竹节参总皂苷对妊娠期高血压胎盘滋养细胞氧化应激损伤与过度自噬的影响

目的探讨竹节参总皂苷对妊娠期高血压疾病胎盘滋养细胞氧化应激反应与自噬的影响及作用机制。方法采用100μmol/L亚硝基左旋精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine methylester,L-NAME)处理人胎盘滋养细胞株HTR-8/SV-neo 48 h,并给予竹节参总皂苷(20、40、80μg/mL)干预24 h,采用CCK-8法检测各组细胞活力;采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况;采用试剂盒检测各组细胞上清液中丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽(glutataione,GSH)水平;采用qRT-PCR和Western blotting法检测各组细胞脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein4,FABP4)m RNA和蛋白表达情况;采用Westernblotting法检测各组细胞微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(microtubule associated protein 1 light chain 3 Ⅱ,LC3-Ⅱ)、LC3-Ⅰ、p62和自噬效应蛋白(Beclin-1)表达情况;采用免疫荧光法检测各组细胞LC3表达情况。结果与模型组比较,竹节参总皂苷组细胞活力显著升高(P0.05),细胞凋亡率显著降低(P0.01);上清液中SOD和GSH水平显著升高(P0.01),MDA水平显著降低(P0.01);FABP4 m RNA和蛋白表达水平显著降低(P0.05);LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达水平显著降低(P0.05),p62蛋白表达水平显著升高(P0.05);LC3荧光染色强度降低。结论竹节参总皂苷能够改善妊娠期高血压疾病胎盘滋养细胞中的氧化应激反应,并抑制过度自噬,其机制可能与调控FABP4表达有关。     

化瘀通络汤对脑小血管病致认知功能障碍患者执行功能的影响

目的观察扶脾柔肝方(FRR)含药血清对大鼠原代肝星状细胞(PHSC)上皮间质转化及自噬的影响。方法体外培养大鼠原代肝星状细胞,设立空白对照组,模型组,FRR低、中、高剂量组(20、40、80 g·kg~(-1),10%含药血清),氯喹组(CQ,50μmol·L~(-1)),采用转化生长因子-β1(TGF-β1,10 ng·mL~(-1))刺激PHSC发生上皮间质转化,给予相应药物干预24 h。RFP-GFP-LC3斑点法观察HSC自噬;脂滴染色观察脂质变化情况;实时荧光定量PCR法和Western Blot检测各组细胞中Beclin-1、LC3-Ⅱ、E-cadherin、α-SMA mRNA和蛋白表达。结果与空白对照比较,模型组HSC自噬增强(P0.01),脂质减少(P0.01),Beclin-1、LC3-Ⅱ、α-SMA mRNA及蛋白表达水平明显升高(P0.01),E-cadherin降低(P0.01);与模型组比较,FRR中、高剂量组HSC自噬减弱(P0.01),脂质增加(P0.05,P0.01),Beclin-1、LC3-Ⅱ、α-SMA mRNA及蛋白表达水平明显降低(P0.01),E-cadherin升高(P0.01);与氯喹组比较,FRR大剂量组Beclin-1、LC3-Ⅱ、α-SMA mRNA及蛋白表达水平明显降低(P0.01),E-cadherin升高(P0.01)。结论 FRR药物血清可降低大鼠HSC自噬水平,增加细胞脂质,降低Beclin-1、LC3-Ⅱ、α-SMA mRNA及蛋白表达,升高E-cadherin表达,具有逆转HSC上皮间质转化与抑制细胞自噬的功效。     

