm,向远端进入阴茎海绵体近段.自尿道膜部向前走行与海绵体静脉丛并行进入海绵体中隔.结论 海绵体神经在前列腺尖部以及阴茎近段与尿道及海绵体静脉关系密切,该部位尿道和海绵体静脉相关手术容易损伤海绵体神经.     

脐带Wharton胶干细胞外基质的制备及其细胞相容性观察

[目的]建立制备脐带Wharton胶干细胞细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的方法并对其生物相容性进行观察。[方法]无菌条件下收集人脐带组织,采用酶消化法分离培养脐带干细胞,使用普通培养基培养7 d后,在原培养基中添加抗坏血酸,再连续培养8 d;加入含有0.5%Triton X-100和20 mM NH 4OH的PBS溶液进行脱细胞处理后,用Hoechst 33258染色观察其DNA残留,采用扫描电镜对其微结构进行观察,通过天狼星红、甲苯胺蓝、番红花O组织学染色和I型胶原、II型胶原、纤维粘连蛋白及层粘连蛋白免疫荧光染色观察微载体的主要成分;将异体脐带干细胞种植在无细胞核DNA残留的ECM上,通过MTT法观察脐带干细胞的增殖生长情况。[结果]通过本实验方法得到的天然脱细胞脐带干细胞ECM,表面无细胞及DNA残留,整体表面有细胞陷窝形成,基质紧密连接。Hoechst 33258荧光染色阴性;天狼星红、甲苯胺蓝和番红花O组织学染色阳性;I型胶原、II型胶原、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白免疫荧光染色阳性;在MTT检测细胞增殖中,种植于该ECM上的异体脐带干细胞组的OD值高于单纯平面培养组(P<0.05)。[结论]此次实验所得的脱细胞脐带干细胞外基质具有良好的生物相容性,能够为组织工程提供高质量的种子细胞,有望成为组织工程种子细胞的新型培养载体。     

家兔阴茎海绵体平滑肌细胞体外培养方法对比研究

目的　探索更好、更方便的家兔阴茎海绵体平滑肌细胞体外培养方法。方法　分别采用组织块法、酶消化法、组织块 酶消化法对家兔阴茎海绵体平滑肌细胞进行培养 ,在倒置显微镜下对培养过程的细胞分别作了生长情况及形态学观察。用HE染色、MTT法分别描绘原代培养细胞的生长曲线、细胞分裂指数曲线 ;用倒置显微镜观察活细胞的贴壁过程 ,计数法测定细胞贴壁率。结果　组织块法及酶消化法培养的细胞其生长状况和形态学各有自己的特点。组织块法的细胞生长慢 ,培养时间相对较长 ,纯度相对较高 ,原代培养细胞生长速度快 ,但由于该法消化时间不易掌握 ,常影响其成功率 ,多数细胞呈梭形 ,细胞的密度高 ,原代培养时间为 7～ 10d。结论　每种培养方法都有各自的优缺点。我们可根据实验的需要而选择不同的方法或联合培养     

