小鼠GM─CSFcDNA重组逆转录病毒的构建及在成纤维细胞中的表达

为探索粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因治疗的可能性，将小鼠ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ重组于缺陷型逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，重组质粒转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，经Ｇ４１８筛选，用其抗性克隆培养上清液感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３，筛选出抗Ｇ４１８的转化细胞克隆，用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明转化细胞的基因组中整合有ＮｅｏＲ基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因，原位杂交显示转化细胞有较强的ＧＭ－ＣＳＦｍＲＮＡ表达，用骨髓细胞增殖法和ＣＦＵ－ＧＭ检测也表明转化细胞分泌有较多的ＧＭ－ＣＳＦ，该研究为下一步在动物体内进行ＧＭ－ＣＳＦ基因治疗的研究奠定基础     

基因转移人TGF-β1在NIH/3T3细胞中表达鉴定

目的：研究转移人转化生长因子β１（ＴＧＦ－β１）在真核细胞系中蛋白表达。方法：借助真核质粒表达载体,将人ＴＧＦ－β１转移入小鼠成纤维细胞株（ＮＨ／３Ｔ３）细胞中,经Ｇ４１８筛选,克隆扩增,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ、ＰＣＲ、ＰＴ－ＰＧＲ鉴定,并经水貂肺上皮细胞（ＣＣＬ－６４）生长抑制法,对克隆细胞分泌ＴＧＦ－β１蛋白进行活性检测。结果：证实了重组人ＴＧＦ－β１基因在ＮＩ     

逆转录病毒介导的TNFa基因在胶质瘤细胞系（C6）中的表达及对肿瘤细胞恶性生长的影响

利用逆转录病毒载体ＬＸＳＮ构建了含有完整编码ＴＮＦｃＤＮＡ的重组逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ，用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ将重组质粒导入病毒包装细胞ｐＡ３１７，经Ｇ４１８筛选培养获得抗性克隆，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度，获得滴度为５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ的细胞克隆。利用病毒上清液感染大鼠胶质瘤细胞系Ｃ６，得到Ｇ４１８抗性克隆细胞Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ，经ＰＣＲ检测，ＴＮＦｃＤＮＡ完整地整合在细胞基因组中。测定Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞上清中ＴＮＦ的生物活性，结果显示ＴＮＦ有相对稳定的表达（４８～１８０Ｕ／ｍｌ１０６ｃｅｌｌｓ／２４ｈ）。实验还显示经ＴＮＦ基因转导的Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞生长速度较之亲本肿瘤细胞Ｃ６明显下降，基因修饰后的肿瘤细胞在Ｗｉｓｔａｒ大鼠体内形成肿瘤的能力明显受到抑制。进一步用超离心法浓缩病毒对胶质瘤移植模型进行了体内治疗研究。     

GM—CSF基因转导的肿瘤疫苗研究

目的：观察ＧＭ－ＣＳＦ基因转导的肿瘤细胞免疫小鼠的抗肿瘤效果。方法：用电穿孔法将小鼠ＧＭ－ＣＳＦ的表达质粒导入ＲＭＡ淋巴瘤细胞,经Ｇ４１８筛选后,将ＧＭ－ＣＳＦ高表达克隆（ＲＭＡ－ＧＭ）细胞皮下接种Ｃ５７ＢＬ／６小鼠,观察成瘤性,以及经丝裂霉素－Ｃ处理灭活的ＲＭＡ－ＧＭ细胞免疫小鼠,观察抗肿瘤作用。结果：ＲＭＡ－ＧＭ细胞免疫小鼠及亲代肿瘤细胞攻击后与对照组相比,肿瘤生长速度减慢,小鼠生存期明显延长     

人硫氧还蛋白及其变异体对TF—1和NFS60细胞的凋亡抑制和？…

目的：比较ｒｈＴＲＸ与ｒｈＴＲＸδ３对细胞因子依赖株ＴＦ－１细胞、ＮＦＳ６０细胞撤除细胞因子所诱导调亡的抑制及促细胞增殖作用。方法：在大肠杆菌中克隆并表达重组ｈＴＲＸ和ｈＴＲＸδ３，纯化ｒｈＴＲＸ和ｒｈＴＲＸδ３蛋白，ＦＡＣＳ检测凋亡细胞，ＭＴＴ法检测细胞增殖。结果：在依赖ＩＬ－３、ＧＭ－ＣＳＦ生长的ＴＦ－１细胞（人红白血病细胞）和依赖Ｇ－ＣＳＦ生长的ＮＦＳ６０细胞（小鼠白血病细胞）撤除细胞因子后     