扶脾柔肝方含药血清对大鼠原代肝星状细胞上皮间质转化及自噬的影响

目的观察扶脾柔肝方(FRR)含药血清对大鼠原代肝星状细胞(PHSC)上皮间质转化及自噬的影响。方法体外培养大鼠原代肝星状细胞,设立空白对照组,模型组,FRR低、中、高剂量组(20、40、80 g·kg~(-1),10%含药血清),氯喹组(CQ,50μmol·L~(-1)),采用转化生长因子-β1(TGF-β1,10 ng·mL~(-1))刺激PHSC发生上皮间质转化,给予相应药物干预24 h。RFP-GFP-LC3斑点法观察HSC自噬;脂滴染色观察脂质变化情况;实时荧光定量PCR法和Western Blot检测各组细胞中Beclin-1、LC3-Ⅱ、E-cadherin、α-SMA mRNA和蛋白表达。结果与空白对照比较,模型组HSC自噬增强(P0.01),脂质减少(P0.01),Beclin-1、LC3-Ⅱ、α-SMA mRNA及蛋白表达水平明显升高(P0.01),E-cadherin降低(P0.01);与模型组比较,FRR中、高剂量组HSC自噬减弱(P0.01),脂质增加(P0.05,P0.01),Beclin-1、LC3-Ⅱ、α-SMA mRNA及蛋白表达水平明显降低(P0.01),E-cadherin升高(P0.01);与氯喹组比较,FRR大剂量组Beclin-1、LC3-Ⅱ、α-SMA mRNA及蛋白表达水平明显降低(P0.01),E-cadherin升高(P0.01)。结论 FRR药物血清可降低大鼠HSC自噬水平,增加细胞脂质,降低Beclin-1、LC3-Ⅱ、α-SMA mRNA及蛋白表达,升高E-cadherin表达,具有逆转HSC上皮间质转化与抑制细胞自噬的功效。     

人参皂苷Rg1通过SIRT1/PGC-1α信号通路抑制AngⅡ诱导乳鼠心肌细胞肥大的研究

目的:探讨人参皂苷Rg1对血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)诱导乳鼠心肌细胞肥大及能量代谢的作用,及对沉默信息调节因子1(silent information regulator 1, SIRT1)和过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1α,PGC-1α)表达的影响。方法:原代培养SD乳鼠心肌细胞,用AngⅡ0.1μmol/L诱导心肌细胞肥大,观察人参皂苷Rg1 12.5、25、50μmol/L及SIRT1特异性阻断剂EX527 1μmol/L对肥大心肌细胞的影响。采用消化分离法及计算机图像分析系统检测细胞体积;考马斯亮蓝(Bradford)法检测细胞中蛋白质含量;Western blot法检测心肌细胞心房钠尿肽(Atrial natriuretic peptide, ANP)、SIRT1及PGC-1α的蛋白表达;酶联免疫吸附(Elisa)法检测细胞外液中三磷酸腺苷(ATP)、单磷酸腺苷(AMP)及游离脂肪酸(FFA)的含量。结果:与空白组比较,模型组心肌细胞体积、蛋白及FFA含量明显升高,ATP/AMP比值降低,ANP蛋白表达显著上调,SIRT1及PGC-1α蛋白的表达显著下调。与模型组比较,人参皂苷Rg1 25、50μmol/L组心肌细胞体积、蛋白和FFA含量显著降低,ATP/AMP比值显著升高,ANP蛋白表达显著下调,人参皂苷Rg1 25μmol/L组SIRT1及PGC-1α蛋白的表达显著上调。人参皂苷Rg1的调节作用随浓度增加而增强。EX527对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大各项指标无影响,但人参皂苷Rg1对肥大心肌细胞的保护作用及PGC-1α表达上调作用可被EX527部分阻断。结论:人参皂苷Rg1对AngⅡ诱导乳鼠心肌细胞肥大有抑制作用,能改善肥大心肌细胞的能量代谢,其通过上调SIRT1及PGC-1α的表达发挥保护作用。     

人参皂苷Rg5通过miR-125b/STARD13/NEU1信号通路对胃癌BGC-823细胞侵袭迁移的影响

目的:研究人参皂苷Rg5对胃癌BGC-823细胞侵袭迁移的影响,并通过微小RNA-125b(microRNA-125b,miR-125b)/类固醇敏感性调节蛋白相关脂类转运体结构域13(St AR-related lipid transfer domain protein 13,STARD13)/唾液酸酶1(neuraminidase 1,NEU1)信号通路探讨人参皂苷Rg5抑制胃癌侵袭迁移的作用机制。方法:人参皂苷Rg5(12.5,25,50μmol·L-1)处理BGC-823细胞后,采用transwell小室实验检测人参皂苷Rg5对BGC-823细胞侵袭、迁移能力的影响,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测miR-125b,STARD13,NEU1 mRNA的表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测STARD13,NEU1蛋白的表达。结果:人参皂苷Rg5(25,50μmol·L-1)可有效抑制BGC-823细胞的侵袭、迁移。miR-125b,STARD13,NEU1 mRNA的表达,与空白组比较,人参皂苷Rg512.5μmol·L-1组的miR-125b相对表达水平降低,STARD13,NEU1 mRNA相对表达水平升高,但无统计学差异;人参皂苷Rg5(25,50μmol·L-1)组miR-125b相对表达水平降低,STARD13,NEU1 mRNA相对表达水平增高(P0.01)。STARD13,NEU1蛋白的表达,与空白组比较,人参皂苷Rg5(12.5,25μmol·L-1)组的STARD13蛋白相对表达水平升高,人参皂苷Rg5(12.5μmol·L-1)组的NEU1蛋白相对表达水平升高,但差异无统计学意义;人参皂苷Rg5(50μmol·L-1)组的STARD13蛋白相对表达水平升高(P0.05),人参皂苷Rg5(25,50μmol·L-1)组NEU1蛋白相对表达水平升高(P0.01)。结论:人参皂苷Rg5可能通过降低miR-125b的表达,上调miR-125b靶基因STARD13,NEU1的表达,抑制胃癌BGC-823细胞的侵袭、迁移。     

