脂多糖对人脐静脉内皮细胞ET-1、eNOS、iNOS mRNA表达的影响

目的：观察脂多糖（LPS）对人脐静脉内皮细胞ET-1、eNOS、iNOSmRNA表达的影响，在分子水平上进一步探讨LPS影响人脐静脉内皮细胞分泌ET-1、NO的机制。方法：选用体外培养的第3代人脐静脉内皮细胞，以100 μg/L浓度的LPS与之共孵育6 h。提取总RNA，运用半定量RT-RCR的方法，对ET-1、eNOS、iNOS mRNA的表达情况进行分析。结果：ET-1的灰度比值分别为：正常对照组0.82，LPS组1.32；eNOS的灰度比值分别为：正常对照组1.20，LPS组0.65；iNOS组的灰度比值分别为：正常对照组0.20，LPS组0.19。结论：低浓度的LPS对人脐静脉内皮细胞ET-1 mRNA的表达有促进作用，对eNOS mRNA的表达有抑制作用，对iNOS mRNA的表达则无显著作用。     

低氧及一氧化氮对SW480细胞缺氧诱导因子-1α、VEGF及iNOS 表达的初步研究

目的：观察一氧化氮(NO)对低氧培养的人结肠腺癌细胞株SW480中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响。方法： 运用免疫细胞化学检测HIF-1α、VEGF、iNOS蛋白表达，Western blot检测HIF-1α蛋白表达。原位杂交法检测HIF-1α mRNA表达。结果： 免疫细胞化学染色图像分析结果显示：低氧组细胞HIF-1α、VEGF和iNOS蛋白表达水平显著高于常氧组(P<0.01，P<0.01，P<0.05)和低氧＋genistein（三羟基异黄酮）组（P<0.01，P<0.05，P<0.05）。低氧条件下，SNP（硝普钠）显著抑制HIF-1α、VEGF蛋白的表达,但对iNOS表达无明显影响；NOC5（NO发生剂）诱导HIF-1α、VEGF、iNOS蛋白的表达；NO抑制剂L-NAME(N-硝基精氨酸甲酯)则抑制3者的表达。 Western blot结果显示：低氧培养条件下，HIF-1α呈强表达，给予genistein能显著抑制其表达；而给予SNP和L-NAME后，蛋白表达量减少，给予NOC5，则蛋白表达增强。原位杂交结果显示：常氧组、低氧组及低氧＋genistein组、低氧＋SNP组、低氧＋NOC5组、低氧＋L-NAME组HIF-1α mRNA表达A值组间均无显著差异。结论： 低氧诱导SW480细胞HIF-1α蛋白表达量增高，从而上调VEGF和iNOS表达。低氧条件下，NO供体SNP抑制SW480细胞HIF-1α蛋白及VEGF表达，而另一种供体NOC5则促进HIF-1α表达，两种供体对HIF-1表达的影响可能存在不同的机制。     

OX-LDL诱导内皮细胞的条件培养基对内皮细胞LPO、NO和iNOS的影响

为了探讨受损内皮细胞的自分泌和旁分泌对受损内皮细胞本身的影响 ,本文收集正常内皮细胞条件培养基和用氧化型低密度脂蛋白 (OX-L DL )诱导内皮细胞的条件培养基分别作用于正常内皮细胞和氧化受损内皮细胞 ,检测其脂质过氧化物和一氧化氮代谢及诱导型一氧化氮合酶表达的变化。得到的结果是 :(1)正常内皮细胞的条件培养基和 OX-LDL 诱导的内皮细胞条件培养基对正常内皮细胞和受损内皮细胞脂质过氧化代谢有明显下调作用 (P<0 .0 5 ) ,但 OX-LDL 诱导的内皮细胞条件培养基的下调作用更为明显 (P<0 .0 1)。 (2 )正常内皮细胞的条件培养基和 OX-LDL 诱导的内皮细胞条件培养基对正常内皮细胞 NO的代谢表现为抑制作用 (P>0 .0 5 ) ,而对受损内皮细胞有轻微上调作用 (P>0 .0 5 )。 (3 )正常内皮细胞的条件培养基和 OX-L DL诱导的内皮细胞条件培养基对正常内皮细胞诱导型一氧化氮合酶的表达表现出抑制作用 ,而对受损内皮细胞诱导型一氧化氮合酶的表达有上调作用 (P>0 .0 5 )。本文结果提示 :正常和受到氧化损伤内皮细胞的自分泌和旁分泌作用对正常和受损内皮细胞的脂质过氧化物的代谢均有下调作用 ,对 NO的代谢和诱导型一氧化氮合酶的表达则起抑制作用 ,而对受损内皮细胞有轻微上调作用。这种调节作用可能是内皮     