软骨脱细胞基质支架材料的软骨组织工程实验研究

目的应用软骨脱细胞基质作为支架材料，按照组织工程的原理再生软骨，为修复软骨缺损探索新的途径。方法取新西兰大耳白兔1只，体重2．4kg，按改良Courtman法对兔耳软骨行脱细胞处理后用于实验。选用纯种6月龄新西兰大耳白兔18只，雌雄不限，体重2．4～2．6kg。每只耳形成2处1cm&#215;1cm软骨缺损，按修复方式不同随机分为3组，每组24处缺损。A组，软骨脱细胞基质加软骨膜；B组，软骨脱细胞基质；C组软骨膜，作为对照。术后每日观察兔耳修复区的大体变化，并分别于4、12周每组处死3只动物，于修复区切取标本，行HE染色、藏红花红一奥尔新蓝染色、II型胶原基因探针原位杂交实验。结果术后4周内A、B组大体形态无明显改变；术后12周可见修复区轻度增厚，触摸时质地较正常软骨稍硬。C组术后2周，2只2处修复区形成痂皮，术后5周痂皮脱落形成穿孔。术后4周，A、B组HE染色可见软骨脱细胞基质周边有轻度的炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，未形成包囊，藏红花红．奥尔新蓝染色均阴性；C组软骨缺损处的软骨膜塌陷，无细胞增殖现象；各组修复区均未见II型胶原基因探针原位杂交显色。术后12周，A组HE染色示部分软骨脱细胞基质内有新生细胞，细胞排列不规律，ECM嗜碱性增强，藏红花红-奥尔新蓝染色呈阳性，II型胶原基因原位杂交显色示新生细胞内均有大片棕黄色阳性染色区域；B组HE染色示软骨脱细胞基质无吸收现象，周边无包囊，炎性细胞消失，藏红花红一奥尔新蓝染色呈阴性，未见II型胶原基因原位杂交显色；C组HE染色示近软骨断端处可见部分形成新生组织，藏红花红一奥尔新蓝染色呈阳性，II型胶原基因原位杂交显色可见棕黄色阳性染色细胞。结论脱细胞软骨可诱导软骨膜细胞向其中生长而重建软骨，软骨膜和脱细胞软骨复合移植是软骨组织工程的另一种选择。     

应用脱细胞异体真皮植入Bucks筋膜下加大阴茎

目的探讨一种加大阴茎的手术方法。方法将脱细胞异体真皮填充在阴茎Bucks筋膜与白膜之间加大阴茎。结果自2002年3月以来,我们在临床应用12例,术后自然状态下阴茎周径加大13～31cm,平均26cm,术后3个月有正常的性生活。1例因包扎过紧至阴茎皮肤部分坏死,经转移阴囊皮瓣修复愈合。结论该方法用于阴茎加大,创伤小、操作简便、效果确实,无不良反应。     

组织工程舌黏膜构建的研究

目的 探讨舌黏膜细胞的体外培养方法,及其作为种子细胞与同种异体膀胱脱细胞移植物(BAMG)复合构建组织工程化黏膜的方法.方法 分离并获取雄性新西兰大耳白兔舌黏膜细胞进行培养,定期观察细胞形态变化及生长增殖情况.对体外培养的舌黏膜细胞进行广谱角蛋白抗体(AE1/AE3)免疫荧光染色鉴定;流式细胞仪检测第2代培养细胞的AE1/AE3阳性细胞百分比;细胞计数及噻唑蓝(MTT)比色法测定以判断细胞增殖能力.取同种异体兔膀胱经脱细胞处理制成BAMG,随机取小块组织行HE和Masson染色观察脱细胞效果,然后将第2代体外培养的舌黏膜细胞种植于BAMG上,通过HE染色及扫描电镜观察口腔黏膜细胞与BAMG的复合情况.结果 舌黏膜细胞形态均一有较强的增殖能力可传代至4～5代,传至第4代时开始出现老化,细胞贴壁及增殖能力均明显减弱.免疫荧光染色显示近100%体外培养的舌黏膜细胞AE1/AE3免疫荧光染色阳性.流式细胞仪检测结果表明第2代舌黏膜细胞AE1/AE3阳性细胞百分比大于96%.舌黏膜细胞传至第3代时可获得细胞数量在2×107以上.HE和扫描电镜观察均显示舌黏膜细胞和BAMG复合良好.结论 兔舌黏膜细胞可在体外成功培养、扩增;兔舌黏膜细胞与同种异体BAMG复合后生长良好.     

