腺病毒介导的EGFP基因在大鼠骨髓间质干细胞中的高效表达

目的:研究复制缺陷型腺病毒感染骨髓间质干细胞介导外源基因表达的可行性及感染效率。方法: 在体外低密度扩增大鼠骨髓间质干细胞(rMSC), 用细菌同源重组法构建巨细胞病毒(CMV)驱动的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因腺病毒载体(pAd-EGFP), 用293包装细胞制备腺病毒, 用EGFP重组腺病毒感染rMSC, 观察重组腺病毒携带基因在MSC中的感染和表达情况, 用细胞计数法和流式细胞仪分析感染效率。用血清撤离加入β-巯基乙醇诱导Ad-EGFP感染的rMSC向神经样细胞定向分化。结果:Ad-EGFP可高效感染rMSC, 感染率为(36±2)%, 而脂质体法转染质粒pTrack-GFP在rMSC转染效率非常低且不易成功;Ad-EGFP感染后的不同扩增代数的rMSC在受到β-巯基乙醇的诱导分化后在荧光显微镜下呈典型的突触形式。免疫组化鉴定发现这些诱导细胞表达神经元特异烯醇化酶(NSE), 表明腺病毒介导外源基因转染后rMSC仍具有分化为神经样细胞的潜能。结论:腺病毒载体具有较高的介导外源基因表达于rMSC的效率, 腺病毒载体介导的EGFP基因能够示踪rMSC分化为神经样细胞的过程。     

应用细菌同源重组法快速构建和制备重组腺病毒

目的：利用大肠杆菌细菌同源重组构建重组腺病毒载体并在293细胞制备高滴度重组病毒。方法：自细胞周期相关激酶真核表达载体pCR31-CCRK中酶切出CCRK基因，亚克隆至带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中，形成转移质粒pAdTrack-CMV-CCRK，采用电穿孔或化学转化法在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组，得到重组腺病毒载体pAd-CCRK。以pAd-CCRK为模板，经DNA测序正确后，用Pac Ⅰ酶切线性化pAd-CCRK，转染293细胞，包装成重组病毒颗粒，荧光显微镜观察转染细胞EGFP的表达，采用PCR的方法对重组腺病毒进行鉴定。将重组病毒上清感染RAW细胞，荧光显微镜下观察感染细胞重组病毒的表达。结果：成功地构建了携带CCRK基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒，重组病毒能在体外高效表达。结论：应用细菌内同源重组能够快速构建腺病毒载体，可高效制备均一的高滴度重组病毒，为CCRK基因功能的研究奠定了基础.     

重组大鼠脑源性神经营养因子腺病毒的构建及体外表达分析

目的构建含有大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因的重组腺病毒(AD)载体,并分析其体外表达情况。方法将采用RT-PCR技术获取的大鼠BDNF的cDNA基因定向克隆入穿梭质粒pAdTrack-CMV中。通过与腺病毒骨架载体pAdeasy-1在细菌内同源重组形成重组腺病毒质粒pAd-BDNF,转染人胚肾293细胞后包装成有感染能力的重组腺病毒颗粒(Ad-BDNF)。重组病毒感染体外培养的Hela细胞后,用RT-PCR、Western blot及免疫细胞化学检测细胞BDNF基因及蛋白表达情况。结果 pAd-BDNF测序结果和预期一致,同源重组并经293细胞包装后形成重组腺病毒Ad-BDNF,重组病毒感染Hela细胞后能高水平表达BDNF。结论成功制备了重组腺病毒Ad-BDNF,感染细胞证实其呈分泌表达,为将其进一步应用于神经系统损伤性疾病治疗的研究打下了基础。     

