一例新的HLA-B等位基因B*5614的核苷酸序列分析

目的 研究HLA新的等位基因HLA-B*5614的分子基础。方法 样本DNA抽提采用盐析法，利用PCR方法扩增先证者HLA-B基因的第2～4外显子，PCR产物直接经TOPO转染克隆到质粒载体中分离其等位基因，对所得克隆进行第2～4外显子双向测序分析。应用序列特异性引物PCR方法证实测序所发现的突变。结果 先证者样本克隆测序得到两个等位基因，其中1个等位基因为B*1502，另一个经BLAST验证为新的等位基因，新的等位基因序列已递交GenBank(AY601726，AY601727，AY601728)。与最接近的B*5608等位基因序列相比，新的等位基因仅在第2外显子上有1个核苷酸不同，即第277位G→C，导致第93位氨基酸Cly→Arg。结论 该等位基因为新的HLA-B等位基因，被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*5614。     

一例HLA-A新等位基因A*3308的测序分析

目的研究HLA新的等位基因HLA-A＊3308的分子机制。方法样本DNA抽提采用PEL-FREEZ抽提试剂盒，应用PCR方法扩增先证者HLA-A基因的第1～8外显子，PCR产物直接经TOPO转染克隆到质粒载体中获得等位基因的单链，对所得克隆进行第2、3、4外显子双向测序分析。结果先证者样本克隆测序得到两个等位基因，其中1个等位基因为A＊0201，另一个经BIAST验证其为新的等位基因，新的等位基因序列已递交GenBank（DQ089631，DQ089632，DQ089633）。与最接近的A＊3303等位基因序列相比，新的等位基因在第2外显子上有5个核苷酸不同，即第240位A→T，第256位C→G，第259位A→G，第261位C→G和第270位T→A；这导致3个氨基酸改变：第62位Arg→Gly、第63位Asn→Glu和第66位Asn→Lys。结论该等位基因为新的HLA-A等位基因，被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-A＊3308．     

HLA-B新等位基因B*9536和B*4612的测序分析和确认

目的 研究人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)新等位基因HLA_B*9536和B*4612的分子机制.方法 采用Invitrogen抽提试剂盒抽提标本DNA,利用单链特异性引物PCR方法扩增样本HLA-B基因第2～4外显子,对PCR产物直接进行HLA-B基因第2、3、4外显子双向测序分析.结果 先证者标本存在2个HLA-B等位基因,经HLA Blast验证均为新的等位基因,新的等位基因序列已递交GenBank(EU081878和EU081879),经世界卫生组织HLA命名委员会正式命名为HLA-B*9536和HLA-B*4612.HLA-B*9536第2～4外显子序列与最接近的B*1505相比,在第3外显子存在一个碱基的不同,即第544位G→A改变,导致第158位氨基酸Ala→Thr;HLA-B*4612第2～4外显子序列与最接近的B*4601相比,在第3外显子存在一个碱基的不同,即第363位G→C,导致第97位氨基酸Arg→Ser.结论 在同一标本中发现两个新的HLA-B等位基因,并被世界卫生组织HLA命名委员会正式命名.     

新的HLA-DRB1等位基因DRB1*1212的核苷酸序列分析

目的验证一个新的HLA等位基因HLA—DRB1＊1212的序列。方法采用盐析法抽提样本基因组DNA，利用HLA—DRB1组特异性引物PCR扩增先证者HLA—DRB1等位基因的第2外显子，PCR产物经割胶回收后进行测序分析，通过聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针方法验证测序发现突变点。结果先证者有两个HLA—DRB1等位基因，其中一个为HLA—DRB1＊090102，另一个HLA—DRB1等位基因，经BLAST验证为新的等位基因，新的等位基因序列已递交GenBank（AY899825）。与最接近的DRB1＊120101等位基因序列相比，新的等位基因仅在第2外显子上有1个核苷酸不同，即第199位A→C，导致第67位氨基酸Ile—Leu。结论该等化基因为新的HLA—DRB1等位基因，被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-DRB1＊1212。     

