应用聚合酶链反应技术检测微量残留白血病

为早期诊断和检测白血病患儿体内微量残留白血病（MRD），应用聚合酶链反应（PCR）技术及生物素标记克隆特异性探针斑点杂交方法，检测45例初发或复发急性白血病患儿免疫球蛋白重链（IgH）基因重排产生的第3互补决定区（CDR-Ⅲ），并对6例完全缓解患儿进行随访。结果表明，28例B-系急性淋巴细胞白血病（ALL）中25例（89．3％），9例T-系ALL中2例（22．2％）及1例粒-淋双标记白血病检出克隆性CDR-Ⅲ重排片段，7例急性非淋巴细胞白血病（ANLL）未见有意义的扩增带。6例完全缓解中，1例PCR扩增产物电泳后检测为阳性，但斑点杂交6例均显示阳性结果，且彼此间无交叉反应，检测肿瘤细胞的敏感度达10－5。研究提示本方法对早期诊断和监测MRD有重要意义。     

实时定量聚合酶链反应检测微小残留白血病的临床研究

目的 探讨并研究实时定量聚合酶链反应(RQ—PCR)技术定量检测小儿急性淋巴细胞白血病(ALL)微小残留病(MRD)的临床适用性和临床价值。方法 以免疫球蛋白重链(IgH)基因重排作为ALL的肿瘤标志,应用RQ—PCR、胚系探针策略,定量检测了34例B细胞ALL(B—ALL)患儿的MRD,并对其中的16例患儿进行了缓解期MRD的定量动态追踪观察。结果在34例B—ALL患儿的初治标本中IgH基因单克隆重排16例,对16例单克隆IgH重排靶基因进行序列分析发现,V片段使用最频繁的是V3家族,J片段使用最频繁的是J4和J6。在16个靶基因中,RQ—PCR的检测敏感度有9例为10-4,6例为10-5,1例为10-3,非特异性扩增见于6例患儿。16例初治患儿的标准曲线相关系数均为0.99以上,斜率均值为-3.34±0.37,截距均值为24.30±2.95。对16例患儿随访期样本的MRD动态追踪研究发现,复发患儿的MRD水平较高且复发前有动态增加。诱导化疗结束时的MRD水平与ALL高危因素无明显相关性(P>0.05)。结论 研究表明,RQ—PCR技术胚系探针策略检测ALL患儿的MRD具有临床适用性,随访期标本MRD的定量检测及动态追踪监测具有临床价值。     

小儿急性淋巴细胞白血病IgH和Vδ_2Dδ_3基因重排的研究

目的 探讨IgH和Vδ2Dδ3基因重排在初诊儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)中的分布频率及其在中枢神经系统白血病(CNSL)早期诊断与脑脊液(CSF)微量残留病(MRD)监测中的意义。方法 对初诊ALL患者的骨髓标本及不同病期CSF标本采用聚合酶链反应(PCR)检测IgH基因重排和巢式聚合酶链反应(Nested-PCR)检测Vδ2Dδ3基因重排。结果 32份ALL患者骨髓标本中有23份存在克隆特异性IgH基因重排和／或Vδ2Dδ3基因重排。在骨髓标本存在异常基因重排的诱导缓解治疗期患儿的23份CSF中,9份检出Vδ2Dδ3基因重排,4份检出IgH基因重排。而完全缓解期患儿的37份CSF中,3份检出IsH基因重排,7份检出Vδ2Dδ3基因重排。结论 在所检初诊ALL患者的骨髓标本中,IgH重排片段的阳性检出率为47％,Vδ2Dδ3基因的阳性检出率为38％;ALL患者脑脊液中ISH和Vδ2Dδ3基因重排的PCR动态监测较CSF常规、生化及细胞学检测更灵敏,更有助于CNSL的早期诊断,对CNSL的预防及预后的判断有指导意义。     