人KLK1和EGFP双顺反子重组腺病毒构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的：构建携EGFP为报告基因和人组织激肽释放酶1(hKLK1)基因双顺反子的重组腺病毒（Ad-hKLK1-IRES-EGFP）,并观察在自发性高血压大鼠（SHR）血管平滑肌细胞（VSMCs）中的表达变化。方法:通过双酶切质粒pBluescritII KS-hKLK1，将hKLK1基因定向克隆至带有IRES-EGFP的腺病毒穿梭质粒pDC316中，构建成重组穿梭质粒 ，将其与腺病毒骨架质粒BHGloxE1，3Cre共转染293A细胞，经包装并获得重组腺病毒，用PCR、酶切及测序方法对其进行鉴定，测定病毒滴度；用重组腺病毒感染VSMCs，用荧光显微镜下观察到的绿色荧光来测定感染率，用RT－PCR和Western blotting法测定hKLK1基因在VSMCs中的表达。结果:PCR、酶切和测序表明携EGFP的重组穿梭质粒pDC316-hKLK1-IRES-EGFP构建正确，并与骨架质粒在293A细胞中成功包装出重组腺病毒Ad-hKLK1-IRES-EGFP，其滴度为4.5×10¹¹/L。重组腺病毒感染VSMCs后，在荧光显微镜下观察到明亮绿色荧光蛋白表达，感染率高达90％以上，可检测到hKLK1基因的mRNA及蛋白表达，并与感染时间(1 d-7 d) 有显著依赖关系，峰值感染复数为100 MOI。结论:成功构建并包装了携EGFP和hKLK1基因的双顺反子重组腺病毒载体系统Ad-hKLK1-IRES-EGFP；感染VSMCs可检测到基因hKLK1和EGFP的独立共同高表达，该系统为一直观、安全、高效的基因转移系统。     

携带红色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒载体的构建及其体外试验研究

目的: 采用体外连接技术构建含红色荧光蛋白( RFP )报告基因的重组腺病毒载体, 为基因治疗与基因疫苗研究提供重要工具。方法: 将pTurboRFP-N上的含 RFP 基因片段,经酶切连接定向克隆至转移载体pShuttle上,构成重组质粒pShuttle-TurboRFP-N。用I- Ceu I/PI- Sce I双酶切重组质粒pShuttle-TurboRFP-N和骨架质粒pH5'040 pkGFP-II,回收目的片段,连接,获得重组腺病毒载体AdH5'.040.CMV.RFP-N。将其线性化后,经脂质体介导转染至AD293细胞内包装出重组腺病毒颗粒。通过荧光显微镜观察其在AD293细胞内的包装效率和RFP表达情况。扩增并再次感染AD293细胞检测病毒颗粒感染能力,并测定其生物活性及滴度。将所构建的重组腺病毒载体AdH5'.040.CMV.RFP-N与对照腺病毒载体AdH5.CMV.EGFP 在体外感染人肺癌细胞系A549 和乳腺癌细胞系MDA-MB-231。通过荧光蛋白RFP和EGFP的表达,比较它们对以上肿瘤细胞的感染效率。结果: 经酶切鉴定,证明已正确构建重组腺病毒载体AdH5'.040.CMV.RFP-N;经AD293细胞包装成具有感染性的病毒颗粒,并能在真核细胞中高效表达目的基因;扩增纯化后获得重组腺病毒颗粒数为3.6×10¹⁵vp/L,滴度达1.8×10¹³pfu/L。重组腺病毒载体AdH5'.040.CMV.RFP-N感染人肺癌细胞系A549 和乳腺癌细胞系MDA-MB-231的感染效率,高于对照腺病毒载体AdH5.CMV.EGFP (P＜0.05)。结论: 成功构建了携带 RFP 报告基因的重组腺病毒载体,并能够在AD293细胞中高效地表达,对肿瘤细胞的感染效率高。RFP对GFP是一种很好的代替和补充,为基因治疗与基因疫苗研究提供更多的荧光标签。     

