钙耐受大鼠心肌细胞分离方法研究

目的:探讨钙耐受大鼠心肌细胞的快速、高效分离方法。方法:采用自行改进的Langendorff心脏灌流装置,逆行主动脉恒流灌注获得单个耐钙心肌细胞,KB液温育后以全细胞膜片钳方式记录离子流。结果:分离所得70%存活心肌细胞有80%为钙耐受心肌细胞,可记录到典型的瞬时外向钾电流。结论:根据灌注压力变化掌握消化时间,控制好细胞分离过程的各种因素,能够获得大量具有正常电生理特性的钙耐受心肌细胞。     

单个跳动的成年哺乳动物心肌细胞的分离

近年来许多实验室发展了一种新的实验模型,从成年哺乳动物,大鼠,兔,狗等心室分离出能自发跳动的单个细胞。这样的模型用来研究细胞的生化调节机制和对药物的反应特别适宜,它与组织匀浆相比保持较完整的细胞结构,与组织薄片相比具有较纯的细胞群,不受神经和激素的影响。而从成年动物心室所分得细胞之间较培养的胚胎细胞之间具有更大的相似性,更适宜于生化、药理等的研究。因此受到     

大鼠心肌细胞分离方法的改进

目的介绍一种易于判断酶解终点的分离大鼠心肌细胞的方法。方法成年SD大鼠麻醉后开胸取出心脏,分别采用传统的Langendorff灌流装置和本实验室改进的Langen-dorff灌流装置,于恒温37℃灌流消化液(含0.6%胶原酶B,0.6%BSA,30μmol.L-1Ca2+的台氏液)分离细胞,并采用IonOptix单细胞动缘检测系统检测细胞功能。结果传统的Langendorff灌流装置分离细胞,酶解时间约13～16min,但此法终点难以判断,每次分离的细胞质量差别较大,且不耐钙,收缩的稳定性较差。而以改进的Langendorff灌流装置分离细胞易于确定消化终点,细胞成活率大于80%,在含1.8mmol.L-1Ca2+的台氏液中存活率也高达50%。给予电压15V、频率1Hz、波宽4ms的持续电刺激时,其在1000s内收缩舒张功能稳定。结论经改造的Langendorff灌流装置分离的心肌细胞成活率高,可控性强,结果稳定,能够更好地用于检测细胞收缩舒张功能的实验。     

心肌细胞钙火花

心肌细胞钙火花是肌浆网上一个或几个成簇状分布的RyR所产生的局部钙释放,可通过单个L 型钙通道开放所触发或自发发放。钙火花呈随机发放,出现在Z线附近,其动力学特征受多种因素的调节。此外,T 型钙电流、Na+ /Ca2+交换、ICa(TTX)和IP3 等也是钙火花触发的来源。     

心肌细胞中的钙平衡

当Tyrode溶液中含有0.6mM Ca~(2+)时,1.5～2.0×10~(-7)M的哇巴因与提高细胞外钙至1.2mM,都能引起豚鼠心房产生相同的肌力反应。这提示胞液(Cytosol)内的钙离子浓度相同。但是,提高细胞外钙可使组织总钙含量增强,而用强心甙后则组织总钙不变。因为推测在这两种情况下胞液内的钙量相等,所以仅与胞液钙发生平衡的深部房室(Deep compartment)应含有等量的结合钙。而在1.2mMCa~(2+)中预处理的豚     

成年大鼠心肌细胞高效激光共聚焦显微镜钙成像方法

目的建立高效易行的测定心肌细胞钙成像方法。方法Langendorff灌流获取成年大鼠心室肌细胞。大鼠心肌细胞经Fluo-4染色后分别加入玻璃底的6孔培养板中,连接Ion C-Pace EP刺激器,于激光共聚焦显微镜下测定胞内钙离子浓度的动态变化。结果约80％的细胞跟随所设频率规律的收缩。激光共聚焦显微镜记录到与刺激器频率相同的有规则的细胞钙瞬变。加入咖啡因后钙释放增加,提示此为钙库的钙释放。结论利用新型的刺激装置,结合激光共聚焦显微技术,我们成功地获得了高效易行的成年大鼠心肌细胞Ca^＋成像方法。此法也可用于其他实验动物心肌细胞,易于记录细胞内钙离子浓度的动态变化。     