熊果酸对肺癌细胞A549自噬相关蛋白的影响

目的研究自噬在熊果酸抑制人肺癌A549细胞增殖中的作用及机制。方法应用CCK8法检测熊果酸对A549细胞增殖的影响;实时荧光定量PCR法检测自噬相关基因LC3、 Beclin-1及p62的表达情况;Western Blot检测自噬相关蛋白LC3、 Beclin-1及p62的表达情况。采用自噬抑制剂3-甲基腺嘌(3-MA)观察熊果酸对A549细胞增殖的抑制作用。结果熊果酸可以显著抑制人肺癌A549细胞的活力(P0.01)且随着熊果酸剂量增加,对细胞的生长抑制率显著上升。熊果酸可诱导A549细胞自噬发生,诱导自噬相关基因、蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、 Beclin-1表达的增加;p62表达降低(P0.01);3MA使得自噬相关基因、蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、 Beclin-1表达明显降低;p62表达明显增加(P0.01)。自噬抑制剂3-MA提高了熊果酸对A549细胞的抑制作用(P0.01)。结论熊果酸抑制A549细胞的增殖,可能通过调节LC3Ⅱ/Ⅰ、 Beclin-1及p62蛋白表达诱导细胞发生自噬。自噬抑制剂3-MA能够增强熊果酸抑制A549细胞的增殖抑制作用,有望为肺癌的临床治疗提供新的联合治疗方案。     

护心方含药血清对THP-1源性泡沫细胞自噬相关蛋白的影响

目的探讨护心方抗动脉粥样硬化的可能作用机制。方法用160 nmol/L佛波醇酯类多克隆刺激剂孵育THP-1细胞24 h后诱导分化成巨噬细胞,加入50 mg/L氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)培养48 h,使其转化为泡沫细胞。以40%护心方含药血清作用12 h。采用蛋白质印迹检测自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)、微管相关蛋白轻链3I(LC3-Ⅰ)、Beclin-1及p62表达,激光共聚焦显微镜观察自噬蛋白指标LC3B在细胞内分布及含量。结果与空白组比较,模型组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1表达显著增加,p62表达显著降低,LC3B表达平均荧光强度显著升高(P0.05);与模型组比较,护心方组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1表达显著降低,p62表达显著升高,LC3B表达平均荧光强度降低(P0.05)。结论护心方能够逆转ox-LDL诱导的细胞自噬相关蛋白的表达,从而抵抗动脉硬化过程中过度自噬。这可能是其抗动脉粥样硬化的机制之一。     