EGFP-pBABE逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的 构建表达增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的EGFP-pBABE逆转录病毒载体并对其表达进行鉴定.方法 从pEGFP-N3质粒上切下EGFP片段,连接到pBABE载体,构建EGFP-pBABE重组质粒;将该重组质粒转染到PT67细胞后,荧光显微镜下观察EGFP的表达;收集逆转录病毒感染宫颈癌SiHa细胞后荧光显微镜下观察EGFP的表达.结果 成功构建EGFP-pBABE重组质粒.该质粒转染PT67细胞24 h后,荧光显微镜下可观察到EGFP的表达;用该重组质粒包装的逆转录病毒感染宫颈癌SiHa细胞36 h后,在荧光显微镜下可观察到明显的EGFP表达.结论 成功构建表达EGFP的EGFP-pBABE逆转录病毒载体,为进一步利用该载体制备逆转录病毒并观测逆转录病毒感染细胞的效率奠定了良好的实验基础.     

携带大鼠酪氨酸羟化酶基因慢病毒载体的构建及转染

目的:构建携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)和大鼠酪氨酸羟化酶(TH)基因的慢病毒载体,转染大鼠骨髓间充质干细胞(rMSC),观察TH基因的表达.方法:RT-PCR方法获得大鼠TH基因,将其克隆至慢病毒载体.通过瞬时转染法包装出病毒上清,鉴定滴度.感染rMSCs,荧光显微镜下观察EGFP的表达、转染效率,RT-PCR、免疫印迹法分别检测TH mRNA和蛋白的表达情况.结果:重组慢病毒载体质粒pNL-TH-IRES2-EGFP经双酶切鉴定正确,所获TH基因经测序后与GenBank报道序列完全一致;生产的病毒浓缩后滴度为4.1×10~7TU/ml;感染rMSCs结果显示荧光激发可见绿色荧光,TH-rMSCs、空载体-rMSCs组5d转染效率差异无统计学意义.RT-PCR、免疫印迹法显示TH基因成功在rMSCs中表达.结论:成功构建带有EGFP和大鼠TH基因的慢病毒载体,并获得TH-rMSCs基因工程细胞.     

不同载体转基因效率及AAV2介导bFGF基因在肌腱中表达的研究

目的:比较腺病毒、腺相关病毒和脂质体-质粒三种载体在肌腱中的基因转染效率并观测腺相关病毒载体介导bFGF基因在肌腱愈合过程中表达.方法:用微量注射器将携带增强绿色荧光蛋白报告基因的三种载体注射入正常肌腱中,用荧光显微镜观测术后不同时间点肌腱内EGFP的表达.将AAV2-bFGF病毒颗粒注入损伤肌腱,使用免疫组化染色观测bFGF在肌腱内表达.结果三种不同的载体转染肌腱3天后有EGFP表达、7天最明显、14天时下降;21天时少有表达.在同期的时间点,注射腺病毒、腺相关病毒组肌腱内EGFP表达明显强于质粒载体,而腺病毒、腺相关病毒两组之间无较大区别.免疫组化显示注射AAV2-bFGF后的第2、3和4周的肌腱表达很强的bFGF.结论:腺病毒、腺相关病毒载体的基因转染效率高于脂质体-质粒载体,AAV2携带的外源性bFGF基因在肌腱细胞内较强表达,提示我们将来在体内转基因到肌腱的研究中能够选择腺病毒和腺相关病毒载体作为运载基因的工具.     

