中药复方肝癌-1号逆转肝癌多药耐药的实验研究

目的分析中药复方肝癌-1号逆转阿霉素(ADM)诱导的HepG2/ADM细胞的多药耐药性的机制。方法以亲本细胞HepG2为对照,MTT法观察肝癌-1号对HepG2/ADM细胞的毒性作用;流式细胞仪检测肝癌-1号作用后细胞表面p-糖蛋白(P-gp)表达阳性率;逆转录聚合酶链式反应检查多药耐药基因(MDR1)mRNA表达水平;MTT法观察肝癌-1号处理后的HepG2/ADM细胞对阿霉素、表阿霉素、氟尿嘧啶耐药的逆转作用。结果肝癌-1号<50μmol/L对HepG2/ADM细胞无明显毒性,半数抑制率(IC50)为75μmol/L;50μmol/L的肝癌-1号可部分抑制HepG2/ADM细胞P-gp合成及MDR1 mRNA的表达,可逆转HepG2/ADM的耐药性,对阿霉素、表阿霉素、氟尿嘧啶的逆转倍数分别为3.94(P<0.01),1.72(P<0.05),1.67(P<0.05)。结论肝癌-1号通过抑制HepG2/ADM耐药细胞MDR1 mRNA的表达及P-gp合成,能部分逆转HepG2/ADM的耐药性。     

槐耳清膏体外逆转人肝癌细胞HepG2/ADM多药耐药性

目的探讨槐耳清膏体外逆转人肝癌细胞多药耐药性的作用及可能的机制。方法MTT法检测槐耳清膏的细胞毒作用和处理前后耐药细胞对化疗药物的敏感性;流式细胞仪检测细胞内阿霉素浓度;RT-RCR检测MDR1基因的表达。结果槐耳清膏在0.01g/L以下剂量时对HepG2和HepG2/ADM耐药细胞株的抑制率均<10%,半数抑制率(IC_(50))分别为0.917 g/L和1.66 g/L,无细胞毒剂量即0.008 g/L的槐耳清膏能部分逆转HepG2/ADM细胞的耐药性,与之合用使耐药肝癌细胞对阿霉素、顺铂、丝裂霉素、氟尿嘧啶的相对逆转效率分别为79%、73.5%、97.4%和86.7%,HepG2/ADM细胞内阿霉素浓度明显增加,MDR1表达下降了33.7%。结论槐耳清膏具有体外逆转人肝癌细胞多药耐药性的作用,可能与下调MDR1表达、增加细胞内化疗药物积累有关。     

人结肠癌耐药细胞系SW480/ADM的建立及其生物学特性

目的　建立人结肠癌SW4 8 0耐阿霉素细胞系 (SW4 8 0 /ADM) ,研究其耐药机制及逆转。方法　应用人结肠癌细胞系SW4 8 0,以递增阿霉素 (ADM)浓度的方法,体外连续培养建成一株SW4 8 0 /ADM。观察该细胞生长规律。用MTT比色法检测该耐药细胞系的多药耐药性;以流式细胞术检测该耐药细胞的细胞周期分布、细胞表面多药耐药基因 (MDR)的表达产物P-糖蛋白 (P gp) 、多药耐药相关蛋白 (MRP)及谷胱甘肽硫转移系统 (GSH/GST)的表达;用高效液相色谱仪检测耐药细胞内阿霉素含量。结果　SW4 8 0 /ADM细胞与SW4 8 0细胞相比,生长缓慢,倍增时间延长,细胞周期分布发生改变;SW4 8 0 /ADM细胞较SW4 8 0的阿霉素半数抑制浓度 (IC50 )增大 1 3. 2 2倍,并对多种抗癌药物产生耐药性。SW4 8 0 /ADM细胞表面MDR的表达产物P gp,MRP和GSH/GST的表达均较SW4 8 0细胞显著升高 (P< 0. 0 1 )。SW4 8 0 /ADM细胞内阿霉素含量明显低于SW4 8 0细胞。结论　SW4 8 0 /ADM细胞对阿霉素的耐药是获得性的,并呈多药耐药性特征,可用于对人结肠癌耐药、逆转和MDR机制等方面的研究。     

DJ-1 shRNA靶向逆转人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADM的耐药性

目的探讨干扰癌基因DJ-1表达对人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADM多药耐药性(multi-drug resistence,MDR)的影响。方法将构建的DJ-1 shRNA真核表达载体,用脂质体转染至人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADM;用RT-PCR和Western blot法分别检测细胞MDR 1 mRNA和P-糖蛋白(P-glycopro-tein,P-gp)的表达;MTT法检测细胞对化疗药物的敏感性。结果 DJ-1 shRNA靶向干预MCF-7/ADM细胞DJ-1表达后,DJ-1 shRNA组细胞MDR 1 mRNA和P-gp表达水平较空白与阴性对照组明显下降(P0.0 1);细胞内Adriamycin浓度明显增加;细胞对Adriamycin的敏感性增强2.6 8倍。结论 DJ-1shRNA可降低乳腺癌MCF-7/ADM细胞的MDR,为研究逆转乳腺癌化疗耐药提供了新方法。     