人参皂苷Rg1通过激活PINK1/parkin增强线粒体自噬保护Aβ损伤的PC12细胞

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)患者脑中的β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)沉积是造成神经元线粒体损伤的直接原因。线粒体自噬是清除受损线粒体,保护神经细胞的重要方式。人参皂苷Rg₁具有神经保护作用,在防治AD方面有广阔的应用前景,但人参皂苷Rg₁减轻Aβ造成神经损伤的机制尚未阐明。为探讨人参皂苷Rg₁通过影响自噬保护神经细胞的作用机制,该文利用Aβ_25-35诱导PC12细胞损伤模型,观察了人参皂苷Rg₁的保护作用及对细胞自噬的影响,运用自噬诱导剂雷帕霉素和自噬抑制剂氯喹验证Rg₁的神经保护作用与自噬的相关性。发现人参皂苷Rg₁能够增强Aβ损伤PC12细胞的活力,并提高线粒体膜电位,减轻Aβ引起的线粒体损伤,这种保护效果能被自噬抑制剂氯喹阻断;人参皂苷Rg₁还能增加LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比例并促进p62蛋白消耗,同时增加PINK1及parkin蛋白,减少线粒体自噬接头蛋白OPTN的数量,表现出增强PC12细胞的自噬水平的作用。在运用PINK1 shRNA减低线粒体自噬调控位点PINK1的表达后,人参皂苷Rg₁不能再增加PINK1及其下游parkin的表达,并且不能显著影响线粒体自噬接头蛋白NDP52的数量,但其增强自噬的作用没有受到明显影响,仍能够显著增加LC3Ⅱ/Ⅰ比例,并且促进OPTN的消耗。该文研究表明人参皂苷Rg₁能促进Aβ损伤的PC12细胞的自噬水平,此外还可能通过促进PINK1介导的线粒体自噬,减轻线粒体受到的损伤,这可能是其改善Aβ造成的细胞损伤的作用机制之一。     

丹参酮ⅡA通过自噬诱导肺癌A549细胞周期阻滞的作用研究

目的观察丹参酮ⅡA(Tanshinone ⅡA,TⅡA)对人非小细胞肺癌A549细胞增殖的影响,探讨TⅡA诱导A549细胞自噬与细胞周期阻滞的关系。方法采用CCK8法检测TⅡA(0.5、1、2、4、8μmol·L~(-1))对A549细胞增殖的抑制作用;利用流式细胞术检测TⅡA(1、2、4μmol·L~(-1))对A549细胞周期分布的影响;采用Western Blot法检测TⅡA(1、2、4μmol·L~(-1))对A549细胞周期相关蛋白Cyclin D1和自噬相关蛋白p62、LC3B表达的影响;分别采用自噬激动剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA;0.25μmol·L~(-1))+TⅡA(2μmol·L~(-1))或自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA,5 mmol·L~(-1))+TⅡA(2μmol·L~(-1))培养处理A549细胞,然后采用Western Blot法检测细胞Cyclin D1、p62、LC3B蛋白的表达,并通过流式细胞术检测细胞周期分布。结果与对照组比较,TⅡA不同浓度组对A549细胞均具有明显的增殖抑制作用(P 0.05,P 0.01),且呈时间-剂量依赖关系;药物作用12、24 h后,TⅡA的IC50值分别为7.82、2.04μmol·L~(-1)。与对照组比较,TⅡA能降低A549细胞Cyclin D1的表达量(P 0.01),使细胞周期阻滞于G0/G1期(P 0.05,P 0.01),且呈剂量依赖性;TⅡA能够升高A549细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(P 0.05,P 0.01),降低p62表达(P 0.01),诱导细胞发生自噬。与TⅡA组比较,3-MA+TⅡA组A549细胞中的LC3-Ⅱ/LC3-I比值明显降低(P 0.01),p62及Cyclin D1表达水平明显上调(P 0.01),停滞于G0/G1期的细胞比例明显减少(P 0.05)。结论 TⅡA可能通过上调人非小细胞肺癌A549细胞自噬诱导细胞周期阻滞,从而抑制细胞增殖,发挥抗肿瘤作用。     

人参皂苷Rg1对Aβ25-35诱导的BT325细胞株脑啡肽酶表达的影响

目的 :本研究拟探讨人参皂苷Rg1对Aβ2 5 - 35诱导的BT32 5细胞株脑啡肽酶表达的影响。方法 :应用MTT比色法检测一定剂量Aβ2 5 - 35 (2 5 μmol/L)和不同浓度人参皂苷Rg1(5、 10、 2 0 μmol/L)对BT32 5细胞存活率的影响 ,应用RT -PCR观察细胞中NEP基因表达的变化。结果 :2 5 μmol/L的Aβ2 5 - 35作用于BT32 5细胞株 ,BT32 5细胞存活率下降 ,细胞内NEP的表达降低。人参皂苷Rg1能提高Aβ2 5 - 35处理的BT32 5细胞存活率 ,使细胞内NEP表达增高。结论 :一定剂量的Aβ2 5 - 35能造成细胞损伤和细胞内NEP表达降低的模型 ,人参皂苷Rg1对Aβ2 5 - 35造成的细胞毒性具有拮抗作用 ,增高细胞内NEP的表达。     

