泡状棘球蚴感染纯系大鼠肝移植免疫耐受的实验研究

目的:探讨感染泡球蚴的大鼠原位肝移植(Orthotopiclivertransplantation,OLT)后免疫系统的变化特点及其对移植物的影响。方法:分为3组:(1)A组为正常对照组(同系移植):健康(Lewis)LEW大鼠→健康LEW大鼠;(2)B组为对照组(非同系移植):健康BrownNorway(BN)大鼠→健康LEW大鼠;(3)C组为实验组:BN大鼠→LEW大鼠(感染泡球蚴后3个月)。术后LEW大鼠存活48h判定为肝脏移植手术成功。每组于术后1、3、5、7d4个时间点各处死2只LEW大鼠,取血清及移植的肝脏、脾脏。每组留8只用于观察生存期。结果:A组、B组、C组受体存活时间平均为(54.13±16.62)d、(4.75±1.58)d、(15.50±3.93)d,差异有统计学意义(P<0.05)。病理结果示:(1)A组无排斥反应现象;(2)B组排斥反应随移植天数的增加逐渐加重,术后1、3、5、7d分别出现0、1、2、3级排斥反应;(3)C组第7天出现1级排斥反应。结论:感染泡状棘球蚴后有利于同种异体移植物的存活;该模型为研究感染泡球的肝脏移植提供了良好的实验平台     

棘球蚴抗原B诱导小鼠皮肤移植免疫逃避的实验研究

目的:探索棘球蚴抗原B对小鼠皮肤移植的影响.方法:以近交系C57雄性小鼠60只为供体,Balb/c雄性小鼠100只为受体建立尾部皮肤移植实验模型.将100只受体小鼠随机分为5组,每组20只,于术后经肌肉注射给药.空白组给予生理盐水;实验组给予纯化后抗原B(100 μg/10 g);阳性对照组给予FK506(3 μg/10 g);手术Ⅰ组行同系间的皮肤移植(不予干预);手术Ⅱ组单纯切取与前几组相同大小的创口,不做移植操作.移植后观察移植皮片的存活时间及病理变化.结果:空白组皮片生存时间为(6.75±1.282) d,阳性对照组为(12.50±1.309) d,实验组为(10.25±1.669) d,三组生存时间比较,差异有统计学意义;空白组、阳性对照组、实验组移植皮片病理分析示差别有统计学意义(P<0.05).结论:棘球蚴抗原B作用于小鼠皮肤移植可以延长移植皮片的存活时间,病理结果显示其可以延缓移植排斥的发生.     

骆驼蓬籽治疗小鼠腹腔棘球蚴和泡球蚴的效果

作者报道了用含骆驼蓬(Peganum harmala L)籽提取液5％的药食喂养人工接种腹腔继发性棘球蝴和泡球蝴小鼠,疗程60～120d,实验结果发现对鼠体内的棘球蝴和泡球蚴均有抑制生长的作用。与对照组相比,对棘球蝴与泡球蚴囊的大小、数量及囊重进行了观察,囊重减轻率分别为59％～63％与54％(P<0.05)。光镜和透射电镜观察,可见用药组棘球蚴囊壁角质层与生发膜被损伤。     

泡状棘球蚴感染大鼠肝移植模型的建立

目的研究泡状棘球蚴感染大鼠原位肝移植模型的手术技巧及术后并发症的预防与处理。方法 50只BN大鼠作供体,50只泡状棘球蚴感染的Lewis大鼠为受体,通过"二袖套法"施行大鼠原位肝移植。用改进的二袖套法对大鼠行原位肝移植,移植中门静脉、肝下下腔静脉用袖套法进行吻合,肝上下腔静脉用缝合法吻合,胆道采用支架法进行胆道重建。结果建立大鼠原位肝移植模型共50例,术中未出现死亡,存活时间最短为5h,48h存活率为96%(48/50)。结论只有熟练地掌握手术技巧,细致耐心的操作,最大程度减少各种并发症的发生,才能得到良好的肝移植模型。     