慢性缺氧对肺动脉内皮细胞Ⅲ型一氧化氮合酶mRNA表达的影响

目的和方法:采用原位杂交技术结合图象分析检测常氧(PO₂21.3kPa)及慢性缺氧(PO₂5.3±0.7kPa)培养的猪肺动脉内皮细胞Ⅲ型一氧化氮合酶mRNA的表达及其对急性缺氧刺激反应的变化。结果:常氧条件培养的肺动脉内皮细胞急性缺氧12h,NOSⅢmRNA表达明显增加(2、4、6代分别比缺氧前增加48%、125%、119%,P＜0.05);慢性缺氧条件下培养的肺动脉内皮细胞急性缺氧12h,NOSⅢmRNA表达亦明显增加(分别比急性缺氧前增加92%、245%、565%,P＜0.01)。其增加的幅度在慢性缺氧培养组均高于同代常氧组,且随着缺氧时间的延长,这种差别更显著。结论:慢性缺氧增强了肺动脉内皮细胞Ⅲ型一氧化氮合酶基因对急性缺氧的反应,这可能在慢性缺氧时肺血管对缺氧的反应性降低中,具有重要作用。     

组胺和低氧对猪肺动脉和主动脉内皮细胞eNOS基因表达的影响

目的：观察组胺和低氧对培养的猪肺动脉和主动脉内皮细胞eNOS mRNA和蛋白质表达的影响。方法： 采用半定量RT-PCR和免疫细胞化学的方法。结果： （1）组胺可使肺动脉内皮细胞eNOS mRNA表达增加，在10-5mol/L作用24 h达高峰，为对照组的178.2%±7.7%(P<0.01)，eNOS蛋白质表达也上调，为对照组的173%±47%（P<0.01），主动脉内皮细胞与肺动脉内皮细胞相似，可在组胺10-6mol/L作用24h达高峰，为对照组的177.4%±14.2%（P<0.01），eNOS蛋白质表达也上调，为对照组的165%±54%（P<0.01）；（2）急性低氧12 h肺动脉内皮细胞eNOS mRNA表达增加，24 h达高峰，为对照组的151.0%±9.1%（P<0.01）；蛋白质表达水平也增高到常氧对照组的216%±44%（P<0.01），而主动脉内皮细胞eNOS mRNA与蛋白质均未受低氧影响。结论： 组胺可使肺动脉和主动脉内皮细胞eNOS表达增加，但两者反应无明显差异；低氧使肺动脉内皮细胞eNOS表达上调，而对主动脉内皮细胞无明显影响。     

VEGF基因对缺氧诱导的内皮细胞凋亡和坏死的影响

采用缺氧诱导体外培养血管内皮细胞凋亡模型, 用脂质体介导的基因转移法将含血管内皮生长因子(VEGF)cDNA的真核表达载体pSVI21 导入血管平滑肌细胞(VSMC) 中, 取此VSMC条件培养液, 再行血管内皮细胞(VEC) 培养, 用透射电镜、原位末端标记和流式细胞仪分析法观察VEGF对凋亡产生的影响。结果发现: 缺氧组凋亡发生率明显增加, 而加用转基因VSMC条件培养液后凋亡发生率明显减少, 并可减轻缺氧致内皮细胞超微结构的改变。结果表明: VEGF可减少缺氧诱导血管内皮细胞凋亡的产生, 保持血管内皮细胞的完整, 有益于防止或减少缺氧时内皮受损及内皮功能紊乱     

