应用分子伴侣共表达系统表达结核分枝杆菌编码蛋白

目的 研究共同表达分子伴侣能否提高结核分枝杆菌编码基因的表达效率及被表达蛋白的生物活性。方法将携带有结核分枝杆菌编码基因的表达质粒Rv3790::pET16b、Rv3791::pET16b与能够同时表达3个分子伴侣DnaK、DnaJ和GrpE的质粒pkJE7共同在大肠埃希菌BL21(DE3)表达,之后对所获得的蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印记分析（Western Blot）检测蛋白产量,并分析蛋白的活性。以Rv3790::pET16b、Rv3791::pET16b单独在BL21(DE3)内的表达作为对照。结果与分子伴侣共表达的结核分枝杆菌编码基因相对于目的基因单独表达时获得较多的可溶性蛋白,较少的包涵体和蛋白降解;共表达的蛋白也具有相对较好的活性。结论共同表达分子伴侣能够提高某些结核分枝杆菌编码蛋白的表达效率和生物活性。     

内质网分子伴侣糖调节蛋白94在大鼠酒精性肝损伤中的高表达和意义

目的检测酒精性肝损伤大鼠肝组织内质网分子伴侣糖调节蛋白94的表达情况,探讨酒精性肝损伤的发病机制.方法24只SD雌性大鼠分成对照组和模型组.模型组大鼠给予乙醇加鱼油灌胃配合高脂饮食8周,建立酒精性肝损伤模型,应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和免疫组化法检测大鼠肝组织内质网分子伴侣糖调节蛋白94 mRNA和蛋白水平.结果与正常组比较,模型组大鼠肝组织糖调节蛋白94 mRNA和蛋白表达明显增强(P＜0.01).结论酒精性肝损伤大鼠存在糖调节蛋白94高表达,这可能是该病的发病机制之一.     

结核分枝杆菌毒力分泌系统Rv3871基因的分子克隆及蛋白表达研究

目的为探索参与结核分枝杆菌(MTB)毒力分泌系统相关基因的分子功能,对MTB H37Rv株编码Rv3871蛋白基因进行克隆、表达及鉴定分析。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,用PCR扩增Rv3871基因片段,并重组到原核表达载体pET32a( )中,转化E.coliBL21(DE3)菌株,用IPTG诱导蛋白表达,通过SDS-PAGE和Western blot对目的蛋白进行检测分析。结果阳性重组质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切得到1 776和5 900 bp两条片段,与预期大小一致。重组质粒测序,与NCBI上Rv3871编码序列比对完全一致,且输入片段读码框与表达载体读码框相吻合。SDS-PAGE检测表达蛋白分子质量单位为84 ku;Western blot检测出特异性阳性信号。结论本研究成功构建了结核杆菌毒力分泌系统重要相关基因Rv3871的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达Rv3871蛋白,为进一步探讨该基因在MTB毒力分泌中的功能奠定了基础。     

分子伴侣及其与乙型肝炎病毒的关系

分子伴侣（molecular chaperone)是近年来新发现的一类辅助蛋白，在生物体内起着稳定新生蛋白质、辅助其它蛋白正确折叠、组装、转运或降解的作用，对蛋白质的功能完整有着重要意义。乙型肝炎病毒（HBV）的体内复制、组装过程的具体机制至今尚未弄清，已有研究证实分子伴侣中的一些成员如热休克蛋白90、70、60等（HSP90，HSP70，HSP60），葡萄糖调节蛋白94（GRP94）及钙连蛋白（calnexin)等在HBV的生命周期中扮演了重要的角色，本文综述了近年来这方面的研究进展。     