昆明种小鼠棘球蚴病感染动物模型的建立

目的建立细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病小鼠的动物实验模型。方法4周龄昆明种小鼠60只,分为细粒棘球蚴病组和多房棘球蚴病组（每组20只）,并各设空白对照组（10只）,均雌雄各半。分别腹腔注射人源细粒棘球绦虫原头蚴悬液或鼠源泡球蚴原头蚴混悬液0．2mL（含庆大霉素250IU·mL^-1,原蚴头500个·mL^-1）,空白对照组腹腔注射0．2mL,含庆大霉素250IU·mL^-1,PBS液。通过病检和腹外观察,了解小鼠包囊的生长情况、重量、数量、直径和不育囊率。结果两种包虫病的感染率均为100％。第350天剖杀细粒棘球蚴原头节感染的昆明小鼠,不育囊率为100％,所有细粒棘球蚴包囊内未见原头蚴,雌、雄小鼠体内包囊的直径和数量差别无统计学意义;而第90天剖杀的泡球蚴感染小鼠动物模型不育囊率平均为15％,85％的感染泡球蚴病灶内含原头蚴。雌、雄小鼠体内泡球蚴包囊的体积大小和重量差异有统计学意义（P〈0．01）。结论雌鼠对多房棘球蚴感染比雄鼠更敏感,多房棘球蚴在小鼠体内生长快,适宜保种;雌鼠和雄鼠对细粒棘球蚴的敏感性无明显区别,细粒棘球蚴在小鼠体内生长慢,不宜保种。     

昆明种小鼠棘球蚴病感染动物模型的建立

目的建立细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病小鼠的动物实验模型。方法 4周龄昆明种小鼠60只,分为细粒棘球蚴病组和多房棘球蚴病组(每组20只),并各设空白对照组(10只),均雌雄各半。分别腹腔注射人源细粒棘球绦虫原头蚴悬液或鼠源泡球蚴原头蚴混悬液0.2 mL(含庆大霉素250 IU.mL-1,原蚴头500个.mL-1),空白对照组腹腔注射0.2 mL,含庆大霉素250 IU.mL-1,PBS液。通过病检和腹外观察,了解小鼠包囊的生长情况、重量、数量、直径和不育囊率。结果两种包虫病的感染率均为100%。第350天剖杀细粒棘球蚴原头节感染的昆明小鼠,不育囊率为100%,所有细粒棘球蚴包囊内未见原头蚴,雌、雄小鼠体内包囊的直径和数量差别无统计学意义;而第90天剖杀的泡球蚴感染小鼠动物模型不育囊率平均为15%,85%的感染泡球蚴病灶内含原头蚴。雌、雄小鼠体内泡球蚴包囊的体积大小和重量差异有统计学意义(P<0.01)。结论雌鼠对多房棘球蚴感染比雄鼠更敏感,多房棘球蚴在小鼠体内生长快,适宜保种;雌鼠和雄鼠对细粒棘球蚴的敏感性无明显区别,细粒棘球蚴在小鼠体内生长慢,不宜保种。     

(动物模型)肝移植免疫耐受的研究以及三维重建技术在肝泡状棘球蚴治疗中的应用

泡型包虫病治疗较为棘手,特别是晚期肝泡型包虫病,往往侵犯肝脏内的大血管及胆道,很难根治性切除,肝移植可能是其唯一有效的治疗手段。泡球蚴肝移植不同于以往疾病条件下的肝移植,因为此时的肝移植患者既是受体,又是宿主,所以在患者体内可能会同时发生两种免疫学现象,一是肝移植排斥反应,另外一个是寄生虫免疫逃避现象。本课题组建立了泡状棘球蚴感染大鼠肝移植模型,对泡状棘球蚴感染能否延长大鼠肝移植物的存活以及泡状棘球蚴感染对宿主免疫系统的影响     

泡状棘球蚴感染对大鼠肝移植物存活的影响及机制探讨

目的探讨泡状棘球蚴感染对大鼠肝移植物存活的影响及其可能的机制。方法建立BN大鼠泡状棘球蚴感染模型,将实验大鼠分为实验组(LEW大鼠→感染泡球蚴3个月的BN大鼠)和对照组(健康LEW大鼠→健康BN大鼠),利用双袖套发建立肝移植模型,分别在移植术后第1、3、5、7天取肝脏组织,采用免疫组织化学的方法检测肝移植后排斥反应;采用流式细胞仪检测外周血中T淋巴细胞标志物CD4+、CD8+、CD28+的表达,利用半定量RTPCR的方法检测趋化因子Fractalkine(FKN)的表达。结果实验组移植物存活时间[(15.5±3.93)d]明显长于对照组[(4.75±1.58)d],差异有统计学意义(P<0.05);免疫组化结果示实验组排斥反应较对照组出现较晚且程度较轻;实验组CD4+、CD8+及CD28+的表达[(41.35±4.58)%、(21.94±2.61)%、(17.76±4.16)%]较对照组[(51.28±6.36)%、(33.85±3.02)%、(23.08±4.74)%]低,差异有统计学意义(P<0.05);实验组FKN mRNA表达较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论泡状棘球蚴感染能够延长大鼠肝移植物的存活,泡状棘球蚴感染对宿主免疫系统尤其对效应T淋巴细胞进行抑制是可能的途径之一。     