人肝癌HepG2多药耐药细胞系的部分生物学性状研究

目的　研究人肝癌多药耐药 (MDR)的机制 ,建立HepG2多药耐药细胞系并研究其部分生物学性状。方法　应用HepG2细胞系 ,通过培养液中阿霉素 (ADM )的浓度梯度增加法 ,得到肝癌多药耐药株HepG2 /ADM。Westernblot增强化学发光法 (ECL)检测细胞株表面多药耐药基因(MDR1)的表达产物P 糖蛋白 (P 170 )、多药耐药相关蛋白 (MRP)及肺耐药蛋白 (LRP)的表达水平。结果　耐药细胞的倍增时间延长 2 .0 5倍。该耐药模型的P 170表达水平较亲本细胞升高3 .90倍 (P <0 .0 1) ,但MRP及LRP无明显变化。结论　HepG2 /ADM同其亲本细胞相比 ,其耐药性、倍增时间有明显改变 ;多药耐药性主要与MDR1的高表达有关。     

中药复方肝癌-1号逆转肝癌多药耐药的实验研究

目的 分析中药复方肝癌-1号逆转阿霉素（ADM）诱导的HepG2／ADM细胞的多药耐药性的机制。方法 以亲本细胞HepG2为对照，MTT法观察肝癌-1号对HepG2／ADM细胞的毒性作用；流式细胞仪检测肝癌1号作用后细胞表面p-糖蛋白（P-gp）表达阳性率；逆转录聚合酶链式反应检查多药耐药基因（MDR1）mRNA表达水平；MTT法观察肝癌-1号处理后的HepG2／ADM细胞对阿霉素、表阿霉素、氟尿嘧啶耐药的逆转作用。结果 肝癌-1号〈50μmol／L对HepG2／ADM细胞无明显毒性，半数抑制率（IC50）为75μmol／L；50μmol／L的肝癌-1号可部分抑制HepG2／ADM细胞P-gp合成及MDR1 mRNA的表达，可逆转HepG2／ADM的耐药性，对阿霉素、表阿霉素、氟尿嘧啶的逆转倍数分别为3．94（P〈0．01），1．72（P〈0．05），1．67（P〈0．05）。结论 肝癌-1号通过抑制HepG2／ADM耐药细胞MDR1 mRNA的表达及P-gp合成，能部分逆转HepG2／ADM的耐药性。     

黑色素瘤分化相关基因-7/白细胞介素-24促进阿霉素杀伤肝癌细胞MHCC-97L机制的研究

目的 探讨黑色紊瘤分化相关基因-7/白细胞介素-24(MDA-7/IL-24)基因促进阿霉素(ADM)杀伤肝癌细胞,逆转肝癌细胞多药耐药(MDR)的机制.方法 以人肝癌细胞株MHCC-97L为实验对象,使用噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞仪比较Ad. MDA-7联合ADM处理组与ADM组、Ad. MDA-7组对肝癌细胞MHCC-97L和正常肝细胞L02的作用差异.观察MDA-7/IL-24对多药耐药的逆转作用.荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测MDR-1、STAT-3、bcl-2、bax mRNA的变化.Western blot检测gp-170、STAT-3、bcl-2、bax蛋白的表达的变化.结果 MTT表明Ad. MDA-7对正常肝细胞LO2无生长抑制作用(P>0.05).LO2细胞Ad. MDA-7联合ADM组与ADM组细胞生存率差异无统计学意义(P>0.05).低浓度(100 VP/cell)的Ad. MDA-7联合正常肝细胞的IC50浓度的ADM(1.5 mg/L)使得细胞抑制率从ADM组的17.46%上升到79.50%,生长抑制逆转4.55倍(P<0.05).MDR-1mRNA相对表达量从(16.49±0.11)下降至(5.48±0.05).STAT-3 mRNA相对表达量从(13.17±0.08)上升至(21.57±0.11).bcl-2及BAX表达与其他实验组比较差异均有统计学意义(P<0.05).联合实验组P-170蛋白的表达量较其他组明显降低,而磷酸化STAT-3蛋白的表达量亦增加.结论 Ad. MDA-7具有逆转肝癌细胞MHCC-97L多药耐药的作用,其下调MDR-1 mRNA的表达的同时,并通过活化STAT-3信号通路的表达促进肝癌细胞凋亡.     