用双拷贝逆转录病毒载体转导人G－CSF cDNA的实验研究

为克服逆转录病毒中内部启动子对插入外源基因表达的干扰，将人Ｇ－ＣＳＦ（粒细胞集落刺激因子）ｃＤＮＡ插入双拷贝载体Ｎ２Ａ的３＇ＬＴＲＵ３区上的多克隆位点，酶切鉴定后将重组质粒用电击转导法转入Ｐｓｉ－２嗜单性包装细胞系，经Ｇ－４１８选择压力，两周后挑出阳性克隆，测定感染滴度后转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，选择挑出抗性克隆，测定Ｇ－ＣＳＦ表达量，最高达５３．３Ｕ／１０６细胞。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析证明嵌合的目的基因在感染细胞中通过基因复制而转染到５＇ＬＴＲ的转录单位之外并且在染色体ＤＮＡ中稳定整合，复制产生两个拷贝，在３＇ＬＴＲ和５＇ＬＴＲ中各有一个基因。     

粒—巨噬细胞集落刺激因子cDNA在造血祖细胞中的表达

目的；探讨逆转录病毒介导的ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ在造血母细胞中转移与表达。方法：采用电穿孔法将小鼠ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ重组逆转录病毒ｐＬＸＳＮ／ＧＭ和空载体ｐＬＸＳＮ转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，再将含有ＧＭ－ＣＳＦ重组逆转录病毒的细胞培养上清液感染富含造血干祖细胞群体，采用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析培养细胞基因组中外源基因的整合，用Ｄｅｘｔｅｒ培养体系检测培养３周的各组细胞增殖数，结果：在     

逆转录病毒转染的小鼠IL－3基因在NIH／3T3细胞中的表达

将小鼠白细胞介素３（ＩＬ－３）ｃＤＮＡ重组到逆转录病毒载体ｐＮ２Ａ质粒上，用电穿孔法将此重组子转染包装细胞系（ＰＡ３１７），经用Ｇ４１８（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）选择培养基筛选，得到产病毒效价为每ｍｌ５×１０４～２×１０５ＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ）的Ｇ４１８抗性细胞克隆。然后取其培养上清液转染ＮＩＨ／３Ｔ３细胞。通过检测被病毒转染的ＮＩＨ／３Ｔ３细胞培养上清液对小鼠骨髓细胞的增殖反应（ＭＴＴ法）和促分化作用（ＣＦＵ培养法），表明转染的ＮＩＨ／３Ｔ３细胞克隆能分泌ＩＬ－３。此结果为进行ＩＬ－３转基因治疗研究奠定了实验基础。     

用双拷贝逆转录病毒载体转导入G—CSFcDNA的实验研究

为克服逆转录病毒中内部启动子对插入外源基因表达的干扰，将人Ｇ－ＣＳＦ（粒细胞集落刺激因子）ｃＤＮＡ插入双拷贝载体Ｎ２Ａ的３＇ＬＴＲＵ３区上的多克隆立点，酶切鉴定后将重组质粒用电击转导法转入Ｐｓｉ－２嗜单性包装细胞系，经Ｇ－４１８选择压力，两周后挑出阳性克隆，测定感染滴度后转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，选择挑出抗性克隆，测定Ｇ－ＣＳＦ表达量，最高达５３．３Ｕ／１０＾６细胞。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹和Ｎｏｒｔｈｅ     

人肝细胞生长因子在CHO细胞中的表达

以ｐＲＣ／ＣＭＶ作为真核细胞表达性载体，用限制性内切酶ＢａｍＨＩ／ＸｂａⅠ将ＨＧＦｃＤＮＡ全序列定向重组到ｐＲＣ／ＣＭＶ的多克隆位点上。筛选得到的重组质粒以磷酸钙ＤＮＡ共沉淀的方法转染ＣＨＯ细胞，经８００ｍｇ／Ｌ的Ｇ４１８筛选，获得阳性细胞克隆。用ＨＣＣ－７９０２细胞及原代培养的成年大鼠肝细胞对转染阳性细胞培养基收集上清进行活性测定。３Ｈ－ＴｄＲ掺入等分析证明，它能有效地抑制体外培养的人肝癌细胞的生长，并可明显刺激鼠肝细胞ＤＮＡ的合成。结果表明，重组人ＨＧＦ基因在ＣＨＯ细胞中成功地获得表达，为基因工程大量制备和纯化ＨＧＦ奠定了基础     