人参多糖对D-半乳糖诱导的PC12细胞拟老化模型自噬和相关信号通路的影响

目的:探讨人参多糖对D-半乳糖(D-Gal)诱导的大鼠嗜铬细胞瘤(PC12)细胞衰老损伤后自噬和相关信号途径的影响。方法:将PC12细胞分为正常对照组、模型组、人参多糖组。除正常对照组外,其余各组用含20 mg/mL D-Gal的培养基损伤24 h;人参多糖组加入终浓度分别为65、75μg/mL人参多糖作用24 h。CCK-8法检测人参多糖对细胞活力的影响;β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老;流式细胞仪检测细胞周期、活性氧(ROS)及线粒体膜电位(MMP);Seahorse代谢分析系统结合ATP生成量评估线粒体功能;免疫蛋白印迹法检测自噬相关蛋白[微管相关蛋白1轻链3B(LC3B-Ⅱ)、泛素结合蛋白P62(P62)]和自噬相关信号通路Parkin、PINK 1蛋白的表达。结果:与正常对照组比较,D-Gal可引起细胞衰老,表现为细胞活力降低,β-半乳糖苷酶阳性染色率增加,细胞周期G_1阻滞;与模型组比较,人参多糖75μg/mL组线粒体膜电位升高,活性氧降低,ATP及最大呼吸量升高(P0.05～P0.01);与模型组比较,人参多糖组自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ表达水平上升,P62表达下降(P0.001),Parkin、PINK1蛋白的表达趋势与LC3Ⅱ/Ⅰ的结果一致(P0.05～P0.001)。结论:人参多糖可能通过影响PINK1/Parkin途径调控线粒体自噬,维系线粒体稳态改善D-Gal引起的PC12细胞衰老,保护受损细胞。     

补阳还五汤对LPS诱导巨噬细胞活化与自噬的影响

目的:探讨磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/m TOR)信号通路在补阳还五汤抗脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞活化与自噬中的作用。方法:细胞增殖毒性检测(CCK-8)法筛选诱导RAW264.7巨噬细胞活力值的最适LPS浓度。在最适LPS浓度下,利用PI3K阻断剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)(5 mmol·L~(-1)),Akt阻断剂MK2206(5μmol·L~(-1)),m TOR阻断剂Rapamycin(10μmol·L~(-1)),Beclin-1阻断剂Spautin-1(5μmol·L~(-1))及不同剂量的补阳还五汤含药血清(5%,10%,20%)处理RAW264.7巨噬细胞24 h后,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测RAW264.7巨噬细胞炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β),白细胞介素-6(IL-6),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度,蛋白免疫印迹法(Western blot)测定磷酸化(p-)PI3K,p-Akt,p-mTOR通路蛋白的表达及微管轻链蛋白3(LC3),泛素结合蛋白1(p62),Beclin-1的水平。自噬双标腺病毒转染检测RAW264.7细胞自噬流的变化。结果:CCK-8结果显示10 mg·L~(-1)LPS作用时,细胞活性显著增强。模型组IL-1β,IL-6,TNF-α浓度显著高于空白组(P0.01),与模型组比较,Rapamycin显著升高IL-6浓度,其他给药组均可降低IL-1β,IL-6,TNF-α的水平(P0.05,P0.01)。模型组p-Akt,p-PI3K,p-mTOR蛋白表达量明显低于空白组(P0.05),LC3,p62蛋白表达量显著高于空白组(P0.01),与模型组比较,Rapamycin显著降低p-Akt蛋白表达量,不影响p-mTOR表达,补阳还五汤各剂量组与其他各阻断剂组均可明显升高p-Akt,p-PI3K,p-mTOR蛋白表达量(P0.05,P0.01),降低LC3,p62蛋白表达量(P0.05,P0.01),各组Beclin-1蛋白表达量均无显著性差异。与空白组比较,模型组中有明显的自噬体斑点形成,自噬流顺畅;与模型组比较,补阳还五汤含药血清组,3-MA,Spautin-1组自噬斑点的形成明显减少或消失,MK2202,Rapamycin组自噬体斑点大小明显减小,但自噬活力仍较强。结论:补阳还五汤抗LPS诱导巨噬细胞活化与自噬与抑制巨噬细胞炎症反应,调控PI3K/Akt/m TOR信号通路,抑制自噬的过度发生有关。     