半乳凝集素-9在诱导大鼠肝移植免疫耐受中的作用

目的通过观察半乳凝集素-9(Galectin-9)在大鼠肝移植急性排斥模型中的作用,探讨其在诱导肝移植免疫耐受中的机制。方法建立Lewis到BN大鼠肝移植急性排斥反应模型(n=30),受体分为3组,每组10只。转染组于肝移植冷缺血期经门静脉转染重组galectin-9腺病毒质粒2 ml,空质粒组灌注2 ml空腺病毒载体,对照组灌注2 ml生理盐水。术后7 d各组处死5只大鼠,余观察生存率,采用Banff分级观察移植物排斥程度;实时荧光定量PCR检查肝组织Galectin-9、T-bet、RORγt mRNA表达水平;Western blot检测肝组织IFN-γ及IL-17蛋白表达水平。结果术后7 d转染组Banff评分Ⅰ～Ⅱ级,空质粒组及对照组为Ⅲ级;转染组、空质粒组及对照组Galectin-9 mRNA水平依次为(1.14±0.05)、(0.46±0.03)、(0.49±0.07),转染组Galectin-9 mRNA水平较其余2组明显增加(P<0.05)。转染组、空质粒组及对照组T-bet及RORγt mRNA表达水平分别为(0.27±0.07)、(1.26±0.12)、(1.31±0.08)和(0.57±0.13)、(1.57±0.09)、(1.58±0.07),转染组T-bet及RORγt mRNA表达水平明显低于其余2组(P<0.05);转染组、空质粒组及对照组IFN-γ及IL-17蛋白表达水平分别为(0.39±0.06)、(1.28±0.11)、(1.47±0.05)和(0.64±0.07)、(1.52±0.05)、(1.67±0.04),转染组IFN-γ及IL-17蛋白表达水平低于空质粒组及对照组(P<0.05)。结论 Galectin-9通过清除Th1/Th17细胞诱导肝移植免疫耐受形成。     

同系或同种胸腺与异种胸腺混合移植诱导T细胞免疫耐受的实验研究

目的 探讨同系或同种胸腺与异种胸腺混合移植诱导移植免疫耐受而不发生自身免疫性疾病的可行性。方法 BALB／c裸小鼠的肾包膜下植入胸腺建立异种、同系与异种混合、同种与异种混合胸腺移植模型。4个月后，用流式细胞仪技术检测受者裸小鼠外周血中CD3^＋CD4^＋T细胞，用单向混合淋巴细胞培养了解受者T细胞对ConA以及同种异种淋巴细胞的反应性，异基因皮肤移植观察皮肤移植物存活期。用ELISA法检测受体血清中抗DNA自身抗体。结果 胎胸腺移植4个月后，受者裸小鼠中CD3^＋CD4^＋T细胞重建良好；T细胞对ConA以及无关的SD鼠异种淋巴细胞的反应性强，而对移植胸腺供体来源的淋巴细胞不发生增殖反应；受者对移植胸腺供体来源鼠皮肤移植物不发生排斥，而对无关的SD鼠皮肤移植物发生排斥。异种胸腺移植组发生消耗性疾病死亡高，抗DNA自身抗体明显高于混合胸腺移植组。结论 同系或同种异种胎胸腺混合移植可诱导受者T细胞对供者移植物的免疫耐受。     

非清髓性预处理联合髓腔内骨髓细胞输注诱导免疫耐受的实验研究

目的本研究通过非清髓性预处理方案联合髓腔内骨髓移植建立异基因小鼠免疫耐受模型,并探讨其诱导耐受的机理.方法受鼠C57BL/6(B6)于第0天接受60Coγ射线全身照射(TBI,550-cGy),4 h内输注雄性BALB/C(H2d)小鼠来源的骨髓细胞,2 d后腹腔注射环磷酰胺(CTX,200 mg·kg-1).通过皮肤移植、混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction, MLR)检测耐受状态,并应用体外过继转移实验、IL 2逆转实验等探讨免疫耐受机制.结果经骨髓移植的B6小鼠对BALB/C小鼠的皮肤移植物平均存活时间超过300d,较空白组明显延长(P＜0.001);MLR结果证明B6小鼠获得供体特异性耐受,该耐受可以被IL 2逆转且可被过继转移;所有受鼠均未出现GVHD表现.结论非清髓预处理联合髓腔内骨髓移植可以有效诱导异基因小鼠的免疫耐受.     

