小鼠GM─CSFcDNA重组逆转录病毒的构建及在成纤维细胞中的表达

为探索粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因治疗的可能性，将小鼠ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ重组于缺陷型逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，重组质粒转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，经Ｇ４１８筛选，用其抗性克隆培养上清液感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３，筛选出抗Ｇ４１８的转化细胞克隆，用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明转化细胞的基因组中整合有ＮｅｏＲ基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因，原位杂交显示转化细胞有较强的ＧＭ－ＣＳＦｍＲＮＡ表达，用骨髓细胞增殖法和ＣＦＵ－ＧＭ检测也表明转化细胞分泌有较多的ＧＭ－ＣＳＦ，该研究为下一步在动物体内进行ＧＭ－ＣＳＦ基因治疗的研究奠定基础     

粒—巨噬细胞集落刺激因子cDNA在造血祖细胞中的表达

目的；探讨逆转录病毒介导的ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ在造血母细胞中转移与表达。方法：采用电穿孔法将小鼠ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ重组逆转录病毒ｐＬＸＳＮ／ＧＭ和空载体ｐＬＸＳＮ转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，再将含有ＧＭ－ＣＳＦ重组逆转录病毒的细胞培养上清液感染富含造血干祖细胞群体，采用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析培养细胞基因组中外源基因的整合，用Ｄｅｘｔｅｒ培养体系检测培养３周的各组细胞增殖数，结果：在     

vIL—10逆转录病毒载体构建及在鼠成纤维细胞中的表达

目的：探讨ｖＩＬ－１０的免疫抑制作用，为应用ｖＩＬ－１０进行免疫基因治疗打基础。方法：用基因重组技术将ｖＩＬ－１０ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮ，并用脂质体法导入包装细胞ＰＡ３１７，取基土清感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３。结果：经筛选获得抗Ｃ４１８的ＮＩＨ３Ｔ３阳性克隆，用ＲＴ－ＰＣＲ，ＥＬＩＳＡ方法检测到ｖＩＬ－１０的表达，用＾３Ｈ－ＴＤＲ法检测到ｖＩＬ－１０对ＭＬＲ的抑制作用。结论     

GM—CSF在急性白血病强烈化疗中的应用

ＧＭ－ＣＳＦ在急性白血病强烈化疗中的应用陈艳才杨国林古至洲冯运会攀枝花市攀钢总医院（６１７０２３）强烈化疗方案的应用，可明显提高急性白血病（ＡＬ）的缓解率并延长生存期，然而，强化疗所致重度骨髓抑制期易导致粒细胞重度减低，因而往往继发严重感染而危及患者...     

逆转录病毒转移的β—半乳糖苷酶基因在成纤维细胞中的表达

为了研究逆转录病毒载体转移外源基因的实用性，我们采用小鼠白血病病毒（ＭｏＭＬＶ）载体将大肠杆菌的β－半乳糖苷酶基因（ｌａｃＺ）和抗新霉素（Ｎｅｏ＾Ｒ）基因转移到大鼠成纤维细胞内，对整合后的前病毒结构和基因表达进行了酶活性测定和ＤＮＡ分析。结果表明：ｌａｃＺ基因可以在大鼠皮肤成纤维细胞和２０８Ｆ细胞株中较长时间地表达；前病毒整合位点。靶细胞特性和整合后的载体结构与转入基因表达的稳定性紧密相关。     

bFGF cDNA重组逆转录病毒表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

目的　建立逆转录病毒介导的人bFGF体外表达体系。方法　应用DNA重组技术 ,将人bFGFcDNA片段重组到逆转录病毒质粒pLXSN中 ,经PA3 17细胞包装后 ,产生的重组逆转录病毒感染COS 7细胞 ,用RT PCR和WesternBlotting检测bFGFmRNA和蛋白表达。结果　重组pLXSN bFGF质粒 ,经酶切鉴定正确。重组逆转录病毒pLXSN bFGF滴度可达 2 3× 10 4CFU/ml,感染COS 7后能稳定表达。结论　逆转录病毒能介导人bFGF在哺乳动物细胞中的稳定表达 ,本研究为下一步开展基因治疗帕金森病等中枢神经系统疾病奠定了基础     