人参皂苷Rg1及Rb1对Aβ25-35诱导CHO细胞毒性影响

目的:观察人参皂苷Rg1及Rb1对β-淀粉样蛋白25-35片段(A β25-35)诱导中国仓鼠卵巢瘤(CHO)细胞损伤的保护作用。方法:利用MTT法和Annexin ⅴ-FITC染色流式细胞仪检测法,依次观察人参皂苷Rg1及Rb1对40μM的Aβ25-35多肽诱导CHO细胞24h后细胞活性和细胞凋亡的干预作用。结果:加入Aβ25-35多肽模型组细胞较未加用对照组细胞活性低(P<0.05),加入Aβ25-35多肽模型组细胞凋亡数高于未加用对照组(P<0.05),模型组细胞加用人参皂苷Rg1及Rb1组细胞损伤和凋亡数均较未加用组细胞有不同程度减少(P<0.05)。结论:天然药单体人参皂苷Rg1及Rb1在一定剂量范围内均能抑制Aβ25-35诱导的神经细胞损伤。     

丹参酮ⅡA诱导体外胃癌细胞的自噬

目的探讨丹参酮ⅡA体外对人胃癌SGC7901细胞自噬的影响,初步探讨其抑制肿瘤的机制。方法 MTT法检测不同质量浓度(0.5、1、2和4μg/mL)丹参酮ⅡA作用体外培养的胃癌SGC7901细胞共孵24、48、72 h后,细胞增殖活力的改变;1、2和4μg/mL丹参酮ⅡA作用SGC7901细胞48 h后,流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞自噬小体的水平;实时定量RT-PCR和Western blot分别测定自噬相关蛋白Beclin 1、磷酸酯酶与张力蛋白同源物(PTEN)、LC3-Ⅱ和LC3-I的mRNA和蛋白的表达水平。结果 0.5μg/mL丹参酮ⅡA对胃癌SGC7901细胞没有明显的生长抑制作用,1μg/mL以上各质量浓度丹参酮ⅡA对胃癌SGC7901细胞则有明显的生长抑制作用;流式细胞分析结果显示,与对照组相比,丹参酮ⅡA诱导细胞凋亡(P<0.05);细胞内酸性自噬小体含量增加(P<0.05);实时定量RTPCR和Western blot结果显示,与对照组相比,Beclin-1、PTEN和LC3-ⅡmRNA和蛋白表达水平逐渐升高,LC3-I表达下降(P<0.05)。结论丹参酮ⅡA可诱导人胃癌SGC7901细胞自噬,其机制可能涉及上调自噬相关基因表达Beclin-1,促进自噬标志蛋白LC3-I向LC3-Ⅱ转化,促进自噬调控蛋白PTEN表达。     

苦参碱诱导人白血病耐药细胞K562/IM自噬和凋亡的研究

目的观察苦参碱对人白血病耐药细胞K562/IM自噬和凋亡的影响。方法 (1)苦参碱及伊马替尼对细胞增殖及自噬情况检测:分别设空白对照组、不同浓度(0.25、0.50、1.00、2.00、5.00mg/mL)苦参碱组和(0.05、0.25、0.50、5.00、20.00μmol/L)伊马替尼组,MTT检测K562细胞和K562/IM细胞抑制率。分别设置空白对照组、0.4 mg/mL苦参碱组和0.5μmol/L伊马替尼组,免疫荧光激光共聚焦检测K562细胞和K562/IM细胞自噬现象,Western Blot检测细胞中自噬标志蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62的表达。(2)苦参碱联合3-甲基腺嘌呤(3-MA)或雷帕霉素(rapamycin,Rapa)诱导K562/IM细胞自噬及凋亡情况变化的检测:实验分6组,空白对照组、苦参碱组(0.4mg/mL苦参碱处理)、3-MA组(5mmol/L 3-MA处理)、Rapa组(0.5μmol/L Rapa处理)、苦参碱+3-MA组(0.4mg/mL苦参碱+5mmol/L3-MA处理)、苦参碱+Rapa组(0.4mg/mL苦参碱+0.5μmol/L Rapa处理),采用MTT检测细胞的抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡水平;Western Blot检测细胞自噬标志蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62及凋亡相关蛋白Caspase-3表达。结果 (1)苦参碱和伊马替尼作用K562、K562/IM细胞,细胞增殖受抑制明显(P0.05),LC3-Ⅱ/Ⅰ的聚集明显增加,Beclin-1及LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达升高,P62蛋白表达减少(P0.05),以K562/IM细胞更明显(P0.05)。(2)苦参碱组K562/IM细胞增殖抑制率(36.32±2.21)%,凋亡率(15.35±0.39)%。苦参碱+3-MA组K562/IM细胞增殖抑制率升高[(65.25±2.06)%,P0.01)],凋亡率升高[(21.70±0.48)%,P0.05],同时Beclin-1及LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达下降,P62蛋白表达增强,Caspase-3表达增强(P0.05);而苦参碱+Rapa组作用则相反。结论苦参碱和伊马替尼均可抑制K562、K562/IM细胞增殖的同时可诱导自噬,以耐药K562/IM细胞株自噬明显。通过3-MA抑制自噬可增强苦参碱对细胞K562/IM作用的敏感性,而雷帕霉素减弱苦参碱作用。     