人类白细胞抗原新等位基因B*54:09的序列分析

目的 鉴定1名中国人白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)新等位基因.方法 应用基于Luminex平台的聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针(polymerase chain reaction-sequence specific oligonucleotide probes,PCR-SSOP)方法对先证者进行HLA基因分型、PCR产物测序和基因克隆DNA测序,通过软件分析该基因序列并与同源性最高的HLA等位基因比较序列差异.结果 PCR-SSOP基因分型显示先证者HLA-B位点反应格局异常,疑为HLA新等位基因.基因克隆后测序结果显示,其中1个等位基因为B*59:01,另一个等位基因序列与所有已知HLA等位基因不同,与同源性最高的HLA-B* 54:06基因序列相比,在第3外显子有6个核苷酸不同(nt486G→C、nt527A→T、nt538T→C、nt539G→T、nt559 C→A和nt560 T→C),导致了3个氨基酸改变,152位氨基酸由Glu→Val,156位氨基酸Trp→Leu和163位氨基酸Leu→Thr.结论 该等位基因为HLA新等位基因,被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B* 54:09.     

一例HLA-A新等位基因HLA-A*3113的测序分析

目的研究HLA新的等位基因HLA-A * 3113的分子机制。方法样本DNA抽提采用PEL-FREEZ抽提试剂盒,利用PCR方法扩增先证者HLA-A基因的第1～8外显子,PCR产物直接经TOPO TA克降转染到质粒载体中获得等位基因的单链,对所得克隆进行第2、3、4外显子双向测序分析。应用序列特异性引物PCR方法证实测序所发现的突变。结果先证者样本克隆测序得到两个等位基因,其中一个等位基因为A*2402,另一个经BLAST验证其为新的等位基因,新的等位基因序列已递交GenBank(DQ206619,DQ206620,DQ206621)。与最接近的A*310102等位基因序列相比,新的等位基因在第3外显子上有1个核苷酸不同,第456位G→c,导致第128位氨基酸E→D。结论该等化基因为新的HLA-A等位基因,被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*3113。     

用等位基因组特异性引物扩增技术确认HLA-B新等位基因B*15:129

目的 对人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)新等位基因HLA-B*15:129的第2～4外显子序列进行分析.方法 采用商用抽提试剂盒抽提标本DNA,应用等位基因组特异性引物PCR方法扩增先证者标本HLA-B基因第2～4外显子,PCR产物经酶切纯化后直接进行HLA-B基因第2～4外显子双向测序分析.结果 先证者标本存在2个HLA-B等位基因,1个等位基因为B*07:02,另1个经Blast验证为新的等位基因,新的等位基因序列已递交GenBank(EF473219),经世界卫生组织HLA命名委员会正式命名为HLA-B*15:129.HLA-B*15:129第2～4外显子序列与最接近的B*15:01:01:01相比,第3外显子存在3个碱基的不同,即第362位G→A、363位G→T、369位C→T改变,导致第97位氨基酸Arg→Asn.结论 发现1例新的HLA-B等位基因,被世界卫生组织HLA基因命名委员会正式命名为HLA-B*15:129.

Abstract：

Objective To analyze the sequence of the exons 2-4 of human leukocyte antigen (HLA) novel allele HLA-B*15:129.Methods DNA of the proband was extracted from whole blood by commercial DNA extraction kit. The amplification for HLA-B exons 2-4 was performed separately by polymerase chain reaction (PCR) with allele group specific primers. The PCR products were digested with enzymes and then directly sequenced for exons 2-4 of HLA-B locus in both directions.Results Sequencing results showed the HLA-B alleles of the proband included B*07:02 and a novel allele. The sequence of the novel allele has been submitted to GenBank (accession no. EF473219) and the allele has been officially named B*15:129 by the WHO Nomenclature Committee. Comparing with the HLA-B*15:01:01:01, the sequence of exons 2-4 of HLA-B*15:129 showed three nucleotide difference in exon 3 at positions 362 and 363 from GG to AT and positions 369 from C to T, which resulted in an amino acid change from Arg to Asn at codon 97.Conclusion A novel HLA-B allele was identified and has been officially named B15:129 by the WHO Nomenclature Committee.     

HLA-DRB1新等位基因DRB1*1610的发现

目的 对HLA新的等位基因HLA-DRB1*1610的分析.方法 采用商用DNA试剂盒抽提样本基因组DNA,利用HLA-DRB1组特异性引物PCR扩增先证者HLA-DRB1基因的第2外显子,PCR产物经割胶回收后进行测序分析.结果 先证者有两个HLA-DRB1等位基因,其中一个为HLA-DRB1*1202,另一个HLA-DRB1等位基因经BLAST验证为新的等位基因,新的等位基因序列已递交GenBank(DQ192647).与最接近的DRB1*160201等位基因序列相比,新的等位基因仅在第2外显子上有1个核苷酸不同,即第227位A→T,导致第47位氨基酸Tyr→Phe.结论 该等位基因为新的HLA-DRB1等位基因,被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-DRB1*1610.     