制备去细胞髓核支架最佳条件的初步优化研究

目的探讨机械振荡和去污剂浓度对髓核去细胞支架形态学的影响,建立一种髓核的优化脱细胞方法。方法取成年兔髓核分成A、B、C(含C1/C2/C3子组)、D、E组,并在不同震荡频率下用Triton X-100和脱氧胆酸钠处理。振荡频率分别为0 r/min(A组,n=5)、80 r/min(B组,n=5)、130 r/min(C1、C2、C3组,n1=n2=n3=5)、180r/min(D组,n=5)以及对照组(E组,n=5),其中C组中3个子组(C1/C2/C3)的去污剂的浓度分别为1%、3%、5%,其余组均为3%。对所得标本行HE染色和扫描电镜观察,比较其细胞清除情况和基质形态学变化。结果 A、B及C1组残留大量脱核的髓核细胞胞体,C2、C3及D组细胞被彻底清除。所得支架呈一种无细胞的三维网状结构,但C3和D组纤维结构出现明显破坏。结论合适的机械振荡频率及去污剂浓度在脱去髓核细胞的同时还能较好地保存髓核内天然的基质纤维和三维空间结构。     

Cavernous nerve regeneration using acellular nerve grafts

INTRODUCTION: The restoration of erectile function following complete transection of nerve tissue during surgery remains challenging. Recently, graft procedures using sural nerve grafts during radical prostatectomy have had favorable outcomes, and this has rekindled interest in the applications of neural repair in a urologic setting. Although nerve repair using autologous donor graft is the gold standard of treatment currently, donor nerve availability and the associated donor site morbidity remain a problem. In this study, we investigated whether an "off-the-shelf" acellular nerve graft would serve as a viable substitute. We examined the capacity of acellular nerve scaffolds to facilitate the regeneration of cavernous nerve in a rodent model. MATERIALS AND METHODS: Acellular nerve matrices, processed from donor rat corporal nerves, were interposed across nerve gaps. A total of 80 adult male Sprague-Dawley rats were divided into four groups. A 0.5-cm segment of cavernosal nerve was excised bilaterally in three of the four groups. In the first group, acellular nerve segments were inserted bilaterally at the defect site. The second group underwent autologous genitofemoral nerve grafts at the same site, and the third group had no repair. The fourth group underwent a sham procedure. Serial cavernosal nerve function assessment was performed using electromyography (EMG) at 1 and 3 months following initial surgery. Histological and immunocytochemical analyses were performed to identify the extent of nerve regeneration. RESULTS: Animals implanted with acellular nerve grafts demonstrated a significant recovery in erectile function when compared with the group that received no repair, both at 1 and 3 months. EMG of the acellular nerve grafts demonstrated adequate intracavernosal pressures by 3 months (87.6% of the normal non-injured nerves). Histologically, the retrieved regenerated nerve grafts demonstrated the presence of host cell infiltration within the nerve sheaths. Immunohistochemically, antibodies specific to axons and Schwann cells demonstrated an increase in nerve regeneration across the grafts over time. No organized nerve regeneration was observed when the cavernous nerve was not repaired. CONCLUSION: These findings show that the use of nerve guidance channel systems allow for accelerated and precise cavernosal nerve regeneration. Acellular nerve grafts represent a viable alternative to fresh autologous grafts in a rodent model of erectile dysfunction.     

小鼠骨髓基质干细胞与人耳脱细胞软骨复合培养的研究

目的探讨以小鼠骨髓基质干细胞(MSCs)作为组织工程软骨的种子细胞,在人耳脱细胞软骨支架上生长的可行性.方法将人耳软骨经脱细胞处理,得到脱细胞软骨支架.抽取鼠的骨髓,经离心得到单个核细胞,进行体外分离培养得到MSCs.将鼠的第2代MSCs种植于脱细胞软骨支架上,体外立体培养10天,在光镜及电镜下观察细胞生长及胶原纤维排列情况.结果 MSCs在人耳脱细胞软骨支架上能立体培养成活,细胞分布不均,靠近培养液的一面细胞分布较多,其中大部分细胞进入已脱细胞的软骨陷窝内,每个陷窝内的细胞数为1～2个.结论以鼠MSCs为种子细胞,可在人耳脱细胞软骨支架上良好生长,构建组织工程软骨.     