实用简便的心肌细胞分离技术

针对大鼠心肌细胞的分离及培养进行探讨，从中摸索出一套比较实用的单个心肌细胞分离培养的方法，以满足有关心肌组织功能检测及相关研究的需要。     

丹参酮Ⅱ-A抑制豚鼠单个心肌细胞L型钙电流和缩短动作电位时程效应的相关性分析

目的旨在探讨药物阻断L型钙电流与其缩短心肌细胞动作电位时程（APD）效应之间的相互关系。方法采用膜片钳全细胞式记录方法，同时观察了丹参酮Ⅱ-A（DST）对豚鼠同一个心室肌细胞跨膜电位和L型钙电流的影响，并对药物的有关效应作相关分析。结果DST显著缩短豚鼠心肌单细胞的动作电位时程（APD），呈剂量依赖关系（r=-0.987）;10、20、和40μmol·L-1DST可使L型钙内向峰电流分别减少35.2％、57.7％和74.7％，亦呈浓度依赖方式（r=-0.948）。经相关性分析证实，在本实验采用的DST相应浓度作用下，APDS50、APD90和APD50～10的缩短与L型钙电流峰值的减少之间呈高度正相关（r分别为0.9870、0.9867和0.9896）。结论DST缩短心肌细胞APD和阻断L型钙电流的效应是高度一致的，且以APD50～10表示平台期的长短更合理。     

雌激素对大鼠心肌细胞钙的调控作用研究

目的　观察雌激素对大鼠心肌细胞钙转运的调控作用。方法　应用膜片钳全细胞记录方法观察L型钙通道电流 (ICa .L) ,共聚焦显微镜系统分析细胞内钙浓度 ([Ca2 + ]i)的变化。结果　应用 10 μmol·L-1和 30 μmol·L-1的 17β Estradiol,分别使ICa .L 抑制到正常的 48 1%± 4 5 %and2 9 3%± 5 2 % (n =5 ,P <0 0 1)。 10 μmol·L-1的 17β Estradiol可升高静息的培养心肌细胞 [Ca2 + ]i,荧光强度 (FI)值由 5 4 2± 13 6增加到 86 5± 15 3(n =6 ,P <0 0 5 ) ;而对具有自发收缩的心肌细胞钙瞬变幅度有明显的抑制作用 ,由给药前的 18 5± 4 3减小到 11 4± 3 9(n =6 ,P <0 0 5 )。17β Estradiol可剂量依赖性地抑制ICa.L。结论　L型钙通道等多种机制参与雌激素对大鼠心肌细胞钙转运的调控作用。     

变形链球菌耐氟株体外诱导分离方法的研究

目的：对分离变形链球菌耐氟株的逐步诱导法和直接诱导法进行研究。方法：采用逐步诱导法和直接诱导法分别获得变形链球菌耐氟株，对各耐氟菌株的生物学特性进行比较。结果：在体外应用两种方法成功分离稳定传代的变形链球菌耐氟株；且所得耐氟菌株的形态、培养特性及生化反应都是相同的，传代时间和最大耐氟水平差别无统计学意义。结论：逐步诱导法和直接诱导法均可用于诱导变形链球菌耐氟株。     

左旋氨氯地平对缺氧心肌细胞钙信号系统的影响

目的:观察缺氧对心肌细胞内游离钙离子浓度和细胞膜及肌浆网上钙离子泵,即Ca2+ AT Pase表达的影响及左旋氨氯地平的干预作用。方法:制备大鼠心肌细胞缺氧模型,随机分为正常对照组、缺氧损伤组和左旋氨氯地平组。测定心肌细胞内游离钙离子的浓度(FURA2 /AM荧光探针法)、细胞膜上Ca2+ ATPase表达水平(RT PCR法)以及肌浆网上钙泵(SERCA2 )含量(WesternBlot法)。结果:缺氧损伤组心肌细胞内游离钙离子浓度[ (716±s164)nmol·L-1 ]较正常对照组[ (208±32)nmol·L-1 ]显著上升(P<0. 01 ),细胞膜及肌浆网上钙泵的表达(0. 54±0. 12和158±15)较正常对照组( 0. 86±0. 07和210±12 )均明显降低(均P<0. 01),经左旋氨氯地平干预后细胞内游离钙浓度降低至(359±75 )nmol·L-1,P<0. 01,细胞膜上及肌浆网上钙泵的表达(0. 81±0. 11和184±11)均明显增强(均P<0. 01)。结论:左旋氨氯地平可能通过增加细胞膜及肌浆网上钙泵的表达有效减轻心肌细胞内的钙超载,对缺氧心肌具有保护作用。     