胃癌及癌前病变组织中VEGF和iNOS蛋白的表达

目的:观察胃癌及癌前病变(肠上皮化生、不典型增生)组织中血管内皮细胞生长因子(VEGF)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达,探讨其临床意义。方法:选择我院2008-01/2010-01手术切除和内镜活检的胃黏膜标本150例,其中胃黏膜肠上皮化生组50例,不典型增生组50例,胃癌组50例;另40例来自胃镜胃黏膜活检的正常胃黏膜标本作为对照组。免疫组化染色法比较各组VEGF和iNOS的表达。结果:胃癌组VEGF和iNOS的表达高于其余3组(P<0.01);肠上皮化生组与不典型增生组的表达无显著差异;但均明显高于对照组(P<0.05)。结论:胃镜黏膜组织活检VEGF和iNOS的表达与组织恶变程度相关,有利于胃癌的早期诊断。     

葛根素预处理上调内皮型一氧化氮合酶的表达减轻人脐静脉内皮细胞缺氧/复氧损伤

 目的:探讨葛根素(puerarin,PUE)预处理对缺氧/复氧(hypoxia reoxygenation,H/R)损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的保护作用。方法:HUVECs随机分为正常对照(control)组、H/R组、单纯PUE组和PUE+H/R组(1.0×10^-3 mol/L PUE预处理24 h后进行H/R)。采用Western blot方法检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白的表达,化学比色法检测组成型一氧化氮合酶(cNOS)的活性,TUNEL法检测细胞凋亡。此外,在PUE预处理前使用ERK蛋白激酶抑制剂U0126(1.0×10^-5 mol/L)或PI3K/Akt蛋白激酶抑制剂LY294002(5.0×10^-5mol/L)处理细胞1 h,再进行H/R。结果:与control组相比,H/R组的eNOS蛋白表达水平降低(P<0.05),PUE预处理上调eNOS蛋白的表达水平(P<0.05),该上调作用均可被U0126及LY294002抑制(P<0.05);与control组相比,H/R组的cNOS活力下降(P<0.05),PUE预处理组的cNOS活力增加(P<0.05);与control组相比,H/R组细胞凋亡指数显著增大(P<0.01),PUE预处理组的细胞凋亡指数减小(P<0.01)。结论:H/R可使HUVECs受损伤,eNOS蛋白表达及活性降低,细胞凋亡增加。PUE预处理可通过ERK1/2信号通路和PI3K/Akt信号通路上调HUVECs的eNOS蛋白表达,增强eNOS活性,减少细胞凋亡,发挥内皮细胞保护作用。     

人乳腺癌组织中VEGF-C和iNOS的表达及意义

目的研究人乳腺癌组织中血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C)和诱生型一氧化氮合酶(inducible nitiric oxide synthase,iNOS)的表达并探讨两者的相关性。方法采用免疫组织化学SABC法检测50例乳腺癌组织和癌旁正常乳腺组织中VEGF-C和iNOS的表达,并分析其相互关系。结果 VEGF-C和iNOS在乳腺癌组织中均呈强阳性表达,而在癌旁正常组织则不表达。VEGF-C的表达与患者年龄、肿瘤大小、分化程度及临床分期无关(P>0.05),而与淋巴结转移密切相关(P<0.05)。iNOS的表达与患者年龄及肿瘤大小无关(P>0.05),而与分化程度、临床分期及淋巴结转移密切相关(P<0.05)。VEGF-C和iNOS的表达呈正相关(γ=0.43,P<0.05)。结论 VEGF-C和iNOS蛋白在乳腺癌的发生中具有协同作用,两者可能共同参与肿瘤淋巴管的生成。     