脱细胞基质与血管内皮细胞体外相容性的研究

目的 将猪血管内皮细胞和异体猪血管脱细胞基质相结合，探讨开发一种制备血管移植物的新方法。方法 分别利用0．1％胰蛋白酶、0．02％乙二胺四乙酸钠(EDTA)和1．0％Triton X—100对猪主动脉作用24小时和176小时进行脱细胞。异体猪血管内皮细胞分离出来并进行体外细胞扩增，再将脱细胞的血管内表面种植上血管内皮细胞。通过光镜和扫描电镜检测脱细胞血管基质是否存在细胞成分和内皮细胞是否生长其上。结果 酶—化学除垢剂的脱细胞方法几乎使细胞完全脱落，且基质纤维的三维结构变得疏松。体外扩增的异体猪血管内皮细胞可以种植在脱细胞基质上并且具有伸展和增殖功能。结论 Triton X—100和胰蛋白酶制备的脱细胞基质与异体猪血管内皮细胞具有良好的生物相容性，能结合到一起并在体外生成血管移植物。     

应用异种脱细胞真皮的眼睑原位重建术的实验研究

目的探讨应用异种(猪)脱细胞真皮施行兔眼睑原位重建术后的组织相容性,比较异种(猪)脱细胞与异体巩膜替代睑板后的组织转归。方法采用兔眼睑缺损动物模型,随机分别给予异种(猪)脱细胞真皮、兔异体巩膜施行眼睑原位重建术。活体观察动物术后和移植物情况,于术后1、2、4、6、8和12周,取带植片的眼睑,光镜下观察替代材料和自体睑板交界处的组织病理学改变,包括炎症反应、纤维血管化情况和融合情况;取4、8和12周标本做透射电镜观察上述组织的超微结构改变。结果光镜和电镜下二者反应类似,差异无统计学意义。组织学检查显示异种脱细胞真皮引起的免疫和炎症反应轻微。结论异种(猪)脱细胞真皮在植入兔眼睑后有较好的组织相容性,并可引导新生胶原的生长,起到替代睑板的作用。     

Evoked cavernous activity.

PURPOSE: Corpus cavernosum electromyography has been widely done to evaluate autonomic dysfunction in patients with erectile dysfunction. We assessed the value of corpus cavernosum electromyography, evoked cavernous activity and penile sympathetic skin responses for their accuracy in determining autonomic involvement in cases of erectile dysfunction. MATERIALS AND METHOD: We evaluated 75 men with erectile dysfunction by corpus cavernosum electromyography, evoked cavernous activity and penile sympathetic skin response tests at our neurourology laboratory. The etiology of dysfunction was vascular, neurogenic, psychogenic or mixed based on a detailed medical and sexual history, physical examination, electrophysiological and laboratory studies, penile color Doppler ultrasonography, and cavernosography and/or cavernosometry. Autonomic involvement was clinically assessed by systemic findings, such as orthostatic hypotension, impaired gastrointestinal motility, sinus dysrhythmia and secretomotor changes. A concentric electromyography needle placed in the right cavernous body was used to record corpus cavernosum electromyography and evoked cavernous activity. The right median nerve was stimulated electrically with 13 to 16 mA. to determine evoked cavernous activity and the penile sympathetic skin response. The latter response was recorded with silver disc electrodes placed on the left cavernous body. All tests were performed using an electromyography/evoked potential machine. We determined the relationships among corpus cavernosum electromyography, evoked cavernous activity and penile sympathetic skin response tests in respect to etiological factors. RESULTS: The 56 patients with normal corpus cavernosum electromyography activity had also evoked cavernous activity and a penile sympathetic skin response except for 1 with no penile sympathetic skin response but evoked cavernous activity. None of these patients had autonomic neuropathy. Of the 19 patients without corpus cavernosum electromyography activity 11 had evoked cavernous activity, including 10 with no autonomic neuropathy. The remaining 8 patients had no evoked cavernous activity, of whom 7 had autonomic neuropathy. A penile sympathetic skin response was recorded in 18 men with absent corpus cavernosum electromyography. CONCLUSIONS: Due to false-negative results on corpus cavernosum electromyography and penile sympathetic skin response testing evoked cavernous activity seems more reliable for determining autonomic involvement in the pathophysiology of erectile dysfunction.