重组腺病毒AdEGFP/hVEGF165快速构建及在骨髓移植小鼠体内的分布和表达效率

目的　研究增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)标记的人血管内皮细胞生长因子 16 5(hVEGF16 5 )重组腺病毒载体的快速构建及在骨髓移植后小鼠体内的分布和表达效率。方法　利用细菌内质粒间同源重组法快速构建EGFP标记的重组腺病毒Ad EGFP hVEGF16 5 ;通过体外试验观察病毒的形态、滴度和安全性 ;经尾静脉注射 3× 10 8PFU的重组腺病毒给同基因骨髓移植BALB c小鼠 ,在不同时间检测重组腺病毒在小鼠体内分布和hVEGF16 5的表达。结果　通过细菌内质粒间同源重组法在短期内成功构建了复制缺陷型重组腺病毒载体Ad EGFP hVEGF16 5 ;纯化的病毒颗粒在电镜下成分均一 ,滴度可达 10 1 0 ～ 10 1 1 PFU ml。Hela细胞感染病毒后经多次传代未见细胞病变。借助于荧光显微镜在不同时期观测到小鼠心、肺、肝、脾、肾、小肠组织EGFP ;RT PCR分析和免疫组化染色显示脏器内有显著VEGF表达。各脏器未见明显毒性反应。ELISA法检测小鼠血浆中VEGF水平升高可达(86 6 6 7± 97 13)pg ml。结论　本研究结果证实细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点 ,并成功介导了hVEGF16 5基因在骨髓移植小鼠体内的安全、稳定表达 ,为今后在骨髓移植过程中开展基因治疗奠定了基础。     

人胸腺基质淋巴生成素基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的: 构建含人胸腺基质淋巴生成素基因(TSLP)的重组腺病毒载体并表达, 以研究其免疫学功能。方法: 将由人胚肺细胞扩增得到的TSLP基因, 克隆于真核表达载体pcDNA3. 1中, 再亚克隆至穿梭质粒pShuttle中, 并与腺病毒骨架载体pAdEasy -1共同转化大肠杆菌。以获得的重组质粒线性化后转染HEK293细胞, 并包装成病毒颗粒。采用PCR法对重组腺病毒基因进行鉴定, 并以Westernblot检测TSLP蛋白的表达。结果: 通过细菌内同源重组, 成功构建带有人胸腺基质淋巴生成素基因的重组腺病毒质粒, 转染 293细胞后, 包装的重组病毒经PCR检测表明, 基因组含有目的基因,病毒的滴度可达 1×1011pfu/L。Westernblot证实, 感染的肿瘤细胞中有相应基因产物的表达。结论: 通过菌内重组可高效制备带有特定基因的重组病毒。所制备的Ad -TSLP可成功表达相应基因产物, 为进一步研究这一新型细胞因子的功能奠定了基础。     

hPDGF-BB腺病毒表达载体的构建及其在表皮干细胞中的表达

目的构建hPDGE-BB(human platelet-derived growth factor-BB)腺病毒表达载体并观察其在人表皮干细胞(human epidermal stem cells,hESCs)中PDGF-BB蛋白的表达情况。方法从质粒pCMV-SPORT6上通过PCR扩增hPDGF-BB基因,将其酶切后连接到穿梭质粒pAd-track-CMV上,线性化后在BJ5183细菌中和骨架质粒pAdeasy-1进行同源重组,筛选阳性克隆并酶切鉴定,线性化后转染入HEK293细胞中进行包装、扩增,得到重组腺病毒rAD-PDGF。原代培养hESCs,流式细胞术分析hESCs的纯度,用收集的腺病毒感染靶细胞hESCs后,Westornblot检测其表达PDGF-BB情况。结果成功使重组腺病毒载体rAD-PDGF携带PDGF-BB基因,流式细胞术检测hESCs的纯度达88%以上,rAD-PDGF成功导入hESCs后,Westorn blot检测hESCs能表达PDGF-BB蛋白。结论成功构建的重组腺病毒rAD-PDGF在hESCs中表达PDGF-BB蛋白。     