同型半胱氨酸对人脐静脉内皮细胞一氧化氮合酶基因表达的影响

目的:研究同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)对培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)一氧化氮合酶(eNOS)基因表达的影响。方法:采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学方法,检测不同浓度Hcy(10μmol.L-1、30μmol.L-1、100μmol.L-1和300μmol.L-1)与HUVEC共同培养后,细胞内eNOSmRNA和蛋白表达、eNOS活性和一氧化氮(NO)生成的变化。结果:HUVEC经不同浓度Hcy处理24h后,其细胞内eNOS蛋白表达减少,活力降低,NO生成抑制。但只有100μmol.L-1Hcy与HUVEC作用72h时,才引起eNOSmRNA表达的减少。结论:提示Hcy可能通过抑制eNOS转录、蛋白表达及eNOS活力减少内皮源性NO的生成。     

低氧对人脐静脉内皮细胞一氧化氮和内皮素-1的生成及诱导型一氧化氮合酶mRNA表达的影响

目的：通过观察低氧对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分泌一氧化氮(NO）、内皮素-1(ET-1)以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA 表达的影响，探讨低氧性肺动脉高压(HPH)形成的机制。 方法： 在离体培养人脐静脉内皮细胞基础上，采用硝酸还原酶和放射免疫分析方法检测了低氧（3％O2）培养6 h、12 h和24 h人脐静脉内皮细胞分泌NO和ET-1的变化，同时运用半定量RT-PCR对iNOS mRNA表达情况进行分析。 结果： 低氧组各时点培养液中NO2-/NO3-和ET-1水平显著高于常氧组(P<0.01)，同时观察到iNOS基因mRNA的表达也相应增高(P<0.01)。 结论： 低氧能刺激人脐静脉内皮细胞生成释放NO和ET-1, NO生成增多与低氧正调iNOS基因mRNA的表达有关。     

葡萄糖对人脐静脉内皮细胞蛋白C受体表达的影响及吡格列酮的干预作用

目的:研究葡萄糖对人脐静脉内皮细胞蛋白C受体(EPCR)mRNA 表达的影响,以及吡格列酮的干预作用。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),分别以流式细胞术和RT-PCR技术确认HUVECs膜上EPCR的表达水平和 mRNA 水平的表达。再分别以含不同浓度D-葡萄糖(5、10、30、50 mmol/L)的培养基以及含吡格列酮(5、10、20 μmol/L)或不含吡格列酮的高糖(50 mmol/L)培养基孵育HUVECs 24 h,行剂量和时间依赖性实验,并采用实时定量PCR技术测定HUVECs细胞 EPCR mRNA 的表达。结果:随着培养基D-葡萄糖浓度的增加,HUVECs培养24 h后其EPCR mRNA 的表达逐渐下调。在采用吡格列酮干预后, 50 mmol/L高糖处理的HUVECs EPCR mRNA 表达的下调得到明显改善。结论:(1)EPCR 在HUVECs上高表达,高糖可通过下调EPCR mRNA 的表达而损伤内皮细胞功能。(2)吡格列酮可阻止高糖诱导的HUVECs EPCR mRNA表达的下调,从而保护内皮细胞功能。     

脑动脉内皮细胞缺氧时内皮型一氧化氮合酶基因表达的变化及蛋白激酶C的作用

目的：研究缺氧时脑动脉内皮细胞(CAECs)内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因表达的变化，并探讨可能的分子机制。方法： 分别采用RT-PCR和蛋白质免疫印迹技术检测原代培养的猪脑动脉内皮细胞缺氧2、6、12、24、48 h后eNOS mRNA和蛋白质表达的变化，并观察蛋白激酶C(PKC)抑制剂对缺氧24 h引起的eNOS mRNA和蛋白质变化的影响。加入转录抑制剂放线菌素D后观察缺氧24 h对eNOS mRNA稳定性的影响。结果：缺氧2 h后脑动脉内皮细胞eNOS mRNA和蛋白质表达均增加，12 h达到高峰，约分别为常氧组的2.5倍和2.0倍，缺氧48 h仍高于常氧组。缺氧对eNOS mRNA稳定性无明显影响。选择性PKC抑制剂BIM I(1 μmol/L)、G6983(1 μmol/L)均能降低缺氧24 h所引起的eNOS基因表达的上调。结论： 脑动脉内皮细胞缺氧时可通过PKC信号途径上调eNOS基因的表达，并可能由此介导缺氧时脑血管的扩张反应，发挥其神经保护作用。     