急性淋巴细胞白血病微小残留病多药耐药基因的表达

目的 探讨急性淋巴细胞白血病（简称急淋，ALL）微小残留病（MRD）与肿瘤多药耐药基因mdrl-mRNA表达的关系。方法 选择本院住院及门诊的ALL患儿33例，采集初治前及完全缓解（CR）后不同时期的骨髓标本2ml，提取DNA及RNA。用聚合酶链反应（PCR）法扩增T细胞受体γ链（TCRγ）单克隆性基因重排，以确定MRD的存在；同时采用反转录聚合酶链反应（RT－PCR）方法对同一份标本进行mdrl-mRNA表达的检测，将具有阳性特异性条带的电泳胶片用GQS－960图像处理系统软件进行定量分析，计算mdrl与β2－MG的比值，以mdrl/β2－MG比值≥0．3定为阳性表达。CR后按时进行强化治疗，每隔3－6个月对MRD DNA及mdrl-mRNA作动态观察。结果 （1）33例ALL患儿初诊时TCRγ单克隆性基因重排阳性率为82％（27／33），完全缓解（CR）率为91％（30／33），CR时MRD阳性率为80％（24／30）。（2）随访观察6－18个月MRD阳性率呈逐渐下降趋势，而mdrl-mRNA阳性表达率呈逐渐上升趋势。（3）根据随访结果，将处于CR期的28例患儿分为4个组：MRD及mdrl均阳性组（1组）7例ALL患儿有6例复发；MRD及mdrl均阴性组（4组）ALL复发数为0；MRD阳性而mdrl阴性组（2组），8例中有2例复发；MRD阴性而mdrl阳性组（3组）4例中有1例复发。1组与4组比较，P＜0．05，其他各组间比较差异均无显著意义。结论 （1）ALL完全缓解后随着CR时间延长及按时进行强化治疗，MRD阳性率逐渐下降，而mdrl阳性率却呈上升趋势，两者呈负相关；（2）MRD与mdr1均阳性者ALL复发率高，提示预后差；而MRD与mdr1均阴性者复发率低，预后较好；（3）CR期按时进行MRD及mdr1的监测，可为临床化疗方案个体化提供依据，有利于微小残留白血病细胞（MRLC）的彻底清除。     

MRD监测对儿童B系急性淋巴细胞性白血病疗效评估的意义

目的：研究监测微小残留白血病(MRD)在B系急性淋巴细胞白血病（ALL）患儿治疗中的作用。方法：回顾性研究了2001年9月1日至2005年4月31日,采用ALL-XH-99方案治疗的B系ALL患儿中进行MRD监测的患儿共124例。用四色多参数流式细胞仪监测ALL患儿治疗过程中不同时间点的MRD。结果：在124例进行过MRD监测的B系ALL患儿中,其中MRD<0.01%、0.01%~0.1%和>0.1%的分别有103例、13例和8例,其5年无复发生存率（RFS）分别为（88.9±3.9）%、（70.0±14.5）%和0%,而5年无事生存率（EFS）分别为（82.4±4.4）%、（21.2±18.0）%和0%,两者均P<0.01;将首次CR后半年内MRD检查分成阴性（<0.01％）和阳性两组,其5年RFS分别为（87.7±4.1）%和（58.3±14.2）%,（P<0.01）;5年EFS分别为（80.7±4.6）%和（25.6±13.8）%（P<0.01）;首次CR后半年以后MRD检查阴性和阳性两组的5年RFS分别为（92.0±3.6）%和（48.5±15.5）%（P<0.01）。多因素分析显示结果显示诱导缓解后MRD、泼尼松诱导窗口反应、第19天骨髓象是否达M-1级骨髓象和是否检出BCR-ABL或MLL-AF4融合基因对患儿治疗过程中是否发生复发有预后价值（P<0．05)。结论： 在B系ALL患儿治疗过程中,无论在诱导缓解达到CR时,还是在随后的治疗过程中,监测MRD水平对于评估ALL患儿疗效有重要意义。     

以免疫球蛋白和T细胞受体基因重排为标志定量检测MLL基因重排儿童急性淋巴细胞白血病的微小残留病和预后关系

目的 探讨MLL基因重排儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）微小残留病（MRD）与临床特征的关系及其对预后的指导作用。方法 以2003年4月至2009年12月首都医科大学附属北京儿童医院血液肿瘤中心收治的MLL基因重排的ALL患儿为研究对象。以免疫球蛋白和T细胞受体基因重排、MLL融合转录本为标志,定量PCR方法监测MRD水平。以诱导治疗结束时MRD水平≥10-4为MRD阳性组,<10-4为MRD阴性组。卡方检验和Kaplan-Meier生存分析分别比较MRD阳性和阴性组临床特征和无事件生存率（EFS）的差异。结果 14例ALL患儿在诱导治疗结束时检测了MRD水平,MRD阳性组患儿初诊时外周血WBC计数显著高于MRD阴性组,对泼尼松实验治疗反应显著低于MRD阴性组。MRD阴性组5年EFS显著优于MRD阳性组,100% vs （37.5±17.1）%,P=0.022。结论 诱导治疗结束时MRD水平有助于对MLL基因重排儿童ALL进行预后分组,指导个体化治疗、改善预后。     