Transplantation tolerance mediated by regulatory T cells in mice

Background With potent suppressive effect on responder T cells, CD4+CD25+ regulatory T (Treg) cells have become the focus of attention only recently and they may play an important role in transplantation tolerance. However, the mechanism of action is not clear. This study was designed to assess the possibility of using CD4+CD25+ Treg cells to induce transplantation tolerance and to investigate their mechanism of action.Methods CD4+CD25+ Treg cells were isolated using magnetic cell separation techniques. Mixed lymphocyte reactions were used to assess the ability of Treg cells to suppress effector T cells. Before skin transplantation, various numbers of CD4+CD25+Treg cells, which have been induced using complex skin antigens from the donor, were injected into the host mice either intraperitoneally ［0.5×10(5), 1×10（5）, 2×10（5）, 3×10（5）, 4×10（5）, or 5×10（5）］ or by injection through the tail vein ［5×10（3）, 1×10（4）, 2×10（4）, 5×10（4）, 1×10（5）, 2×10（5）］. Skin grafts from two different donor types were used to assess whether the induced Treg cells were antigen-specific. The survival time of the allografts were observed. Single photon emission computed tomography was also used to determine the distribution of Treg cells before and after transplantation. Results Treg cells have suppressive effect on mixed lymphocyte reactions. Grafts survived longer in mice receiving CD4+CD25+ Treg cell injections than in control mice. There was a significant difference between groups receiving intraperitoneal injection of either 2×10（5） or 3×10（5） CD4+CD25+Treg cells and the control group (P&lt;0.05, respectively). Better results were achieved when Treg cells were injected via the tail vein than when injected intraperitoneally. The transplantation tolerance induced by CD4+CD25+ Treg cells was donor-specific. Analysis of the localization of Treg cells revealed that Treg cells mainly migrated from the liver to the allografts and the spleen.Conclusions CD4+CD25+Treg cells can induce donor-specific transplantation tolerance. Cell-to-cell contact may be the primary mechanism by which Treg cells act on effector T cells.     

免疫抑制剂预处理对同种异体气管移植犬免疫耐受的影响

目的：诱导受体犬对经免疫抑制剂预处理的供体犬移植气管形成免疫耐受。 方法：实验用犬20只,随机选择4只做供体,其中2只经预处理犬(实验组供体)(术前6 h给予环磷酰胺750 mg、甲基强的松龙2 g静脉注射)的气管切成8段,每段长3 cm,移植入实验组受体内不用免疫抑制治疗;另外2只未经预处理犬(对照组供体)8段气管移植入对照组受体内。其余16只犬随机均分至2个受体组,分别将未经和经免疫抑制剂预处理的供体犬气管段移植到对照组和实验组受体犬腹腔大网膜包埋3周后取出,行病理学检查两组气管移植术后免疫排斥反应。 结果：实验组8段包埋气管中,除1段出现重度排斥反应外均为轻度排斥反应;对照组8段包埋气管中,3段出现轻度排斥反应,3段中度排斥反应,2段重度排斥反应;两组间气管移植术后免疫排斥反应比较差异无显著性（P>0.05）。 结论：经免疫抑制剂预处理的供体,能诱导受体对同种异体移植的气管形成免疫耐受;供体预处理与未经预处理而术后常规应用免疫抑制剂治疗有相同的效果。     

CTLA4 Ig在诱导小鼠心脏移植免疫耐受中的作用

目的　通过建立小鼠心脏移植模型 ,探讨CTLA4Ig在免疫抑制和诱导免疫耐受中的作用。方法　建立小鼠心脏移植模型 ,供体分别为DBA/2和 6 15新生鼠心脏 ,受体为BALB/c小鼠 ,移植后分别予以CTLA4Ig 0 .1、1、5mg·kg-1·d-1,治疗 1周 ,观察不同剂量CTLA4Ig对新生鼠移植心脏存活时间的影响 ;BALB/c小鼠首次移植 2周后再次移植DBA/2或 6 15新生鼠心脏 ,观察CTLA4Ig对再次移植心脏存活的影响。结果　与对照组相比 ,CTLA4Ig 0 .1mg·kg-1·d组 ,移植心脏的存活时间不能延长 ,CTLA4Ig 1mg·kg-1·d和 5mg·kg-1·d-1组能显著延长心脏的存活时间 ,但两组间差异不显著 (P >0 .0 5 )。再次移植 6 15心脏各组 ,移植心脏的存活时间均无显著延长 ,而再次移植DBA/2新生鼠心脏 ,CTLA4Ig 1mg·kg-1·d-1和 5mg·kg-1·d-1组 ,其移植心脏的存活时间仍然能显著延长 (P <0 .0 1)。结论　CTLA4Ig能延长新生鼠心脏移植存活时间 ,且能诱导抗原特异性免疫耐受     