人类GM—CSF受体生物学特性的研究

为了探讨人类ＧＭ－ＣＳＦ受体的功能特性,将编码人ＧＭ－Ｒａ和βｃ亚单位的ｃＤＮＡ转染到无ＧＭ－Ｒ表达的小鼠前Ｂ细胞系ＢａＦ３中。阳性转染子功能检测表明,表达ＧＭ－Ｒａ的ＢａＦ３克隆能与配体低亲和力结合,并仅在高浓度配体诱导后出现增殖反应;而共表达ＧＭ－Ｒａ／β的ＢａＦ３克隆则能以高亲和力方式与配体结合,并表现出配体依赖必细胞增殖;增殖信号的传导与配体通过诱导βｃ磷酸化而活化胞浆Ｊａ２、Ｓｈｃ及Ｓｈ     

rhG—CSF cDNA表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组人表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ＰＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５     

GM—CSF基因转导的肿瘤疫苗研究

目的：观察ＧＭ－ＣＳＦ基因转导的肿瘤细胞免疫小鼠的抗肿瘤效果。方法：用电穿孔法将小鼠ＧＭ－ＣＳＦ的表达质粒导入ＲＭＡ淋巴瘤细胞,经Ｇ４１８筛选后,将ＧＭ－ＣＳＦ高表达克隆（ＲＭＡ－ＧＭ）细胞皮下接种Ｃ５７ＢＬ／６小鼠,观察成瘤性,以及经丝裂霉素－Ｃ处理灭活的ＲＭＡ－ＧＭ细胞免疫小鼠,观察抗肿瘤作用。结果：ＲＭＡ－ＧＭ细胞免疫小鼠及亲代肿瘤细胞攻击后与对照组相比,肿瘤生长速度减慢,小鼠生存期明显延长     

pSVL／GM—CSF真核表达质粒的构建及其表达活性观察

以真核瞬时表达质粒ｐＳＶＬ为载体构建ｐＳＶＬ／ＧＭＣＳＦ真核表达质粒,用电穿孔法导入Ｃｏｓ－７细胞,以ＧＭ－ＣＳＦ依赖株ＴＦ１为靶细胞,检测其生物学活性;将不同剂量的ＰＳＶＬ／ＧＭ－ＣＳＦ质粒直接注射Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠股四头肌,动态观察小鼠血清中ＧＭ－ＣＳＦ的表达;     

人生长激素重组载体的构建及其在原代成纤维细胞中的表达

早在1987年，生长激素(GH)基因即被成功克隆，随即开展了基因治疗的有关研究，但其进入临床试验的阻碍主要是缺少一个高效、易操作的基因治疗系统，尤其是靶细胞的问题，尽管传代细胞系易培养，但存在免疫排斥反应和肿瘤形成的危险。本实验以原代小鼠胚胎成纤维细胞为靶细胞，以逆转录病毒为基因表达载体，建立一个可操作的基因治疗系统。     