应用PCR和斑点杂交试验检测急性淋巴细胞白血病微小残留病

应用PCR和斑点杂交试验检测35例儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)IgH和TcRr基因重排,并对9例完全缓解期患儿进行了微小残留病(MRD)动态监测,结果表明:双基因标记检查较单一基因检测MRD更具优越性,可降低假阴性率,有利于临床预知疾病复发。     

应用半重叠TCR γ特异性引物的PCR方法检测淋巴细胞白血病

采用更加敏感的半重叠式TCRγ特异性引物的PCR方法，对28例ALL初治、CR及BMT患儿进行检测，并用消化煮沸及酚抽提法分别对所有骨髓标本进行DNA提取，将PCR结果进行比较。结果表明：消化煮沸法用于微量标本的DNA提取优于酚抽提法，28例ALL患儿中16例检出TCRγ特异性条带，MRD组18例，阳性检出12例，其中免疫分型标记为B细胞型的4例，占25％，免疫标记为T细胞型者全部出现TCRγ阳性条带。并对该引物的语系特异性及双克隆重排问题进行了理论探讨。     

利用骨髓涂片检测白血病微小残留病

以抗原受体基因重排为标志，通过多聚酶链反应（PCR）检测急性淋巴细胞白血病（ALL）微小残留病（MRD），近年来在国内外已较广泛地开展起来。但以往的检测方法多是从新鲜骨髓液或外周血液中提取细胞DNA模板，用于PCR扩增，不仅取材不便，标本的保存、送检有困难，DNA抽提方法也较繁锁。我们最近从骨髓涂片中提取DNA，通过PCR检测MRD，取得较好效果，现报告如下。骨髓涂片中DNA的提取方法一、主要度剂和仪器从骨髓涂片中提取DNA所需试剂少，仪器简单，主要有：NIDPK缓冲液（50mMKCl；10mMTris-Cl，pH8．3；2．5mMgCl2；0…     

RQ-PCR检测Ig/TCR基因重排监测急性淋巴细胞白血病患儿治疗过程微小残留白血病

目的 研究RQ-PCR检测急性淋巴细胞白血病（ALL）患儿Ig/TCR基因重排在微小残留白血病（MRD）监测中的作用。方法 以2009年3月至2011年3月在广州市妇女儿童医疗中心血液肿瘤科确诊和治疗的ALL患儿为研究对象,PCR检测初诊ALL患儿的Ig/TCR基因重排;基因扫描分析初诊患儿Ig/TCR基因重排的克隆特性;对ALL患儿的单克隆性Ig/TCR基因重排进行测序,RQ-PCR检测不同治疗阶段Ig/TCR基因重排的表达量。结果 86例ALL患儿进入分析,男52例,女34例;年龄1~13（4.3±3.0）岁,随访时间1~26（14.3±7.0）个月。①83例（96.5%）检出1种或以上Ig/TCR基因重排,共检出209个Ig/TCR基因重排;②91.8%（56/61例）检出1种或以上单克隆性Ig/TCR基因重排;61例172个Ig/TCR基因重排中,单克隆性、寡克隆性和多克隆性Ig/TCR基因重排的检出率分别为58.1%（100个）、30.8%（52个）和11.0%（19个）,差异有统计学意义（P=0.000）;③26例完成连续3次随访,其中22例持续完全缓解患儿的Ig/TCR基因重排平均相对表达量持续下降,在维持治疗前均为MRD阴性（≤1.0×10-4）;4例复发患儿在诱导缓解治疗后至复发前各检测时点Ig/TCR基因重排表达量均＞1.0×10-4,并在复发前已有回升,从开始回升至临床复发的平均时间为3.75（2～8）个月。结论 Ig/TCR基因重排相对表达量可反映MRD水平,可作为判断预后、监测复发和指导治疗的有效手段。     

儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病与复发的相关分析

目的 分析小儿急性淋巴细胞白血病(急淋)缓解时和缓解不同时期微小残留病(MRD)的水平与复发的相关性。方法：用极限稀释定量PCR法和巢式PCR法追踪检测MRD，数据处理用Kaplan Meier方法及COX回归模型等。结果：46例急淋患儿缓解时MRD值与骨髓复发呈正相关(r=0.4396，P<0.01)，骨髓复发组MRD值为7.359×10-3，与未复发组MRD值(3.954×10-4)差异有显著性(P<0.01)；缓解期MRD持续阳性或由阴性转为阳性者，骨髓复发的相对危险度明显增高(P<0.05)。结论：缓解时MRD水平及缓解期MRD定性结果可作为估计急淋预后的一个重要指标，动态追踪检测MRD是指导治疗和预防复发的有效手段。     

儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病的检测及其临床意义

尽管目前儿童急性淋巴细胞白血病诱导缓解率已明显提高,但仍有部分患儿完全缓解后复发.微小残留病(MRD)的存在是导致其复发的主要原因.研究表明MRD的有无及其高低不但反映了个体对治疗的反应情况,还能用于临床危险度分型及移植后复发风险的评估.该文对MRD的检测方法及临床意义作一综述.     