应用CD4+CD25+Treg细胞诱导大鼠肾移植免疫耐受的研究

目的 应用供体抗原特异性CD4 CD25 Treg细胞诱导移植免疫耐受,抑制大鼠肾移植慢性排斥反应.方法 以SD、Wister大鼠分别为供、受体建立同种异体肾移植慢性排斥反应动物模型;受体脾细胞悬液同供体肾组织抗原孵育培养,诱导获得对供体抗原的特异性;采用MACS法分选具有供体抗原特异性的CD4 CD25 T细胞,FACS流式细胞法检测分选的CD4 CD25 T细胞及CD4 CD25 Treg细胞纯度;获得之供体抗原特异性CD4 CD25 Treg细胞于同种异体肾移植术后2、4、6、8、10周,分别经尾静脉注射入受者体内(实验组,n=12),选取未注射组为对照(n=12).观察两组移植肾脏存活时间;术后第10、40、80天MTT法检测比较两组受体脾细胞对供体抗原刺激反应程度;术后第10、20、40、60、80天分别监测各组血肌酐水平.结果 FACS流式细胞法检测分选的CD4 CD25 T细胞得率为4.13%,分离纯度为73.34%;CD4 CD25 Treg细胞纯度为65.22%.所分选之CD4 CD25 Treg细胞成功获得供体抗原特异性,对供体抗原的抑制率(IR)为85.4%.移植肾存活时间:治疗组移植肾存活时间为(98.83±6.66)d,显著长于对照组的(78.25±4.71)d,组间差异有统计学意义(P＜0.05);术后第40、80天治疗组脾细胞对供体抗原刺激反应程度均明显低于对照组,两组间差异有统计学意义(P＜0.05).术后第20、40、60、80天对照组血肌酐指标明显高于治疗组,同治疗组间差异有统计学意义(P＜0.05).结论 供体抗原特异性CD4 CD25 Treg细胞可特异性抑制受体对供体抗原的免疫反应,有效抑制了移植肾慢性排斥反应的发生.     

小鼠对大鼠异种皮肤移植耐受的诱导

目的探索更为温和的适合临床应用的诱导异种移植耐受的方案。方法给小剂量照射（ 300 rad）的 C57BL/6 (B6)小鼠静脉注射抗小鼠 CD4单抗 0.5 ml后输注 Lewis大鼠骨髓细胞 ,并联合应用腹腔注射环磷酰胺诱导耐受。于耐受诱导后 30 d对受体小鼠作耐受状态的检查,包括供体特异性皮肤移植、混合淋巴细胞反应（ MLR）及迟发型超敏反应（ DTH）。并通过过继转移实验、外源 IL- 2对耐受小鼠供体特异性 MLR的影响等进一步探讨耐受形成的机制。结果 Lewis大鼠的皮肤移植物在耐受 B6小鼠中存活期特异性延长, MLR及 DTH检查证明 B6小鼠对 Lewis大鼠的脾细胞产生特异性耐受,对无关第三者 DA大鼠及 BALB/c小鼠的脾细胞仍表现出强烈的免疫应答。体内外过继转移实验表明 ,耐受不能被转移 ,未发现抑制细胞的存在。耐受小鼠供体特异的 MLR可以被外源 IL- 2逆转 ,说明耐受主要不是克隆排除,而与克隆不应答有关。结论应用低剂量照射、骨髓移植、环磷酰胺及抗 CD4单抗等方法法可以有效诱导出小鼠对大鼠的移植耐受。     

门静脉注射供体脾细胞诱导免疫耐受机制的研究

目的：利用大鼠异心脏移植模型,探讨门静脉注射供体脾细胞诱导免疫耐受的机制。方法：受体鼠移植术前经门静脉注射供体脾细胞并联合短期应用环孢菌素A。采用MTT法检测术后受体鼠脾淋巴细胞白细胞介绍2（IL－2）产生水平及NK细胞活性,采用ELISA法检测受体鼠γ-干扰素（γ-IFN）表达水平。结果：门静脉注射供体脾细胞显著抑制受体脾淋巴细胞IL－2、γ-IFN的表达及NK细胞活性,联合应用环孢菌素A抑制效应更显著。结论：抑制IL-－NK－γ－IFN免疫网络功能可能是门静脉注射供体脾细胞诱导免疫耐受的机制之一。