结核分枝杆菌组合蛋白的表达及血清学诊断价值的评价

目的取得能用于结核病血清学诊断的敏感性、高特异性强的组合蛋白。方法用DNA双链全合成的方法合成ESAT6,MPT64,38KD,Ag85B等结核分枝杆菌特异性抗原的抗原表位基因,用PCR法将这些基因片段连接起来成为新型抗原的编码基因。将该编码基因克隆于pET24b载体,经测序鉴定后转化于大肠杆菌BL21菌株用IPTG进行诱导表达。组合蛋白经镍柱纯化后用Western印迹法和酶联免疫实验（ELISA）对其抗原性和特异性进行检测。结果携带重组质粒的菌株经IPTG诱导后以包涵体的形式大量表达组合蛋白,经镍柱纯化后蛋白质浓度达到0．5mg／ml,western实验表明：该组合蛋白能与结核病人血清特异性结合,而不与健康人血清结合。以该组合蛋白为包被抗原采用ELISA法检测结核抗体的灵敏度为61％,特异性为97．3％。PPD检测的灵敏度和特异性分别为73．7％和91．8％。该组合蛋白检测卡介苗接种阳转血清的阳性率为2．1％,特异性为97．9％,而PPD检测卡介苗接种阳转血清的阳性率为22．3％,特异性为79．7％。结论该组合蛋白用于结核病血清学诊断具有较高的灵敏度和特异性,能够为结核病的临床诊断提供一定的指导。     

HLA-B27分子与分子伴侣的相关性研究

目的 观察ＨＬＡ－Ｂ２７分子与Ｃａｌｎｅｘｉｎ及ＢｉＰ两种分子伴侣的相关，了解ＨＬＡ分子在人体细胞内的合成、组装及转运过程。方法 将人ＨＬＡ－Ｂ２７基因转入人Ｂ淋巴母细胞系Ｃ１Ｒ，以单克隆抗体、免疫沉淀、脉冲追踪及内切糖苷酶Ｈ消化实验判断Ｂ２７分子在细胞内的成熟过程，及Ｂ２７分子与两种分子伴侣之间的相关性。结果 Ｃ１Ｒ细胞在加入培养基３０分钟时已开始新合成的Ｂ２７分子从内质网转运到高尔基体，２小时     

实时定量PCR技术检测结核分枝杆菌蛋白编码基因表达水平研究

目的运用实时定量PCR(qRT-PCR)检测66株结核分枝杆菌蛋白编码基因(fbpB,psts1,mpt64)的表达水平,探讨结核分枝杆菌耐药菌株与敏感菌株,北京基因型菌株与非北京基因型菌株的蛋白抗原在转录水平的差异。方法根据GenBank提供的序列,设计特异性引物,扩增目的基因片段,克隆入载体,重组质粒经纯化及梯度稀释,应用qRT-PCR检测基因的表达水平。结果北京基因型菌株psts1基因表达水平与非北京基因型菌株比较差异有统计学意义(t=3.721,P<0.01);耐药菌株mpt64基因表达水平与敏感菌株比较差异有统计学意义(t=3.951,P<0.01)。结核分枝杆菌活菌的扩增曲线呈典型的S型,结核分枝杆菌死菌和非结核分枝杆菌呈水平直线,未检测到荧光信号。结论北京基因型结核分枝杆菌psts1基因的表达量低于非北京基因型,结核分枝杆菌耐药菌株mpt64基因的表达量低于敏感株。     

结核分枝杆菌热休克蛋白Hsp16.3的表达、纯化及鉴定

目的构建结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3原核表达载体,获得Hsp16.3蛋白,并进行纯化及鉴定。方法以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增Hsp16.3基因,以pET28a为载体,构建重组质粒pET28a-Hsp16.3,测序正确后,转入宿主菌BL21(DE3)进行诱导表达。融合蛋白经SDS-PAGE,Western blot分析鉴定,并通过镍柱进行亲和层析纯化,表达蛋白分子质量约17ku,能被结核杆菌16ku单抗和小鼠抗His Tag单抗识别。结果成功构建了Hsp16.3原核表达载体pET28a-Hsp16.3,并在宿主菌BL21(DE3)中表达,表达蛋白分子质量单位约17ku,能被结核杆菌16ku单抗和小鼠抗His Tag单抗识别。结论 Hsp16.3基因克隆入宿主菌中并成功表达,纯化Hsp16.3蛋白具有生物学活性,为Hsp16.3的进一步研究奠定了基础。     