微小残留病阳性儿童B系急性淋巴细胞白血病的追踪分析

目的探讨儿童B系急性淋巴细胞白血病(B-ALL)患儿骨髓微小残留病(MRD)及检测,预测预后的可能性。方法应用四色荧光抗体标记法通过流式细胞仪检测儿童B-ALL的MRD。对41例MRD阳性患儿加强化疗强度,多次连续监测,进行追踪分析。结果41例MRD阳性患儿中复发6例,复发患儿的MRD均>0.1%,MRD出现阳性的时间均>3个月,临床分型都属高危型。MRD阳性患儿经1个疗程强烈化疗转阴27例,其中1例复发,其他均在随访中,中位随访时间24.8个月;MRD阳性2个疗程转阴14例,复发5例,缓解患儿中位随访时间22.8个月。结论MRD对B-ALL预后监测有重要意义,MRD阳性时间越长对预后越不利,加强对MRD阳性患儿的治疗对改善预后有积极作用。     

树突状细胞与儿童急性淋巴细胞白血病免疫治疗进展

儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)由于体内微小残留病(MRD)的存在常导致复发.树突状细胞(DC)能呈递肿瘤抗原,刺激机体免疫系统而发挥抗肿瘤作用,所以利用DC的免疫治疗方法清除患儿体内的MRD就成为研究的热点.该文就DC的特性、ALL患儿与DC相关的免疫逃逸机制以及DC在ALL免疫治疗中的应用作一综述.     

Bone marrow minimal disseminated disease (MDD) and minimal residual disease (MRD) in childhood T‐cell lymphoblastic lymphoma stage III,detected by flow cytometry (FC) and real‐time quantitative polymerase chain reaction (RQ‐PCR)

Background

Despite overlapping features of T‐cell lymphoblastic lymphoma (T‐LLy) and T‐cell acute lymphoblastic leukemia (T‐ALL), which respond favorably to T‐ALL treatment, clinical and biological differences exist. We retrospectively assessed the prevalence of submicroscopic bone marrow (BM) minimal disseminated disease (MDD) at diagnosis and the early response to treatment (minimal residual disease—MRD) and their prognostic significance in 17 children with stage III T‐LLy treated according to Berlin‐Frankfurt‐Munster (BFM) non‐Hodgkin lymphoma protocols.

Procedure

Four‐color flow cytometry (FC) was used for lymphoma associated immunophenotype and real‐time quantitative polymerase chain reaction (RQ‐PCR) for T‐cell receptor (TCR β/δ/γ) gene rearrangements with at least 0.01% sensitivity.

Results

Two markers per patient were identified in all cases using FC and in 80% using RQ‐PCR. BM MDD at diagnosis of ≥0.01% was detected by FC and RQ‐PCR in 88% and 80% of patients, respectively, and by at least one of the methods in all patients. A significant correlation was achieved between the methods by Pearson correlation analysis (P = 0.004). MRD levels significantly decreased to very low levels on day 33 in 9 out of 10 patients studied. The only patient that remained positive relapsed.

Conclusions

MDD was prevalent in stage III T‐LLy, for which we could not prove a prognostic significance in the context of ALL‐like treatment. This study shows that both FC and RQ‐PCR methods are efficient for MDD and MRD analyses in T‐LLy. Pediatr Blood Cancer 2009;52:20–25. © 2008 Wiley‐Liss, Inc.     