同型半胱氨酸抑制人脐静脉内皮细胞eNOS活性

目的研究不同浓度同型半胱氨酸(Hcy)作用不同的时间对人脐静脉内皮细胞中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性的影响机制。方法取2～3代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)与不同浓度Hcy孵育以及孵育不同时间。用Western blot和实时荧光定量RT-PCR法检测热休克蛋白90(HSP90)、蛋白激酶B(Akt)蛋白表达,小凹蛋白(Caveolin-1)、eNOS、P-eNOS蛋白及mRNA的表达,二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)mRNA表达。结果与静息和激活状态下的对照组相比,在Hcy作用下,Caveolin-1蛋白的表达上调(P<0.05),而Akt蛋白的表达下调(P<0.05),且均呈浓度、时间依赖性。eNOS蛋白的表达无明显改变。Hcy对其他检测指标无影响。结论 Hcy引起的eNOS活性降低与增强Caveolin-1蛋白表达使其与eNOS藕联增加,减少HSP90、Akt和eNOS复合物的形成,进而抑制了eNOS的活性有关。     

辛伐他汀对香烟烟雾提取物诱导的人脐静脉内皮细胞表达sEPCR和mEPCR的影响

目的: 研究辛伐他汀对香烟烟雾提取物(CSE)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs) 表达可溶性内皮细胞蛋白C受体(sEPCR)和膜联内皮细胞蛋白C受体(mEPCR)的干预作用。方法: 体外培养的4~6代HUVECs 随机分为对照组、5%CSE组、不同浓度辛伐他汀组及辛伐他汀干预组,辛伐他汀组分别加入50、100、200 μmol/L辛伐他汀液孵育24 h,辛伐他汀干预组先以50、100、200 μmol/L辛伐他汀预处理细胞2 h,再与5%CSE孵育24 h。收集各组细胞及上清液,ELISA法检测上清液中sEPCR蛋白含量,实时定量PCR法检测各组细胞中mEPCR mRNA的表达。结果: (1)5%CSE组sEPCR蛋白含量高于对照组,mEPCR mRNA表达低于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05);(2)100 μmol/L与200 μmol/L辛伐他汀组sEPCR蛋白含量均高于对照组,低于5%CSE组,其mEPCR mRNA表达均低于对照组,高于5%CSE组,差异均有统计学意义(均P<0.05);(3)各辛伐他汀干预组sEPCR蛋白含量均低于5%CSE组,但高于对照组及相应浓度的辛伐他汀组;相反,各辛伐他汀干预组mEPCR mRNA表达均高于5%CSE组,低于对照组及相应浓度的辛伐他汀组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论: 在体外,辛伐他汀通过上调HUVECs mEPCR mRNA的表达,降低sEPCR的分泌,对CSE介导的内皮细胞凝血功能障碍可能具有一定的改善作用。     

腺苷促进人脐静脉内皮细胞bFGF的表达

目的：探讨腺苷对人脐静脉内皮细胞合成和分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)蛋白及bFGF mRNA的影响。 方法： 免疫组化法检测bFGF蛋白质表达；逆转录-聚合酶链反应测定bFGF mRNA。 结果： 对照组（腺苷0 mol/L）bFGF染色阳性细胞少，染色程度轻；10-4mol/L、10-6 mol/L腺苷组作用48 h后阳性细胞多，染色深，平均吸光度值与对照组比较有显著差异(P<0.05)，10-8mol/L、10-10mol/L腺苷组与对照组比较无显著差异(P>0.05)；RT-PCR分析显示10-4mol/L、10-6mol/L腺苷组bFGF mRNA表达显著高于对照组(P<0.05)；10-8mol/L腺苷组与对照组bFGF mRNA表达无显著差异(P>0.05)。 结论： 腺苷可能部分通过促进内皮细胞合成和表达bFGF而实现其促进内皮细胞生长和血管新生的作用。