分子伴侣HSP90在肿瘤发生中的作用机制

分子伴侣是古老而进化保守的一类蛋白质,在细胞生长、分化和生存中参与许多关键调节蛋白质的正确折叠、细胞间定位和蛋白质的表达。在肿瘤发生中分子伴侣的基本监护作用被破坏,导致细胞恶性转化,快速促进整体的衰竭。由于毒性应激而蛋白质表达水平增加是一种应激反应,可促进细胞的存活。分子伴侣在许多肿瘤细胞中表达增加可促进肿瘤细胞在不利环境中的生存,除此之外,分子伴侣还允许肿瘤细胞接受环境中的改变,信号通路中关键信号蛋白在某些方面的改变可促进癌症的发生。     

结核分枝杆菌热休克蛋白HtpG基因的原核表达与鉴定

目的 克隆并表达结核分枝杆菌 ＨｔｐＧ 分子,并鉴定其免疫反应性。 方法 采用聚合酶链式反应扩增结核分枝杆菌 Ｈ３７Ｒａ ＨｔｐＧ 基因,并克隆至 ｐＥＴ２２ｂ 质粒,测序筛选到重组成功的质粒。 重组质粒ｐＥＴ２２ｂ － ＨｔｐＧ 转化大肠埃希菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）,表达的 ＨｔｐＧ 重组蛋白通过镍柱纯化。 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 鉴定表达蛋白,并使用 ＨｔｐＧ 重组蛋白经 ＥＬＩＳＡ 法检测肺结核患者血清特异性抗体水平。 结果 成功构建了 ｐＥＴ２２ｂ－ ＨｔｐＧ 重组质粒; 在大肠埃希菌中表达出分子质量约 ７３ｋＤａ 的重组蛋白。 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 鉴定该重组蛋白具有良好免疫反应性,ＥＬＩＳＡ 法检测肺结核患者血清中存在特异性抗 ＨｔｐＧ 抗体。 结论 在大肠埃希菌内成功表达 ＨｔｐＧ 重组蛋白,为将该蛋白用于结核免疫诊断试剂的研制奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv1246c和Rv1247c基因的重组质粒构建及蛋白表达

目的应用生物信息学方法分析结核分枝杆菌的Rv1246c和Rv1247c所编码蛋白的结构特征,并对其进行克隆和表达。方法利用Bioedit、Dnaman及Pfam等对Rv1246c和Rv1247c所表达蛋白结构进行分析;以结核分枝杆菌H37Rv的基因组为模板,用PCR分别扩增Rv1246c和Rv1247c基因片段,并重组到原核表达载体pET32a( )中,转化E.coliBL21(DH3)菌株,用IPTG诱导蛋白表达。通过SDS-PAGE及Western-blot免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况。用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,间接ELISA检测抗体效价。结果生物信息学分析表明它们与大肠杆菌的relBE家族有相似的蛋白模块,Rv1246c蛋白与大肠杆菌RelE同源性是21.55%,Rv1247c同源性是23.85%;两个重组质粒构建成功;通过SDS-PAGE检测分别在31kD和29kD处有特异性条带;Western-blot免疫印迹出现特异性阳性信号;间接ELISA检测多克隆抗体效价均大于1:40 000。结论本研究首次成功构建了结核分枝杆菌的Rv1246c和Rv1247c的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了Rv1246c和Rv1247c蛋白,为进一步研究该组基因的分子功能奠定了良好基础。     

牛结核分枝杆菌BfrB蛋白生物信息学分析及多克隆抗体制备

目的 旨在预测和分析牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)BfrB蛋白的结构和潜在功能,并进行克隆表达及多克隆抗体的制备,为新型疫苗、诊断靶点等的开发提供理论基础。方法 利用生物信息学软件预测分析BfrB蛋白的生物信息学特征,克隆其编码基因并与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体并利用IPTG诱导表达,镍柱亲和层析法纯化重组BfrB蛋白,SDS-PAGE和Western blot验证分析重组BfrB蛋白,以该蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并测定其效价。结果 BfrB蛋白含有181个氨基酸,分子式为C₉₀₃H₁₄₀₅N₂₅₅O₂₇₆S₆,理论分子质量为20.442 ku,无信号肽和跨膜结构域,是一种定位于细胞质的亲水性的储铁蛋白。该蛋白有3个固定无序结构域、15个磷酸化位点、16个甲基化位点和2个乙酰化位点,无糖基化位点。其二级结构中α-螺旋占70.01%,延伸链占4.42%,β-折角占3.87%,无规则卷曲占21.55%,三级结构与二级结构预测...     