儿童B系急性淋巴细胞性白血病微小残留病的相关因素及预后分析

目的：了解检测儿童B系急性淋巴细胞性白血病(ALL)微小残留病(MRD)在临床上的意义,探讨其相关因素及预后的关系。方法：用一种胞浆与胞膜、特异与敏感的标志相结合,CD45/SSC双参数图设门的三色流式细胞术(FCM)对67例儿童B系ALL在诱导治疗结束时(诱导第28～37d)进行MRD监测。结果：67例随访病人低危组为18例,中危组为35例,高危组为14例,MRD在3组之间差异有显著性(P<0.005),高危组的MRD(+)率明显较低、中危组高(P<0.005)。MRD与起病时的性别、年龄、白细胞数之间无相关性(P>0.05)。MRD在早期治疗反应上也无明显的统计学差异(P>0.05)。而MRD与复发及中位无事生存期密切相关,MRD(+)组复发率明显较MRD()组高(P<0.05),MRD(+)组中位无事生存期也短于MRD()组(P<0.005)。结论：检测MRD有助于了解疗效以及初步判断其预后以便调整治疗策略,是目前随访儿童ALL的有效方法。     

急性B淋巴细胞白血病患儿微小残留病流式细胞术检测的临床意义

目的研究使用流式细胞术检测小儿急性B淋巴细胞白血病(acutelymphoblasticleukemia,ALL)微小残留病(minimalresidualdisease,MRD)的临床预后价值。方法能将残留白血病细胞与正常骨髓细胞区分开来的抗体组合称为有效抗体组合。我们使用流式细胞术对36例具有有效抗体组合的BALL患儿缓解后的骨髓标本进行MRD的定期检测。对6例无有效抗体组合的患儿,我们使用CD45/CD19/CD34/CD10与CD45/CD19/CD20/CD22两个抗体组合定期检测骨髓标本。结果(1)在42例患儿中有36例(86%)具有有效抗体组合;(2)在治疗6个月时间点时,MRD水平≥10-4的患儿(13例)无病生存率(diseasefreesurvival,DFS)与MRD水平<10-4的患儿(12例)相比无统计学意义(P=0.62);在治疗9个月时,MRD水平≥10-4的患儿(10例)要比MRD水平<10-4的患儿(13例)生存率低(P=0.025);在治疗12个月时,MRD水平≥10-4的患儿(8例)要比MRD水平<10-4的患儿(9例)生存率低(P=0.042);(3)共有7例患儿复发,其中6例复发患儿在复发前的4～10个月均检测到≥10-3水平的MRD。在随访过程中至少有1次MRD水平≥10-3患儿的无病生存率较MRD水平在10-3以下的患儿为低(P=0.003);(4)5例复发患儿的免疫表型基本未发生变化,只有1例丢失了CD13抗原;(5)在6例无有效抗体组合患儿中未发现有意义的MRD。结论(1)MRD水平在10-3或以上的患儿预后较差;(2)治疗9个月与12个月时间点的MRD水平有预后价值;(3)对于无有效抗体组合的患儿,CD45/CD19/CD34/CD10与CD45/CD19/CD20/CD22抗体组合的效果应进一步评估。     

Detectable minimal residual disease before allogeneic hematopoietic stem cell transplantation predicts extremely poor prognosis in children with acute lymphoblastic leukemia

BACKGROUND: The level of minimal residual disease (MRD) prior to allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) has been shown to be an independent prognostic factor for outcome of pediatric patients with high-risk acute lymphoblastic leukemia (ALL). Retrospective studies which used (semi-) quantitation of clone-specific immunoglobulin/T-cell receptor (Ig/TCR) rearrangements have documented the feasibility and practicality of this technique. This approach has also been disputed due to the occurrence of clonal evolution and generally high MRD levels prior to HSCT. PROCEDURE: In our prospective study, MRD before and after HSCT was monitored using quantitative real-time PCR in a cohort of 36 children with ALL consecutively transplanted in our center between VIII/2000 and VII/2004. RESULTS: In 25 of 36 patients, MRD level prior HSCT was assessed. Seventeen patients were classified as MRD-negative and eight were MRD-positive up to 9 x 10(-2). In MRD-positive subgroup, seven events (six relapses) occurred post-transplant in striking contrast to only one relapse in MRD-negative subgroup (event-free survival (EFS) log-rank P < 0.0001). MRD proved to be the only significant prognostic factor in a multivariate analysis (P < 0.0001). Adoptive immunotherapy including donor lymphocyte infusions in patients with adverse dynamics of MRD after HSCT had only limited and/or temporary effect. Clonal evolution did not present a problem precluding MRD monitoring in any of patients suffering a post-transplant relapse. CONCLUSIONS: We show that MRD quantitation using clonal Ig/TCR rearrangements successfully assesses the risk in pediatric ALL patients undergoing allogeneic HSCT. As our ability to treat detectable MRD levels after HSCT is very limited, alternative strategies for MRD-positive patients prior HSCT are necessary.