老龄小鼠心肌细胞钙激活钾通道特征

心肌细胞的钾通道对维持膜的稳定性,调控机-电偶合,舒张收缩等生理功能起重要作用[1,2]。ＳａｄａＴ等[3,4]报道自发高血压大鼠(ＳＨＲ)收缩压随年龄增加而升高,其升高幅度明显高于同龄对照(ＷＫＹ)大鼠,ＳＨＲ血管平滑肌胞内钙浓度[Ｃａ2 ]ｉ也随年龄增加而升高,但ＷＫＹ随年龄增大无明显改变。离子通道对[Ｃａ2 ]ｉ调节起十分重要作用。本文报导随年龄增加小鼠心肌ＩＫＣａ电导增大致使膜的稳定性降低。这是心脏致病的重要因素之一。内向整流钾通道ＩＫｉ对维持静息电位起重要作用。如果ＩＫｉ不随年龄相应增大,则对静息电位的调控作用也…     

哇巴因对心肌细胞钙瞬变及收缩力的作用

目的检测哇巴因对正常大鼠和阿霉素所致心衰大鼠左心室肌细胞的收缩力、钙瞬变和舒张期钙影响。方法腹腔注射阿霉素制备大鼠心衰模型,以改良的Langendorff装置分离心肌细胞,负载Fluo-4钙荧光染料后采用IonOptix可视化细胞动缘探测系统检测哇巴因对大鼠心肌细胞收缩功能、舒张期钙及钙瞬变的变化。结果哇巴因可浓度依赖性增加正常大鼠心肌细胞收缩力和钙瞬变,3×10-7 mol·L-1哇巴因即明显增加收缩力和钙瞬变,但对心衰大鼠心肌细胞,1×10-5 mol·L-1哇巴因才明显增加心肌细胞收缩力和钙瞬变;哇巴因也可增加正常大鼠和心衰大鼠心肌细胞舒张期钙。结论哇巴因能够增加心肌细胞收缩力、钙瞬变和舒张期钙,阿霉素所致心衰大鼠心肌细胞较正常细胞不敏感。     

L-型钙通道阻滞剂对心肌细胞钙稳态的影响

目的:观察L-型钙通道阻滞对心肌细胞的影响.方法:取SD大鼠颈部脱臼处死后浸人75%乙醇数秒,迅速开胸摘取心脏,置人盛有37℃预热的台氏液100ml的培养皿中.在超净工作台上用台式液清洗并修剪掉结缔组织,迅速行主动脉插管.将心脏悬挂于Langendroff灌流装置上,剪下心室并剪成约1mm3,的组织块,放人37℃预热的含0.2mmol/L Ca2+台氏液20ml的培养皿中,将心室在溶液中轻轻晃动以分散已解离的心室肌细胞.新分离的细胞在常温下放置1-2h后,用加样器取带少许细胞的原液放人试管中,加人指示剂,给予正常细胞外液灌流,测全细胞胞内钙瞬变作为前对照组;给予硝苯地平溶液灌流,测全细胞胞内钙瞬变作为实验组;给予正常细胞外液灌流,测全细胞胞内钙瞬变作为后对照组.结果:不同浓度的硝苯地平对静息状态下心室肌细胞胞内钙信号的影响都不明显,仅10umol/L硝苯地平可能使静息状态下心室肌细胞胞内钙水平轻微降低,更高浓度的硝苯地平的效果反而减弱.不同浓度的硝苯地平都能不同程度降低心室肌细胞胞内钙瞬变的峰值(P<0.05),5umol/L硝苯地平的标准化值最低,降低心室肌细胞胞内钙瞬变峰值的效果比2umol/L硝苯地平明显(P<0.05).但是10umol/L硝苯地平、50umol/L的硝苯地平的降低心室肌细胞胞内钙瞬变峰值的效果反而减弱.结论:硝苯地平可以抑制大鼠心室肌细胞的电流.但是,硝苯地平对于静息状态下的心室肌细胞胞内钙信号的影响不明显,可能与硝苯地平只对去极化过程的I(Ca)2+、Ito和Ik有抑制作用有关.     