HLA新等位基因B*5618的序列分析

目的识别确认中国汉族人群中的HLA新等位基因。方法采用聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针(polymerase chain reaction-sequence specific oligonucleotide probes,PCR-SSOP)方法、聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-sequence specific primer,PCR-SSP)方法以及基因测序分型(sequence-based typing,SBT)技术,发现1个与HLA-B*5610等位基因相近的未知等位基因。以基因特异性引物单独扩增B*56基因并对第2、3、4外显子进行双向测序,序列经BLAST验证并分析该基因与B*5610基因的核苷酸序列差异。结果该基因为新的等位基因,其序列已被GenBank接受(编号为EF016753)。新等位基因与最接近的B*5610相比,在第3外显子上有4个核苷酸的不同,即第379位C→G(密码子127CTG→GTG,氨基酸127Leu→Val);第412位A→G(密码子138AAC→GAC,氨基酸138Asn→Asp);第419位T→C、第420位A→C(密码子140TTA→TCC,氨基酸140Leu→Ser)。结论该等位基因为新的HLA-B等位基因,2006年9月已被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*5618。     

HLA-B新等位基因B*9534的测序分析及其单链扩增技术的建立

目的 分析HLA-B新等位基因HLA-B*9534的核苷酸序列,并建立HLA-B * 9534单链扩增技术.方法 采用商品化快速抽提试剂盒抽提标本基因组DNA,采用PCR技术扩增先证者HLA-B基因的第1～8外显子序列,PCR产物经双酶切后直接测序分析第2、3、4外显子.应用序列特异性引物PCR建立HLA-B*9534单链扩增技术,获得HLA-B*9534等位基因的单链产物,并对单链产物进行第2、3、4外显子测序分析.结果 先证者标本存在2个HLA-B等位基因,直接测序结果经软件分析显示与最接近的HLA-B*1518和B*4601组合存在1个碱基不匹配,即第593位A/G杂合.单链扩增技术将先证者等位基因分离后,测序得到两个等位基因为HLA-B*4601和HLA-B*9534.与最接近的HLA-B*1518的第2～4外显子序列相比,HLA-B*9534仅在第3外显子存在一个碱基的不同,即第593位A→G的改变,导致第174位氨基酸天冬酰胺改变为丝氨酸,该等位基因序列已递交GenBank(EU046491),并经世界卫生组织HLA命名委员会正式命名为HLA-B*9534.结论 发现一个新的HLA-B*9534等位基因,建立的HLA-B*9534单链扩增技术是可行的.     

一例HLA-A新等位基因HLA-A*9206的测序分析

目的 研究人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)新的等位基因HLA-A*9206的序列及其分子机制.方法 样本DNA抽提采用PEL-FREEZ抽提试剂盒,应用PCR方法扩增先证者HLA-A等位基因的第1～8外显子,进行第2-4外显子双向测序分析,发现突变位点.应用序列特异性引物PCR方法获得等位基因的单链,测序后确定双链测序所发现的突变.结果 先证者样本单链测序得到两个等位基因,其中一个等位基因为A*1101,另一个经Blast验证其为新的等位基因,新的等位基因序列已递交GenBank(EFD62306).与最接近的A*0206等位基因序列相比,新的等位基因在第3外显子上有1个核苷酸不同,第530位C→T,导致第153位丙氨酸→缬氨酸.结论 该等位基因为新的HLA-A等位基因,被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*9206.     

新等位基因HLA-B*9526的确认和序列分析

目的 鉴定中国人群中人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)新等位基因HLA-B*9526,并进行核苷酸序列分析.方法 使用序列特异性寡核苷酸PCR技术进行HLA基因分型,发现1个反应格局异常的等位基因,应用分子克隆和DNA双向测序技术测定新等位基因的核苷酸序列,并与已知等位基因进行序列比对分析.结果 检出反应格局异常的DNA样本,经过克隆测序得到两个等位基因,分型结果一个为B*5403,另一个的核苷酸序列与已知的HLA等位基因均不同,该基因序列与同源性最高的HLA-B*1507基因序列相比在第3外显子区域中425位碱基发生A→G突变,导致142位编码氨基酸由酪氨酸变成半胱氨酸.结论 一个新的HLA-B等位基因被确认,并被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*9526.     