携人IL-12基因腺病毒的构建及其对Hep3B细胞增殖及TGF-β表达的影响

目的:构建携带人IL-12的重组腺病毒,观察其对Hep3B增殖及TGF-β表达的影响。方法:PCR扩增IL-12基因,构建穿梭质粒pAdTrack-IL-12;穿梭质粒经Pme I线性化后转化AdEasier Cell,E.coli BJ5183内同源重组;PacⅠ酶切重组腺病毒质粒,转染AD293,包装病毒;病毒pAd-IL-12感染肝癌细胞Hep3B,以RT-PCR、Western blot检测白介素12的表达;MTT法检测肝癌细胞的增殖情况;RT-PCR检测转化生长因子-β(TGF-β)的表达。结果:成功构建携IL-12基因的重组质粒,并成功包装可高效感染Hep3B的腺病毒pAd-IL-12;RT-PCR以及Western blot结果表明,病毒pAd-IL-12感染Hep3B后可高表达白介素12,并且与对照组相比Hep3B增殖能力显著降低(P<0.05),TGF-β表达量也降低(P<0.05)。结论:可高表达IL-12的腺病毒包装成功,感染肝癌细胞Hep3B后抑制其增殖,同时也下调TGF-β的表达,为进一步研究IL-12的肿瘤治疗作用奠定了基础。     

大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体及在乳鼠心肌细胞中的表达

背景：过氧化物酶体增生因子活化受体α是调节心脏脂肪酸氧化的重要核转录因子,利用基因工程技术构建其重组腺病毒载体对研究心脏能量代谢障碍机制具有重要意义。 目的：构建大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体,评价其在原代培养的乳鼠心肌细胞中的表达效率。 方法：采用RT-PCR法自SD大鼠肝脏扩增过氧化物酶体增生因子活化受体α基因,将其克隆至带有增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒载体pAd-Track-CMV。线性化重组穿梭质粒载体并转化入含有腺病毒骨架质粒pAd-Easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒。用脂质体将线性化的重组腺病毒载体质粒转染于人胚肾293细胞以包装、扩增,纯化病毒后计算滴度。用纯化的重组腺病毒转染心肌细胞,荧光显微镜观察转染效率;荧光定量PCR、免疫印迹法检测细胞过氧化物酶体增生因子活化受体α mRNA、蛋白表达。 结果与结论：成功构建携带大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因的重组腺病毒载体,病毒滴度为3.5×10¹¹ pfu/L。重组腺病毒转染心肌细胞的效率达90%以上,被转染细胞目的基因mRNA、蛋白表达显著增高。该载体的成功构建为研究过氧化物酶体增生因子活化受体α基因在心肌能量代谢障碍中的作用奠定基础。     

重组hFGF-10腺病毒促进角质形成细胞增殖

目的： 构建重组人成纤维细胞生长因子10（hFGF-10）腺病毒，并观察其对角质形成细胞增殖的影响，为探索新的皮肤组织工程种子细胞的来源奠定基础。方法: 用PCR方法扩增得到人成纤维细胞生长因子10（hFGF-10）基因片段，与穿梭载体pAdTrack-CMV连接，获得的重组质粒pAdTrack-CMV-hFGF-10经Pme I线性化后，通过电转法导入含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，获得重组腺病毒质粒pAdEasy-hFGF-10，经酶切鉴定后转染HEK-293细胞，在HEK-293细胞中包装并扩增腺病毒。用重组腺病毒感染HaCat细胞，Western blotting检测培养上清中的重组hFGF-10。MTT法检测重组腺病毒对角质形成细胞增殖的影响。结果: 成功构建了含hFGF-10基因的重组腺病毒，可高效感染HaCat细胞，培养上清与hFGF-10抗体呈阳性反应。重组腺病毒对角质形成细胞的增殖具有促进作用。结论: 制备出的重组腺病毒感染HaCat细胞后分泌表达hFGF-10，并可促进HaCat细胞的增殖。     