腺病毒载体转导GM—CSF基因制备肿瘤疫苗对小鼠肿瘤模型预防及治疗的实验性研究

目的：评价重组腺病毒载体转导粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）、γ－干扰素（IFN－γ）、单核细胞趋化蛋白－1（MCP－1）基因所制备的肿瘤疫苗对同源性小鼠肿瘤模型的预防和治疗功效。方法：巨细胞病毒（CMV）起动子、特定的细胞因子cDNA片段和SV40多聚腺苷信号组成细胞因子基因表达载体，通过基因重组产生重组腺病毒（Adv/GM-CSF、Adv/IFN-γ、Adv/MCP-1）。重组腺病毒直接人肾胚胎细胞系293细胞，选择最佳感染滴度，以不同的效靶比转染不同的肿瘤细胞系CT26、RENCA和BALB／3T3纤维母细胞，经照射灭活后制备不同的肿瘤疫苗，用于各种肿瘤模型。结果：表明经基因转导后的肿瘤细胞以及照射灭活经基因转导后的肿瘤细胞可以分泌转导的细胞因子。接种经照射灭活的转导GM－CSF结肠癌细胞系CT26后，90％的同源性小鼠对原代CT26细胞的攻击起到了保护作用，而接种转导IFN-γ和MCP－1基因制备的肿瘤疫苗对小鼠经原代CT26细胞的攻击未有保护作用。同源性小鼠接种分泌GM－CSF的肿瘤疫苗后，对CT26原代细胞的多次 攻击在整个观察期间未见肿瘤生长。接种分泌GM－CSF的肿瘤疫勒后机体长期、特异性的抗肿瘤免疫的建立需要GM－CSF及肿瘤抗原在接种部位的同时存在，CD8T细胞亚群的缺失，明显阻断了分泌GM－CSF肿瘤疫苗的功效。皮下注射分泌的GM－CSF肿瘤疫苗能够有效地阻止预先植入小鼠体内小负荷肿瘤细胞的生长，同时也可以有效的阻止接种前7天或后3天静脉内注射原代CT26瘤细胞在肺内转移灶的生长。结论：在本研究实验性肿瘤模型中，皮下注射重组病毒载体转导GM－CSF基因制备的肿瘤疫苗不仅能够有效地预防皮下接种原代CT26肿瘤细胞的生长而且也可消除原有的肿瘤病灶及转移瘤灶，使机体建立了长期、特异性的抗肿瘤免疫反应。     

谷胱甘肽S—转移酶pi基因与逆转录病毒载体的重组体构建

为了在细胞水平上研究谷胱甘肽Ｓ－转移酶基因的表达活性对化学致癌诱导细胞转化作用的的影响及探讨肿瘤基因预防的可能性，作为第一步，本实验的构建了ＧＳＴ－ｐｉ ｃＤＮＡ与逆转录病毒载体ｐＸＴ１的重组体。     

逆转录病毒介导IL—2cDNA治疗小鼠淋巴瘤的研究

研究人白细胞介素－２转基因小鼠淋巴瘤体内成瘤性。方法：体外将ｈＩＬ－２基因转入小鼠淋巴瘤ｐ３８８细胞。用ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ｄｏｔｂｌｏｔ法检测ｈＩＬ－２基因在细胞内的整合及表达,四甲基偶氮唑盐比色法检测转导细胞ｈＩＬ－２分泌。体内试验将动物分为Ａ９组,对照组和体内转当治疗组３组。１７ｄ后处死所有动物,观察肿瘤生长状况。结果：ｈＩＬ－２基因已成功地整合到小鼠ｐ３８８细胞基因组内。Ｐ３８８／ＩＬ－     

抗凋亡基因bcl—x—1逆转录病毒表达载体的构建与鉴定

抗凋亡基因ｂｃｌ┐ｘ┐１逆转录病毒表达载体的构建与鉴定白庆咸１黄高升１陈协群２（１第四军医大学病理学教研室西安７１００３３２第四军医大学西京医院血液科）关键词凋亡ｂｃｌ－ｘ－１基因，逆转录病毒表达载体中图号Ｒ７５３ｂｃｌ－ｘ－１是ｂｃｌ－２家族的新成...     

HBx基因重组逆转录病毒载体的构建及表达

目的:构建携带HBx基因的重组逆转录病毒载体,为进一步研究HBx基因在HBV相关性HCC(原发性肝癌)发病机制中的作用以及建立肝癌动物模型奠定基础.方法:根据基因库中已公布的HBx序列设计引物,采用PCR技术从HBx腺病毒质粒中扩增出HBx基因.将HBx基因克隆到逆转录病毒载体pSEB-HUS质粒中.酶切、PCR及测序鉴定后经脂质体介导转染L02细胞,Western Blotting检测HBx蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序鉴定证实目的基因正确克隆至逆转录病毒质粒pSEB-HUS中,目的基因序列与GENE BANK报道一致,转染L02细胞后荧光显微镜可观察到GFP的表达.Western Blotting检测可见HBx蛋白的表达.结论:成功构建HBx重组逆转录病毒载体.