DNA序列分析鉴定HLA新等位基因B*4446

目的鉴定中国人群的HLA新等位基因。方法使用PCR-序列特异性引物及PCR-序列特异性寡核苷酸探针技术进行HLA分型。发现1个与HLA-B*44相关的未知基因,使用DNA序列分析技术鉴定并分析该基因与同源性最高的B*4409基因序列的差异。结果新基因第3外显子区域序列与所有已知的HLA-B等位基因序列均不相同,与同源性最高的HLA-B*4409基因序列相比有3个碱基发生替代。第538位碱基由G→C,第539位碱基A→T以及第540位碱基C→G,使编码产物180位氨基酸由天冬氨酸变成亮氨酸。结论发现一个新的HLA-B等位基因,于2005年9月由WHOHLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*4446。     

新等位基因人类白细胞抗原B*4609的发现和确认

目的 鉴定一个人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)新等位基因HLA-B*4609.方法 使用序列特异性寡核苷酸PCR技术进行HLA基因分型,发现反应格局异常的可疑新等位基因,应用分子克隆和DNA双向测序技术测定新等位基因的核苷酸序列,并与已知等位基因进行序列比对分析.结果 检出1个样本HLA-B位点反应格局异常,DNA测序分型结果一个为B*151101,另一个的核苷酸序列与已知的HLA等位基因均不同,该基因序列与同源性最高的HLA-B*460101基因序列相比,在第3外显子区域中527位碱基发生A→T突变,导致176位编码氨基酸由谷氨酸(GAG)变成缬氨酸(GTG).结论 样本中含有HLA-B新等位基因序列.该序列申报后,被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*4609.     

HLA新等位基因HLA-DRB1*0453的认定

目的鉴定一个HLA-DRB1＊04的新等位基因。方法从外周血中提取基因组DNA．应用PCR-SSO技术进行中低分辨率的HLA基因分型，PCR产物直接测序技术检测基因序列，通过软件和数据库中的同源等位基因进行序列比对，对先证者进行家系分析。结果样本HLA-DRB1位点的第2外显子序列与所有已知HLA-DRB1等位基因序列不同，该基因序列与同源性最高的等位基因DRB1＊0447相比有3个碱基替代，在外显子2区域中的286位碱基发生了C→A替代，导致相应的67密码子由亮氨酸（L）→异亮氨酸（I），344和345位碱基发生了GT→TG替代，并导致相应的86密码子由甘氨酸（G）→缬氨酸（V）。家系分析结果显示，先证者的新等位基因HLA-DRB1＊0453遗传自父亲。结论该等位基因是HLA-DRB1＊04新的等位基因，被WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA-DRB1＊0453。     

新等位基因HLA-A*240212的认定

目的发现和认定1个HLA新等位基因。方法应用PCR-SSO基因分型技术筛选可能的HLA新等位基因，PCR产物测序，确认与最同源HLA等位基因序列的差异。结果发现一个样品的HLA-A位点结果异常。其序列与已知所有HLA—A等位基因序列不一致，与同源性最高等位基因A＊24020101的差异只是在第2外显子区域中的230位碱基发生了C→T碱基的替换，但并未改变第77密码子编码的氨基酸。结论该等位基因为HLA-A位点的1个新等位基因，已被WHOHLA因子命名委员会于2006年8月23日正式命名为HLA-A＊240212。     

DNA测序鉴定新等位基因HLA-DRB1*1609

目的 鉴定HLA新等位基因DRB1＊1609。方法 应用分子克隆和DNA测序的技术测定HLA新等位基因的核苷酸序列，进行HLA等位基因序列比对分析和新等位基因的血清学分型及家系分析。结果 新等位基因DRB1第二外显子（exon2，Ex2）序列与所有已知的HLA等位基因序列均不相同，与同源性最高的HLA-DRB1＊160101相比，第127位碱基由A→T，引起相应编码第47位氨基酸由酪氨酸Tyr（Y）→苯丙氨酸Phe（F）。血清学分型表明抗原特异性为DR16。家系分析提示该志愿者DRB1＊1609等位基因遗传自母亲。结论 DNA测序表明被测标本含有HLA-DRB1新等位基因，被WHOHLA因子命名委员会正式命名为HLA-DRB1＊1609。     