体外检测近交系小鼠HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞方法的建立

通过磷酸钙法用含ＨＢＶＳ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＭＶＳ与含筛选标记基因－ｎｅｏ基因的质粒ｐＳＶ２－ｎｅｏ对ＢＡＬＢ／Ｃ近交系小鼠肥大细胞瘤细胞株Ｐ８１５细胞进行了质粒共转染，并经Ｇ４１８筛选得到了Ｇ４１８抗性细胞，即Ｐ８１５－Ｓ细胞，斑点杂交和免疫组化实验分别证实Ｐ８１５－Ｓ细胞内有ＨＢＶＳ基因的存在；Ｐ８１５－Ｓ细胞浆内和膜上有ＨＢｓＡｇ的表达。表明了Ｐ８１５－Ｓ细胞要作为体外检测ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠Ｈ     

人bax真核表达载体的构建及其在人胃癌耐药细胞系SGC7901／V …

目的：构建人ｂａｘ真核表达载体，经脂质体导入人胃癌耐药细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ，并检测ｂａｘ基因在转导株的表达。方法 采用分子克隆技术将ｂａｘ基因插入真核表达载体ｐＢＫ－ｃｍｖ的多克隆位点之间，以脂质体倡导法将目的基因导入受体细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ，Ｇ４１８筛选克隆细胞，Ｗｅｓｔｅｎ ｂｌｏｔ检测ｂａｘ基因的表达。结果：成功地构建了重组质粒ｐＢＫ－ｂａｘ，将之转入细胞后，经Ｇ４１８筛选３０ｄ     

PDGF—B基因的膜型表达产物促进血管平滑肌细胞增殖和胶原合成

考察ＰＤＧＦ－Ｂ基因的膜型表达产物对血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ）增生、胶原合成的影响。制备供转导人ＰＤＧＦ－Ｂ基因的重组逆转录病毒，感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，受染ＮＩＨ３Ｔ３细胞经筛选、扩增后，制备细胞膜上表达产物ＰＤＧＦ－ＢＢ以观察其对ＶＳＭＣｓ生长的影响，并以３Ｈ－ＰｒｏＬｉｎｅ掺入率评估该重组蛋白对ＶＳＭＣｓ胶原合成的影响。结果：重组逆转录病毒介导ＰＤＧＦ－Ｂ基因转移并表达出具有生物学活性的重组ＰＤＧＦ－ＢＢ，免疫荧光细胞化学染色证实其表达；该膜型重组蛋白可促进ＶＳＭＣｓ增殖和胶原合成。     

肿瘤坏死因子α基因转染人脑胶质瘤浸润淋巴细胞的实验研究

采用脂质体转染技术将能表达肿瘤坏死因子α（ＴＮＦ－α）基因的重组逆转录病毒质粒ｐＬ（ＴＮＦ－α）ＳＮ导入病毒包装细胞ＰＡ３１７，在细胞培养上清液中得到重组病毒，滴度为１．４×１０９ＣＦＵ／Ｌ。将此病毒上清液感染人脑胶质瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ），用Ｇ４１８筛选出能表达标记基因ＮｅｏＲ的阳性克隆，ＥＬＩＳＡ法测得ＮｅｏＲ阳性ＴＩＬ培养上清液中存在ＴＮＦ－α，可达５３０ｎｇ／Ｌ，Ｌ９２９依赖细胞法并测出上清液中有ＴＮＦ－α生物学活性。结果表明，我们构建的重组逆转录病毒可介导ＴＮＦ－α基因在人脑胶质瘤ＴＩＬ中的表达     

抗人粒细胞集落刺激因子单克隆抗体的研制

应用杂交瘤技术，用重组人Ｇ－ＣＳＦ（ｒｈＧ－ＣＳＦ）免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，然后将其脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＮＳ－１融合，成功地获得了多种能够分泌抗ｒｈＧ－ＣＳＦ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交癌细胞。对其中的２株杂交瘤细胞２Ａ６和２Ｃ２分泌ＭｃＡｂ的研究表明，它们能够特异性地和ｒｈＧ－ＣＳＦ结合，而与重组的人ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－２α和ＴＮＦ细胞因子无交叉反应，为抗Ｇ－ＣＳＦ特异性ＭｃＡｂ。这些杂交瘤细胞经反复冻存和复苏后，仍能稳定地分泌ＭｃＡｂ。     