结核分枝杆菌持留相关PcaA和Acr蛋白的表达纯化及初步应用

目的结核分枝杆菌(M.tb)潜伏感染状态是造成结核病诊断和研究的难点之一,目前的检测方法很难将潜伏感染结核病(LTBI)和活动性结核病(ATB)区分开.有文献报道分枝菌酸环丙烷合成酶(PcaA)和小分子热休克晶体蛋白(Acr)两个基因在M.tb持留状态下高表达,因此可能和菌的潜伏感染相关,有作为新的诊断靶标的可能,因此我们对它们开展了有关的研究和应用,以期为LTBI的诊断提供新的研究方向和方法.方法首先针对目的基因设计引物,从基因组上扩增其全序列,构建克隆和表达载体,纯化分离蛋白.将蛋白作为抗原应用于免疫学的检测,用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测血清中两种蛋白抗体的表达水平,最终经过统计学处理,分析LTBI和ATB患者之间的血清学的差异,寻找可应用于临床诊断分析的方法和策略.结果成功构建PcaA和Acr蛋白的克隆和表达载体,并获得表达和纯化的蛋白.血清的PcaA和Acr抗体水平检测结果显示健康对照(HC)与ATB之间差异有统计学意义,而ATB和LTBI之间差异并无统计学意义,即使将两个蛋白检测结果进行并联分析后也未显示差异有统计学意义.结论PcaA和Acr蛋白可以在大肠杆菌中成功表达并顺利纯化,PcaA蛋白有较高的抗原特异性和免疫反应性,可用于以后对结核病的检测分析中;虽然用血清学诊断时不能完整的区分LTBI和ATB,但可用于鉴别结核分枝杆菌感染与否.     

结核分枝杆菌Hsp65与IL-2融合蛋白稳定表达细胞系的建立

目的构建了表达结核分枝杆菌Hsp65与IL-2融合蛋白的真核表达载体;获得重组质粒稳定转染的P815细胞系。方法将Hsp65与IL-2基因分别克隆至真核表达载体pcDNA3.1,转化DH5α菌株感受态细胞,获得阳性重组质粒Hsp65-IL-2-pcDNA3.1。在阳离子聚合物作用下,重组质粒转染与BALB/c遗传背景一致的P815(H-2d)细胞。G418筛选抗性克隆,免疫荧光检测融合蛋白的表达。结果真核质粒转染的阳性克隆细胞,经RT-PCR检测到Hsp65与IL-2融合蛋白mRNA水平的表达,分别用抗Hsp65和IL-2的单抗进行间接免疫荧光检测,可在转染重组质粒的P815细胞膜上观察到较强的绿色荧光。结论获得表达Hsp65与IL-2融合蛋白的稳定细胞系,为其CTL研究提供了合适的靶细胞。     

结核分枝杆菌CFP-10与Rv2626c蛋白的表达及血清学诊断研究

目的　通过构建结核分枝杆菌（结核菌）CFP-10和Rv2626c蛋白表达载体,并在大肠杆菌表达,对其免疫反应性进行鉴定评价。方法　用PCR法从结核菌H37Rv基因组DNA分别扩增出CFP-10、Rv2626c基因,连接到表达载体PET30a上, 在大肠杆菌中表达;组氨酸标签(His - Tag) 镍柱层析纯化重组蛋白;用ELISA方法进行检测。结果　构建了含CFP10、Rv2626c重组质粒的大肠杆菌工程菌, 发现目的蛋白主要以可溶形式存在;用重组CFP10、Rv2626c蛋白组成联合抗原, ELISA方法检测214份血清, 阳性率达77.1%。结论　目的基因克隆入宿主菌中并表达成功, 重组的CFP-10、Rv2626c蛋白组成联合抗原可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。     