三七总皂苷对β-淀粉样蛋白42损伤脑微血管内皮细胞ZO-1表达的影响

目的观察三七总皂苷对β-淀粉样蛋白(Aβ)42损伤脑微血管内皮细胞ZO-1表达的影响,为阿尔茨海默病的对因治疗提供新的依据。方法细胞分为正常对照组、模型组和三七总皂苷低、中、高剂量组,37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后,采用MTT比色法检测细胞活力,Western blot检测ZO-1蛋白表达。结果 Aβ42刺激后微血管内皮细胞活力降低(P0.01),ZO-1蛋白表达被抑制(P0.01);与模型组比较,三七总皂苷低、中、高剂量组微血管内皮细胞活力增加,其中三七总皂苷中、高剂量组增加较为明显,差异有统计学意义(P0.05),ZO-1蛋白表达增加。结论三七总皂苷通过抑制Aβ42所致微血管内皮细胞活力降低,恢复血脑屏障的部分屏障功能。     

人参皂苷Rg1对TGF-β_1诱导的肾小管上皮细胞红细胞生成素受体表达的影响

目的探讨人参皂苷Rg1对大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)上皮-间充质细胞转化(EMT)的作用及其与该细胞血红细胞生成素受体(EPOR)表达变化的关系。方法将体外培养的正常大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)分为空白对照组、5μg/L TGF-β1刺激组,人参皂苷Rg1与TGF-β1共同干预组(5μg/L TGF-β1的基础上分别加入10,20,40 mg/L的人参皂苷Rg1)。每组细胞干预72 h后,在倒置显微镜下观察各组细胞形态的改变,并通过CCK8法检测人参皂苷Rg1对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化的影响。酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定细胞培养上清液中胶原Ⅰ(Col-Ⅰ)和纤维粘连蛋白(FN)的含量。实时荧光定量PCR方法检测EPOR mRNA转录水平,免疫细胞化学法检测各组表达EPOR细胞的阳性率。结果 TGF-β1诱导NRK52E细胞形态变化,从原有典型的铺路石样上皮细胞形态转变为长梭形类似成纤维细胞形态,并抑制细胞增殖(P<0.05),增加细胞表达Col-Ⅰ和FN,抑制EPOR mRNA及其蛋白的表达(P<0.05);人参皂苷Rg1以剂量和时间依赖的方式抑制TGF-β1诱导的NRK52E细胞形态的改变,减少Col-Ⅰ和FN的表达,上调EPOR mRNA及其蛋白的表达(P<0.05)。结论人参皂苷Rg1对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT具有一定的抑制作用;该作用可能与人参皂苷Rg1上调肾小管上皮细胞EPOR的表达有关。     

姜黄素对小鼠肾足细胞系(MPC5)自噬作用的影响

目的:通过研究姜黄素(curcumin)对小鼠肾足细胞系(MPC5)自噬作用的影响,探讨姜黄素对糖尿病肾病足细胞保护作用的可能机制。方法:将足细胞分为6组:正常对照组(5.5 mmol/L)、高糖组(30 mmol/L)、姜黄素低、中、高浓度组(1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)、雷帕霉素组(10 nmol/L)。Western blot分别检测LC3B、Beclin-1、Synaptopodin及Nephrin蛋白表达。将足细胞分为6组:正常对照组(5.5 mmol/L)、高糖组(30 mmol/L)、姜黄素低、中、高浓度组(1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)、LY294002组(10μmol/L)。Western blot检测PI3K/Akt/mTOR信号通路中p-mTOR、p-Akt蛋白表达水平。结果:高糖组自噬相关蛋白LC3II/I比值及Beclin-1蛋白表达明显低于正常对照组(P0.05);姜黄素组LC3B、Beclin-1等自噬标志性蛋白表达均高于高糖组(P0.05);姜黄素组足细胞功能性标志蛋白表达水平明显高于高糖组(P0.05);姜黄素组p-mTOR、p-Akt蛋白表达水平均低于高糖组(P0.05)。结论:姜黄素能明显改善高糖刺激对小鼠肾足细胞的自噬抑制作用,并且通过抑制P13K/Akt/mTOR信号途径减轻足细胞损伤。     