HSV-TK基因逆转录病毒重组体的构建和鉴定

利用逆转录病毒载体ｐＬＮＳＸ构建了带ＨＳＶＴＫ基因的逆转录病毒重组体ｐＬＮＳＴＫ，用磷酸钙沉淀法转染ＰＡ３１７包装细胞，经Ｇ４１８筛选抗性克隆，建立了产生重组病毒的载体产生细胞系ＰＡ３１７／ＴＫ，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒（ＣＦＵ）滴度为３×１０８Ｌ－１。提取ＰＡ３１７／ＴＫ细胞的ＤＮＡ和细胞上清液的ＲＮＡ，在特异性引物引导下，分别用ＰＣＲ和ＲＴＰＣＲ检测证实ＰＡ３１７／ＴＫ细胞整合了ＨＳＶＴＫ基因并产生重组病毒，为ＨＳＶＴＫ基因治疗恶性肿瘤的实验研究打下了基础。     

重组人造血生长因子对骨髓增生异常综合征造血干细胞集落分化的研究

用体外细胞培养法，观察重组造血生长因子（Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＰＨＡ－ＬＣＭ）对骨髓增生异常综合征（ＭＤＳ）造血干细胞集落分化进行研究。结果表明：ＭＤＳ造血干细胞对正常造血生长因子Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ的感受性低于正常组而高于再障（ＡＡ）组，其丛／集比值明显高于正常组和ＡＡ组，在ＭＤＳ转化为白血病过程中，其造血干细胞对正常造血生长因子的感受性降低尤为显著，而对白血病克隆源性细胞生长所需要的条     

HSV1-tk基因重组逆转录病毒载体的构建与表达

通过ＤＮＡ重组技术,将ＨＳＶ１ ｔｋ基因片段重组到含有ＨＳＶ１ ｔｋ启动子的ｐＮ２Ａ型逆转录病毒载体中。选取正向克隆的逆转录病毒重组ＤＮＡ,以磷酸钙法转染ψ２,ＰＡ３１７包装细胞后,经Ｇ４１８筛选,抗性克隆细胞上清能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３,细胞系测定平均滴度为６．２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ,最高可达１．５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ。     

vIL—10逆转录病毒载体构建及在鼠成纤维细胞中的表达

目的：探讨ｖＩＬ－１０的免疫抑制作用，为应用ｖＩＬ－１０进行免疫基因治疗打基础。方法：用基因重组技术将ｖＩＬ－１０ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮ，并用脂质体法导入包装细胞ＰＡ３１７，取基土清感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３。结果：经筛选获得抗Ｃ４１８的ＮＩＨ３Ｔ３阳性克隆，用ＲＴ－ＰＣＲ，ＥＬＩＳＡ方法检测到ｖＩＬ－１０的表达，用＾３Ｈ－ＴＤＲ法检测到ｖＩＬ－１０对ＭＬＲ的抑制作用。结论     

CD自杀基因联合GM-CSF基因治疗的抗肿瘤作用及免疫机理

目的：研究自杀基因与粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因联合治疗抗肿瘤作用及免疫机制。方法：小鼠皮下接种黑色素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞３ｄ后,分别在肿瘤局部直接注射表达小鼠ＧＭ－ＣＳＦ的重组腺病毒ＡｄＧＭ－ＣＳＦ和表达大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因的腺病毒ＡｄＣＤ,然后连续１０ｄ腹腔注射５氟胞嘧啶（５ＦＣ）（ＡｄＣＤ／５ＦＣ／ＡｄＧＭＣＳＦ组）、单用ＡｄＣＤ／５ＦＣ组、单用ＡｄＧＭ－ＣＳＦ组、注射对照病毒ＡｄｌａｃＺ／５ＦＣ组或ＰＢＳ组。结果：与接受ＡｄＣＤ／５ＦＣ、ＡｄＧＭ－ＣＳＦ、ＡｄｌａｃＺ／５ＦＣ或ＰＢＳ治疗的荷瘤小鼠比较,经联合治疗后荷瘤小鼠皮下肿瘤结节的生长明显受到抑制,荷瘤小鼠的存活期明显延长（Ｐ＜０．０１）。经ＡｄＣＤ／５ＦＣ／ＡｄＧＭＣＳＦ联合基因治疗后,肿瘤瘤体内或瘤周有大量树突状细胞、ＣＤ８＋Ｔ细胞浸润,黑色素瘤细胞表达ＭＨＣ－Ⅰ和Ｂ７－１分子明显增加,荷瘤小鼠脾细胞对Ｂ１６Ｆ１０黑色素瘤细胞特异性杀伤功能增强。结论：联合应用自杀基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因转移可以直接杀伤肿瘤细胞,又可提高机体对肿瘤的免疫应答,两者可协同发挥抗肿瘤作用。