结核分枝杆菌MPT-64分泌蛋白在原核表达载体中的克隆,表达与鉴定

目的　对结核分枝杆菌的一种分泌蛋白MPT - 6 4基因进行克隆 ,鉴定与表达 ,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下基础。方法　以结核杆菌H3 7Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR法对基因MPT - 6 4进行扩增 ,产物与载体质粒pGEX - 4T - 1构建表达MPT - 6 4的重组质粒 ,将此重组质粒先转化到E coliDH5α内抽提质粒 ,酶切检验 ,再转化入表达宿主E coliBL2 1(DE3)PLysS菌株内 ,对转化菌株以IPTG进行诱导后 ,破菌 ,离心 ,上清进行SDS -PAGE ,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上后进行免疫染色 ,一抗为结核分枝杆菌菌株H37Rv羊抗阳性血清。结果　电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白 ,所表达的蛋白质相对分子质量为 5 0 0 0 0 ,抗体检测有特异带大小为 5 0kDa。结论　目的基因克隆到菌株内 ,重组结核杆菌分泌蛋白MPT - 6 4的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及上述抗原、抗体的大规模制备打下基础     

结核分枝杆菌PPE19的克隆及其GST融合蛋白的表达和鉴定

目的构建结核分枝杆菌PPE19的GST融合蛋白表达载体,并鉴定其在大肠杆菌中的表达。方法以结核杆菌H37Rv基因组为模板,根据PPE19基因序列设计引物,运用PCR的方法获得PPE19基因,并将其克隆到pGEX-kg载体中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性菌落进行质粒的酶切和序列分析;将构建正确的克隆进行诱导表达,对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析;用western-blot鉴定融合蛋白的表达。结果正确构建了pGEX-PPE19原核表达载体,载体上基因序列正确;载体能在大肠杆菌中表达分子量约为70 kDa的重组蛋白;该蛋白能与GST抗体结合。结论成功构建了GST-PPE19融合蛋白的表达载体,为进一步进行PPE19蛋白的功能研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv1009基因蛋白的克隆和表达

目的 克隆表达结核分枝杆菌促Rv1009基因,序列测定正确后进行融合、表达.方法 采用热启动聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入pGEX 4T-2载体中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,目的基因经IPTG诱导,表达Rv1009基因蛋白.结果 经PCR扩增在1300bp处发现一条目的片段,获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009基因蛋白,经诱导后高效表达分子量为64KD的外源蛋白,与预期分子量大小一致,凝胶自动扫描分析,在A600值为0.6,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导表达3 h时融合蛋白表达量即达峰值,占菌体总蛋白的22.8%.结论 构建了结核分枝杆菌Rv1009基因重组表达载体,获得了RPF样融合蛋白的高效表达,为今后深入研究奠定了基础.     

结核分枝杆菌热休克蛋白Hsp70在原核表达载体中的克隆表达与鉴定

目的对结核分枝杆菌的一种热休克蛋白Hsp70基因进行克隆,鉴定,并在原核系统中表达。方法以结核杆菌H37Rv菌株基因组DNA为模板,用PCR法对基因Hsp70进行扩增,产物与载体质粒pET-22b(+)构建表达Hsp70的重组质粒,将此重组质粒先转化到E.coliDH5α内提取质粒,酶切鉴定,再转化入表达宿主E.coliBL21(DE3)PlysS菌株内,对转化菌株以IPTG进行诱导后,破菌,离心,上清进行SDS-PAGE,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上后进行免疫印迹分析。结果电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白,所表达的蛋白质相对分子质量为70 000,抗体检测有特异带大小为70kDa。结论成功进行了结核杆菌分泌热休克蛋白Hsp70基因的克隆表达。     

结核分枝杆菌RpfA蛋白的表达、纯化与鉴定

目的构建结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）RpfA的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达、纯化和鉴定。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出编码RpfA蛋白的Rv0867c基因,通过克隆载体pMD18-T构建质粒载体pMD18-T-Rv0867c。经酶切和DNA序列测定证实正确后,将Rv0867c基因克隆到pET32a（＋）载体并在大肠杆菌BL21中诱导表,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot鉴定后,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。结果双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果与文献报道一致。Western-blot结果显示,在相对分子量约102 kDa处有分别与Anti-His单抗、Rpf结构域单抗和TB病人血清特异性结合带。结论成功表达、鉴定和纯化了RpfA蛋白。