地高辛标记的大鼠nNOS mRNA探针的制备和应用

目的　制备大鼠神经元型一氧化氮合酶 (neuronalnitricoxidesynthase,nNOS)地高辛 (digoxigenin)标记的RNA探针 ,探讨nNOS在脊髓中的表达定位。方法　采用RT PCR方法 ,从大鼠脑组织中扩增nNOS基因mRNA部分片段 ,并经序列测定。以dig nNOSmRNA为探针 ,采用原位杂交观察成年大鼠脊髓组织中nNOSmRNA表达。结果　RT PCR法扩增出一特异产物与预期长度 2 4 0bp相符 ,T载体克隆测序与nNOS基因 10 0 %同源。原位杂交结果显示阳性信号出现在成年大鼠脊髓组织中。结论　采用RT PCR和T载体技术获得了大鼠脑组织nNOS基因克隆 ,dig nNOSmRNA探针原位杂交显示正常SD大鼠腰段脊髓组织中表达nNOSmRNA。     

大鼠脑组织中CNTF基因克隆及其探针制备

目的　克隆大鼠CNTF基因并制备地高辛标记的CNTF探针。方法　采用RT PCR法 ,从大鼠脑组织mRNA中扩增CNTF基因ORF区片段 ,克隆入T载体 ,并经序列测定。以地高辛素标记CNTF基因片段为探针 ,对成年大鼠脊髓组织切片进行原位杂交。结果　RT PCR法扩增出一特异产物与预期长度 6 16bp相符 ,序列测定与CNTF基因 10 0 %同源。原位杂交显示阳性信号出现在成年大鼠脊髓白质的前索及侧索的周边部分 ,为杵棒形和三角形带有纤细突起的胶质细胞。结论　采用RT PCR和T载体技术获得了大鼠脑组织中的CNTF基因克隆 ,地高辛标记的CNTF探针原位杂交显示正常大鼠脊髓白质的部分胶质细胞中表达CNTFmRNA。     

大鼠脑组织中谷氨酸脱羧酶65基因的克隆和序列测定

目的探讨克隆大鼠脑组织中谷氨酸脱羧酶65基因。方法采用RT-PCR方法,将大鼠脑组织中的mRNA逆转录成cDNA,再以cDNA为模板,扩增谷氨酸脱羧酶65基因片段,克隆入T载体,并经序列测定。结果RT-PCR法扩增出一特异产物与预期长度1758bp相符,T载体克隆测序与大鼠谷氨酸脱羧酶65100%同源。结论采用RT-PCR和T载体技术获得了大鼠脑组织中的谷氨酸脱羧酶GAD65基因克隆,为该基因的体外表达打下基础。     

大鼠大脑组织中谷氨酸脱羧酶GAD67基因的克隆和序列测定

目的克隆大鼠脑组织中谷氨酸脱羧酶GAD67基因.方法采用RT-PCR方法,大鼠脑组织中的mRNA逆转录成cDNA,再以cDNA为模板,扩增谷氨酸脱羧酶GAD67基因片段,克隆入T载体,并经序列测定.结果 RT-PCR法扩增出一特异产物与预期长度1795bp相符,T载体克隆测序与大鼠谷氨酸脱羧酶GAD67 100%同源.结论采用RT-PCR和T载体技术获得了大鼠脑组织中的谷氨酸脱羧酶GAD67基因克隆,为该基因的体外表达打下基础.     

大鼠大脑组织中谷氨酸脱羧酶GAD67基因的克隆和序列测定

目的　克隆大鼠脑组织中谷氨酸脱羧酶GAD6 7基因 .方法　采用RT -PCR方法 ,大鼠脑组织中的mRNA逆转录成cDNA ,再以cDNA为模板 ,扩增谷氨酸脱羧酶GAD6 7基因片段 ,克隆入T载体 ,并经序列测定 .结果　RT -PCR法扩增出一特异产物与预期长度 1795bp相符 ,T载体克隆测序与大鼠谷氨酸脱羧酶GAD6 710 0 %同源 .结论　采用RT -PCR和T载体技术获得了大鼠脑组织中的谷氨酸脱羧酶GAD6 7基因克隆 ,为该基因的体外表达打下基础 .     