靶向性反向半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3重组腺病毒诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的 观察靶向性反向半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(r-caspase-3)重组腺病毒体外诱导肝癌细胞凋亡的效果和特异性.方法 构建甲胎蛋白(AFP)增强子和白蛋白(ALB)启动子腺病毒载体(pAdTrack-EAFP-PALB),亚克隆r-caspase-3至载体pAdTrack-EAFP-PALP,Pme Ⅰ线性化pAdTrack-EAFP-PALB/r-caspase-3,电转化至BJ/AdEasy菌,获得重组腺病毒骨架pAdeasy-EAFP-PALB/r-caspase-3.Pac Ⅰ酶切后脂质体转染AD293细胞进行包装、扩增、获得病毒.绿色荧光蛋白(GFP)监测病毒滴度和感染效率;RT-PCR和Western印迹法检测r-caspase-3在HepG2细胞中的表达;流式细胞术检测其特异性诱导肝癌细胞凋亡的作用.结果 穿梭载体pAdTrack-EAFP-PALB/r-caspase-3酶切、测序正确.穿梭载体、pAdeasy-1载体同源重组后PCR及Pac Ⅰ酶切鉴定结果表明pAdeasy-EAFP-PALB/r-caspase-3重组成功.转染AD293细胞后可观察到GFP的表达.病毒感染HepG2细胞总DNA经RT-PCR和Western印迹均可检测到目的 基因的表达,证实Ad-EAFP-PALB/r-caspase-3病毒颗粒包装成功;靶向性r-caspase-3重组腺病毒感染各组细胞24 h后,各组凋亡指数分别为:HepG细胞48.2%、7721细胞17.7%、L-02细胞7.3%、MDA-MB-231细胞0%.结论 成功构建了靶向性Ad-EAFP-PALB/r-caspase-3重组腺病毒,体外实验表明其具有凋亡诱导靶向性,为进一步研究靶向性r-caspase-3基因治疗肝细胞肝癌及其生物学功能提供了依据.     

前凋亡因子bimS基因的重组腺病毒载体构建

为探讨前凋亡因子bimS用于肿瘤基因治疗奠定基础,拟构建bimS的重组腺病毒载体。采用RT-PCR方法从人HL-60细胞扩增目的基因bimS;克隆至T载体测序正确。亚克隆bimS基因到腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV上,形成含目的基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因的穿梭载体。穿梭载体pAdtrack-CMV-bimS和病毒骨架载体pAdEasy-1经电穿孔法转入BJ5183大肠杆菌中行同源重组,获得重组pAdEasy-CMV-bimS,线性化后脂质体法转染人胚肾(HEK)293细胞进行病毒的包装、扩增、病毒滴度测定以及瞬时表达的观察;将病毒以MOI=100感染HEK293细胞,western blot检测bimS蛋白表达。结果显示病毒感染293细胞48~72h观察到GFP表达,7d出现典型细胞病变症状(CPE);提取培养上清中病毒DNA,以PCR法可检测到bimS的扩增产物;western blot检测病毒感染的293细胞总蛋白,与未感染的阴性对照细胞相比,bimS蛋白表达明显高于阴性对照细胞。表明重组bimS腺病毒构建成功;为进一步进行肿瘤基因治疗的体内外试验奠定基础。     

重组hCGPx腺病毒对人肾小管上皮细胞(HK-2)缺氧再复氧损伤的保护作用

目的:研究重组腺病毒介导的人胞质型谷胱甘肽过氧化物酶(hCGPx)转染对人肾小管上皮细胞缺氧再复氧损伤的保护作用。方法:将含hCGPXcDNA的质粒pGEM-T-hCG-Px和重组腺病毒穿梭质粒pACCMV-pLpA重组,构建pACC-MV-hCGPx穿梭质粒后,与包装质粒pJM17共转染293细胞,构建重组腺病毒AdCMV-hCGPx。以重组腺病毒载体AdCMV-hCGPx转染体外培养的人肾小管上皮细胞株HK-2,以转染空载体的HK-2细胞为对照组,检测转染细胞中CGPx的表达水平。将HK-2细胞经缺氧再复氧损伤处理后,分别检测细胞的存活率、凋亡率及死亡率。结果:各转染组细胞中CGPx的表达率显著高于对照组(P<0.01)。经缺氧再复氧损伤处理后,AdCMV-hCGPx转染组细胞的存活率较对照组明显增强,死亡细胞明显减少,细胞凋亡明显受到抑制。结论:重组腺病毒介导的hCGPx转染人肾小管上皮细胞可保护缺氧再复氧引起的损伤。