新等位基因HLA-B*40:96的确认及家系遗传

目的 鉴定一个中国汉族人群中发现的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)新等位基因,调查该基因的家系遗传情况.方法 应用Luminex DNA杂交流式分型技术进行HLA分型,发现1例HLA-B位点反应格局异常,采用DNA测序分型技术进行新等位基因鉴定并对该基因的先证者进行家系调查.结果 DNA序列确定为一个新HLA-B等位基因序列,与同源性最高的HLA-B* 40:06:01相比,在第2外显子有7个碱基不同,分别是302位G→A、309位G→C、311位A→C、313位C→G、314位T→C、317位G→T、319位G→C,并导致相应密码子编码的氨基酸发生了改变,密码子101位由丝氨酸(Ser)→天冬氨酸(Asn)、104位由天冬氨酸(Asn)→苏氨酸(Thr)、105位由亮氨酸(Leu)→丙氨酸(Ala)、106位由精氨酸(Arg)→亮氨酸(Leu)、107位由甘氨酸(Gly)→精氨酸(Arg).家系分析表明该新基因来自先证者父亲.结论 鉴定了一个HLA-B新等位基因,2009年2月被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B* 40:96.     

ABO亚型ABw07一家系的分子生物学研究

目的 研究一个ABO亚型ABw07家系的分子机制.方法 用单克隆抗体检测先证者红细胞ABO血型抗原.标准A、B、O红细胞检测先证者血清中的ABO抗体,采用聚合酶链反应技术扩增先证者ABO基因的第6和7外显子序列,PCR产物经酶切后直接测序分析.同时PCR产物经TOPO TA克隆到质粒载体中获得单链,对所得克隆进行ABO基因双向测序分析.家系调查采集先证者父母和姐姐的标本进行血型血清学实验和ABO基因第6和7外显子直接测序分析.结果 先证者红细胞有A、B抗原,同时血清中存在抗B抗体.直接测序分析发现第261位无缺失,第297位A/G、467C/T、526C/G、657C/T、703G/A、796C/A、803G/C、930G/A、1055C/A、1096A/G杂合,可推断为A102Bw07基因型.克隆测序得到两个等位基因A102和Bw07.与B101相比,Bw07第1055位G→A,导致1个氨基酸改变:第352位氨基酸精氨酸变成谷氨酰胺.家系调查显示先证者Bw07基因从母亲遗传所得,母亲血液标本ABO血型血清学特性和测序分析结果与先证者完全一致.结论 α-1,3-半乳糖基转移酶基因(B基因)第1055位G→A突变导致产生Bw07表型,其血清中可含有抗B抗体.     

HLA新等位基因HLA-B~*5145的确认

背景:作者在用美国onelamba试剂公司生产的HLA低分辨试剂进行分型实验时,将反应结果导入HLA数据分析软件,发现HLA-B位点反应格局异常,且阴性磁珠和阳性磁珠反应情况良好,但是分析软件并未给出相应结果,怀疑有新基因的可能。目的:发现和认定1个HLA新等位基因。方法:采集中华骨髓库造血干细胞捐献者血样,应用PCR-SSO基因分型技术筛选可能的新等位基因,PCR产物测序和DNA基因克隆测序,分析基因序列。结果与结论:PCR-SSO基因分型显示,供者HLA-A位点基因型为A*02XX,A*33XX;HLA-DRB1位点基因型为DRB1*1202,DRB1*1302,HLA-B位点反应格局异常,不能指定任何HLA-B位点的等位基因,提示B*44XX,B*53XX;90FN,91FP,调整不合理,故进一步用其他试剂(Dynal,PCR-SSO)分型方法进行分析,也显示无法判定的结果。等位基因HLA-B*5145是HLA-B*5106的变异体,该基因和B*5106的差异在第3外显子的339位碱基A→G,引起相应编码氨基酸113位上的N(天冬酰胺,Asn)→D(天冬氨酸,Asp),346位碱基A→C,引起相应编码氨基酸115位上的Y(酪氨酸,Tyr)→S(丝氨酸,Ser),362位碱基A→G,则不引起相应编码氨基酸120位上的K(赖氨酸,Lys)的变化。该基因为新等位基因,2006-10被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名HLA-B*5145。