L-型钙通道阻滞剂对心肌细胞钙稳态的影响

目的观察L-型钙通道阻滞对心肌细胞的影响。方法取SD大鼠颈部脱臼处死后浸入75%乙醇数秒,迅速开胸摘取心脏,置入盛有37℃预热的台氏液100ml的培养皿中。在超净工作台上用台式液清洗并修剪掉结缔组织,迅速行主动脉插管。将心脏悬挂于Langendroff灌流装置上,剪下心室并剪成约1mm3的组织块,放入37℃预热的含0.2mmol/L Ca2＋台氏液20ml的培养皿中,将心室在溶液中轻轻晃动以分散已解离的心室肌细胞。新分离的细胞在常温下放置1～2h后,用加样器取带少许细胞的原液放入试管中,加入指示剂,给予正常细胞外液灌流,测全细胞胞内钙瞬变作为前对照组;给予硝苯地平溶液灌流,测全细胞胞内钙瞬变作为实验组;给予正常细胞外液灌流,测全细胞胞内钙瞬变作为后对照组。结果不同浓度的硝苯地平对静息状态下心室肌细胞胞内钙信号的影响都不明显,仅10μmol/L硝苯地平可能使静息状态下心室肌细胞胞内钙水平轻微降低,更高浓度的硝苯地平的效果反而减弱。不同浓度的硝苯地平都能不同程度降低心室肌细胞胞内钙瞬变的峰值（P〈0.05）,5μmol/L硝苯地平的标准化值最低,降低心室肌细胞胞内钙瞬变峰值的效果比2μmol/L硝苯地平明显（P〈0.05）。但是10μmol/L硝苯地平、50μmol/L的硝苯地平的降低心室肌细胞胞内钙瞬变峰值的效果反而减弱。结论硝苯地平可以抑制大鼠心室肌细胞的电流。但是,硝苯地平对于静息状态下的心室肌细胞胞内钙信号的影响不明显,可能与硝苯地平只对去极化过程的ICa2＋、Ito和IK有抑制作用有关。     

小鼠外周血单个核细胞分离、纯化

目的:探讨小鼠外周血单个核细胞(PBMC)最佳分离条件,提高细胞获得率与纯度,以便后续分子生物学实验。方法:小鼠摘除眼球取血,设置离心力、离心时间、实验环境温度等梯度优化,分别采用EDTA-K2、肝素、枸橼酸钠抗凝,Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞,直接进行贴壁培养和分析获得率、纯度,计数存活率。结果:Ficoll密度梯度离心法经条件优化后分离的PBMC纯度可达85%,细胞获得率最高可达80%以上,活细胞百分率在92%以上。结论:Ficoll密度梯度离心法在优化条件下可有效地分离PBMC,对后续分子生物学实验无影响。     

家兔心衰心肌细胞钙渗漏与钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ表达的关系

目的探讨家兔心衰心肌细胞钙渗漏与蛋白激酶A(PKA)和Ca2+/钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(CaMKⅡ)表达和活性的关系。方法 30只家兔随机均分为假手术组和心衰组。通过超容量负荷联合压力负荷制备家兔心衰模型,用心脏多谱勒和心导管术测定家兔心脏功能,应用钙成像系统进行肌浆网钙回摄和钙渗漏试验。采用Western blot法和γ-32P掺入法测定CaMKⅡ和PKA的蛋白表达水平和活性;应用ELISA法测定血浆去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)和脑钠肽(BNP)水平。结果与假手术组相比,心衰组家兔左室舒张末压、血浆NE、E和BNP水平均明显增加(P<0.01),而射血分数明显降低(P<0.01),肌浆网钙回摄功能下降(P<0.05),而钙渗漏增加(P<0.01),PKA的蛋白表达水平和活性均下降(P<0.05),而CaMKⅡ蛋白表达水平和活性均增加(P<0.05)。结论家兔心衰心肌细胞钙渗漏与CaMKⅡ蛋白表达水平和活性增加相关。     

常咯啉对豚鼠和家兔单个心肌细胞钾电流的影响

AIM: To elucidate whether or not changrolin (CRL) modifies the potassium currents (ITO, IK, and IKl) in myocardial cells. METHODS: A tight seal whole-cell patch-clamp technique was used to record ITO, IK, and IKl in single cells isolated from guinea pig and rabbit hearts. RESULTS: At a clinically relevant concentration, CRL 50 mumol.L-1 inhibited the transient outward current (ITO) by 17.7% +/- 2.4% (n = 8) in rabbit atrial cells. The voltage-dependence of steady-state inactivation of ITO was not affected by CRL. This concentration of CRL did not influence the time-independent inward rectifier or the delayed rectifier K+ currents (IKl and IK, respectively) in rabbit and guinea pig ventricular cells. CONCLUSION: CRL inhibited ITO, but not IK nor IKl.