地高辛标记的大鼠p75 RNA探针的制备和应用

目的制备用地高辛标记的神经生长因子低亲和力受体(p75)的RNA探针.研究p75在海马组织中的表达.方法设计p75引物,构建p75/pGEM-T重组质粒,分别用ApaⅠ和Sac Ⅰ进行酶切得到线性化DNA片段,以Sp6和T7聚合酶转录合成酶合成地高辛标记的(dig-)正反义RNA探针.运用点膜杂交的方法检验探针的敏感度,运用该探针,通过原位杂交分析p75在海马中的表达.结果构建了p75/pGEM-T质粒,获得高效价的正、反义dig-p75 RNA探针,应用该探针发现p75 mRNA在海马中的表达.结论成功制备了地高辛标记的p75RNA探针,为进一步研究p75在海马中发育和损伤过程中的表达打下基础.     

大鼠Desert Hedgehog基因的克隆和表达

目的克隆大鼠Desert Hedgehog（DHH）基因,构建其真核表达载体并转染TP67细胞;同时制备DHHcRNA正义及反义探针用于检测其在细胞中的表达。方法提取SD大鼠睾丸总RNA,RT-PCR法扩增DHHcDNA片段,连接于pGEM—TEasy载体,经测序后构建真核表达载体pLXSN／DHH并转染PT67细胞;重组质粒经限制性内切酶NotⅠ和NcoⅠ酶切、回收后,进行转录标记反应,原位杂交检测DHH在嘶7细胞中的表达。结果RT-PCR扩增得到1220bp的片段;成功构建了真核表达载体pLXSN／DHH;制备DHH正义及反义探针浓度分别为150mg／L和80mg／L;DHH在PT67细胞中有表达。结论克隆的DHH基因与大鼠Sertoli细胞的DHH基因相同,成功标记了特异、敏感的DHHcRNA探针,转染的DHH基因能够在PT67细胞中表达。     

ADAM23在小鼠脑组织的表达

目的:观察整合素-金属蛋白水解酶23(ADAM23)在成年小鼠脑组织的表达及分布。方法:RT-PCR克隆ADAM23全长序列,体外逆转录合成地高辛标记的RNA探针;原位杂交法检测ADAM23在脑各组织的表达。结果:ADAM23 mRNA在小鼠大脑皮层区、海马CA3区、小脑的浦肯野细胞层(Purkinje cell)区、舌下神经核区高表达;而小脑、下丘的中央核、小脑核侧部区等弱表达。结论:ADAM23在成年小鼠脑组织的广泛表达尤其中枢神经系统的高表达,预示着ADAM23在中枢神经系统内有重要作用。     

小鼠Cpne5基因mRNA水平的表达分布及其在胚胎的表达定位

目的明确小鼠Cpne5基因在mRNA水平的组织表达分布及其在胚胎的表达定位。方法提取新生、成年小鼠主要脏器的总RNA,利用RT-PCR法检测Cpne5 mRNA的表达量;合成针对Cpne5 mRNA的杂交探针,取不同胎龄胎鼠进行整体原位杂交。结果 Cpne5 mRNA在成年小鼠10种脏器组织均有不同程度的表达,以大脑,小脑,睾丸和肺脏表达量较高;而肝脏和肌肉未表达。新生小鼠9种脏器中,Cpne5表达量最高的是脑组织,眼和肾次之,肺和肝脏表达量很少。制备并评估Cpne5原杂探针的产量,SP6转录的反义探针浓度为100ng/μL,T7转录的正义探针浓度为10ng/μL,原位杂交结果显示Cpne5 mRNA主要表达于胎鼠的端脑、间脑、中脑及菱脑原节。结论在新生和成年小鼠的脑组织中Cpne5基因mRNA高水平表达,并在胎鼠发育过程中定位于胎脑。     

Sirt2基因的克隆及其在HEK293中的表达

目的:克隆大鼠Sirt2 基因, 构建其真核表达载体并在HEK293细胞中表达.方法:利用RT-PCR从大鼠脑组织总RNA中扩增出包含Sirt2编码区的cDNA片段, 产物纯化后T-A克隆连接至pMD20-T载体.以此为模板, 将该基因编码区克隆入真核表达载体pcDNA3.1myc-his(-)中, 转染HEK293细胞检测其表达.结果:测序证实所克隆的Sirt2编码区cDNA正确地插入pcDNA3.1myc-his(-)中, 经免疫荧光检测证实其在HEK293细胞中得到表达.结论:成功克隆了大鼠Sirt2 cDNA, 构建了其真核表达载体, 并在HEK293细胞中得到有效表达, 为进一步研究大鼠Sirt2的功能奠定了基础.     