淫羊藿苷抑制 Aβ25-35诱导的 N2a 细胞自噬及减少细胞内外 Aβ 的实验研究

目的 研究淫羊藿苷（ICA） 对 β-淀粉样蛋白肽 25-35（Aβ25-35） 诱导的小鼠神经瘤母细胞（N2a）Aβ 含量和自噬溶酶体途径的影响。 方法 N2a 细胞培养基加入不同浓度的 ICA （0.05、0.1、0.2 μmol/L）孵育 6 h，再将 20 μmol/L 老化的 Aβ25-35 处理 24 h。 实验分为 5 组院对照组（DMSO）、AD 细胞模型组（ Aβ25-35 ）、0.05 μmol/L ICA 干预组（ Aβ25-35 +ICA0.05）、0.1 μmol/L ICA 干预组 （ Aβ25-35 +ICA0.1）、0.2 μmol/L ICA 干预组（Aβ25-35+ICA0.2）。 将 0.2 μmol/L 的 ICA 预处理 N2a 细胞 2、4、6 h，再加入 Aβ25-35 处理 24 h。 收集细胞和培养基，ELISA 法测定细胞内外 Aβ40 及 Aβ42 含量；免疫印迹法检测LC3、P62、p70S6K 及其苏氨酸 389 位点磷酸化（p-p70S6K，活性形式）的表达；采用细胞免疫荧光技术观察 LC3 和 4G8（识别 Aβ17-24 片段）的染色强度及 LAMP2 和 4G8 共定位情况。 结果 与对照组比较，AD细胞模型组细胞存活率降低（P<0.05），细胞内外 Aβ42 及 Aβ40 的含量增加（P<0.01，P<0.05），LC3II/LC3I和 P62 蛋白表达均增加（P<0.05），p- p70S6K 表达增加（P<0.01）。 与 AD 细胞模型组比较，0.05、0.1 和0.2 μmol/L ICA 干预组细胞活力下降（P<0.05），0.2 μmol/L ICA 干预组细胞内外 Aβ42 及 Aβ40 含量降低（P<0.05），0.1 和 0.2 μmol/L 干预组 ICALC3II/LC3I和 4G8 蛋白表达降低（P<0.05）。 0.2 μmol/LICA 预处理 4、6 h 可明显降低 AD 细胞模型细胞内外 Aβ42 和 Aβ40 的含量，降低 LC3域/ LC3玉和 P62 蛋白表达及 p- p70S6K/p70S6K（P<0.05）。 结论 ICA 可抑制 Aβ25-35 诱导的 N2a 细胞自噬，降低 p70S6K 活性并减少细胞内外 Aβ。     

京尼平苷对Aβ_(1-42)诱导的SH-SY5Y细胞的保护作用及相关机制研究

目的研究京尼平苷对Aβ_(1-42)诱导的SH-SY5Y细胞的保护作用并探讨其作用机制。方法实验分为对照组、京尼平苷组、Aβ_(1-42)组、京尼平苷+Aβ_(1-42)组。将SH-SY5Y细胞株接种于96孔板,对照组采用无血清培养基培养,其他组加入相应药物进行干预培养。MTT法检测各组细胞存活率,Western blot法检测胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)及自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg7的表达情况。结果 Aβ_(1-42)组SH-SY5Y细胞存活率及SH-SY5Y细胞中GDNF、Atg7蛋白表达量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显低于对照组和京尼平苷组(P均0.05),京尼平苷+Aβ_(1-42)组SH-SY5Y细胞存活率及SH-SY5Y细胞中GDNF、Atg7蛋白表达量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显高于Aβ_(1-42)组(P均0.05),对照组和京尼平苷组SH-SY5Y细胞存活率及SH-SY5Y细胞中GDNF、Atg7蛋白表达量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值比较差异均无统计学意义(P均0.05)。结论京尼平苷对Aβ_(1-42)诱导的SH-SY5Y细胞具有保护作用,这种作用可能与其增强自噬活性及神经营养因子的表达有关。