Localization of parvalbumin mRNA in rat brain by in situ hybridization histochemistry

Summary Parvalbumin mRNA was localized in rat brain by in situ hybridization using a ³⁵S labelled rat parvalbumin cDNA and a synthetic oligodeoxyribonucleotide (corresponding to base sequences 140 to 183 of rat parvalbumin cDNA). Strongest hybridization signals were detected in the Purkinje cells of the cerebellum and in neurones of the reticular nucleus of the thalamus. Signal was also detected in the cerebral cortex, hippocampus, basal ganglia and brain stem in agreement with the distribution of parvalbumin immunoreactivity.     

p75真核表达载体的构建及其在PC-3细胞中的表达

目的：构建人神经生长因子低亲和力受体p75真核表达质粒,并在前列腺癌细胞PC-3中表达。方法：运用RT-PCR技术从人脑胶质细胞瘤组织中分离扩增编码人p75完整基因,与pcDNA载体重组,并通过酶切和测序鉴定;用脂质体介导法将重组质粒转染到PC-3细胞中,经G418筛选后,用RT-PCR、间接免疫荧光化学和细胞免疫组织化学法在转录和翻译两个水平上检测表达产物。结果：酶切和测序证实所获得的重组质粒包含p75完整基因;在转染pcDNA3．1( )-p75的PG3细胞中检测到转录和翻译产物。结论：成功地构建了p75真核表达质粒并在PC-3细胞中表达,为深入研究p75在前列腺癌中的生物学功能奠定了基础。     

胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体穿梭质粒的构建及鉴定

构建含大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)cDNA的重组腺病毒穿梭载体。提取新生大鼠纹状体总RNA,RTPCR克隆大鼠GDNFcDNA,产物回收后经HindⅢ和KpnⅠ双酶切,插入重组腺病毒穿梭载体pAdTrackCMV中,氯化钙法转染入大肠杆菌DH5α中,酶切、PCR及测序分析对重组质粒做进一步鉴定。结果显示大鼠GDNFcDNA被成功克隆,所克隆的GDNFcDNA与基因库注册的相同,以上结果说明本实验成功构建了GDNFcDNA重组腺病毒载体。     

Dehydroepiandrosterone 7-hydroxylase CYP7B: predominant expression in primate hippocampus and reduced expression in Alzheimer's disease

Neurosteroids such as dehydroepiandrosterone (DHEA), pregnenolone and 17beta-estradiol are synthesized by cytochrome P450s from endogenous cholesterol. We previously reported a new cytochrome P450 enzyme, CYP7B, highly expressed in rat and mouse brain that metabolizes DHEA and related steroids by hydroxylation at the 7alpha position. Such 7-hydroxylation can enhance DHEA bioactivity in vivo. Here we show that the reaction is conserved across mammalian species: in addition to mouse and rat, DHEA hydroxylation activity was present in brain extracts from sheep, marmoset and human. Northern blotting using a human CYP7B complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) probe confirmed the presence of CYP7B mRNA in marmoset and human hippocampus; CYP7B mRNA was present in marmoset cerebellum and brainstem, with lower levels in hypothalamus and cortex. In situ hybridization to human brain revealed higher levels of CYP7B mRNA in the hippocampus than in cerebellum, cortex, or other brain regions. We also measured CYP7B expression in Alzheimer's disease (AD). CYP7B mRNA was significantly decreased (approximately 50% decline; P<0.05) in dentate neurons from AD subjects compared with controls. A decline in CYP7B activity may contribute the loss of effects of DHEA with ageing and perhaps to the pathophysiology of AD.     

β-1,4半乳糖基转移酶-I在钳夹伤后大鼠坐骨神经中表达的变化

为了观察β-1,4-半乳糖基转移酶-I(β-1,4-galactosyltransferase-I,β-1,4-GalT-I)在正常和钳夹伤后大鼠坐骨神经中表达的变化,本研究采用RT-PCR方法,从小鼠坐骨神经中特异性地扩增β-1,4-GalT-I cDNA片段并将其克隆到pGEM-T载体。采用体外转录的方法合成地高辛标记的正、反义β-1,4-GalT-I RNA探针。通过原位杂交和图像分析的方法,观察β-1,4-GalT-I mRNA在正常和夹伤大鼠坐骨神经中的表达及其变化。结果表明:β-1,4-GalT-I mRNA在大鼠坐骨神经的髓鞘中表达,在夹伤坐骨神经后1~2d,β-1,4-GalT-I mRNA在坐骨神经的表达最高,于夹伤后1周开始下降,在夹伤后1个月恢复至正常水平。上述结果提示坐骨神经夹伤后β-1,4-GalT-I mRNA的表达发生变化,并且主要表达在坐骨神经的Schwann细胞。本研究结果为进一步分析β-1,4-GalT-I在周围神经再生中的调控机制奠定了基础。