肝细胞癌SMC7721体内外多药耐药模型的建立及其耐药机制

目的 建立肝细胞癌SMC7721体内外多药耐药细胞株并探讨其耐药机制.方法 通过阿霉素浓度递增筛选出SMC7721/ADM肝癌多药耐药细胞株并建立裸鼠移植瘤模型;噻唑蓝(MTr)检测各组移植瘤对化疗药物的耐药性;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测MDR1和BCRP在各组移植瘤中的表达.结果 SMC7721/ADM对阿霉素,丝裂霉素,5-Fu的耐药性均较亲本细胞明显降低(P<0.01);其移植瘤对3种化疗药物的IC50.均明显低于亲本细胞(P<0.05);SMC7721/ADM细胞中MDR1 mRNA表达是亲本细胞的40.13倍(P<0.01);BCRP mRNA表达与亲本细胞差异无统计学意义(P>0.05).其移植瘤中BCRP mRNA表达是亲本细胞移植瘤的3.69倍(P<0.01);而MDR1 mRNA表达与亲本细胞差异无统计学意义(P>0.05);SMC7721/ADM细胞株中两种蛋白表达显著高于亲本细胞株(P<0.01);SMC7721/ADM移植瘤中BCRP蛋白表达显著高于亲本移植瘤(P<0.01),而两者中MDR1表达差异无统计学意义(JP>0.05).结论 MDR1和BCRP在SMC7721/ADM多药耐药的不同阶段起作用并介导肝细胞癌对不同药物的耐药性.     

利用新型载体运转MDR1 siRNA以逆转胰腺癌化疗耐药性的研究

目的:以新型载体运转MDR1 siRNA导入胰腺癌细胞株后,观察其多药物耐药基因(MDR1)的表达及其对胰腺癌化疗耐药性的影响。方法:采用RNA干扰技术,构建可用于包装成自我复制rAAV病毒载体的质粒,以运转不同长度的MDR1 siRNA。采用实时PCR检测MDR1 mRNA的表达,Western印迹法检测总P-糖基化蛋白(P-gp)的表达水平,用流式细胞仪检测细胞表面的P-gp表达,并从不同层面检测胰腺癌细胞株P-gp表达的抑制率,从而筛选出最佳的质粒载体。采用MTT检测IC50值,进行各载体逆转胰腺癌细胞株化疗耐药性的研究。结果:拟用于构建自我复制rAAV病毒载体的25-mer MDR1 siRNA质粒能有效地将目的基因MDR1 siRNA导入胰腺癌细胞株,并予稳定的表达,发挥作用。导入胰腺癌细胞株的MDR1 siRNA能有效地在mRNA水平上沉默MDR1基因,显著抑制其表达,使其蛋白产物P-gp的表达明显减少,及其在细胞膜上的数量显著降低。结果能有效、显著地逆转胰腺癌细胞株的化疗耐药性,转染前SW1990/ADM细胞对ADM的IC50值约是转染后的50倍。结论:采用可用于构建新型sc-rAAV载体的质粒作为投递siRNA的工具,并选择MDR1为研究靶点,通过实验证实该策略在逆转胰腺癌化疗耐药性中的有效性。     

裸鼠人肝癌原位移植多药耐药模型的建立及其耐药机制的探讨

目的　在体内建立人肝癌裸小鼠原位移植多药耐药模型,并研究其耐药机理。方法采用人肝癌（BEL-7402）裸小鼠（4～6周龄）原位移植,给予阿霉素(1.5mg/kg体重,每周1次)腹腔注射诱导耐药（共8周）,经四唑蓝(MTT)快速比色法检测原代培养的耐药细胞对抗癌药的敏感性,以流式细胞仪检测癌细胞表面mdr1基因产物P-糖蛋白（P-gp）的表达,并用罗丹明试验观察该蛋白功能。结果　移植瘤组织形态及生物学方面符合人肝癌特征,实验组肝癌细胞表面P-gp表达为(75.45±5.67)%,而对照组表达仅(4.25±1.28)%,差异有非常显著性（P＜0.01）,对阿霉素的耐药倍数提高了16.67倍,对羟基喜树碱具有交叉耐受性（13.67倍）。耐药细胞表面P-gp有较强的药物外排功能。结论　阿霉素较易诱导原位移植于裸小鼠的人肝癌多药耐药性的产生,其耐药倍数与临床肝细胞癌相似。该模型的建立对研究肝癌多药耐药的产生机制以及逆转其多药耐药性具有重要价值。     

表达人端粒酶逆转录酶小干扰RNA的增殖腺病毒对肝癌细胞的抑制作用

目的 观察表达人端粒酶逆转录酶小干扰RNA(hTERT-siRNA)的增殖腺病毒(ZD-hTERT)对人肝癌Bel-7402细胞增殖及凋亡影响.方法 ZD-hTERT、增殖腺病毒ZD-EGFP、表达hTERT-siRNA的增殖缺陷腺病毒Ad-hTERT、增殖缺陷腺病毒Ad-EGFP分别感染人肝癌Bel-7402细胞.Western blot法检测ElA表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot法检测hTERT表达;噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活;结晶紫染色法检测细胞毒作用;原位末端标记法(TUNEL)检测凋亡.结果 感染ZD-hTERT、ZD-EGFP的Bel-7402细胞表达ElA;抑制hTERT表达作用依次为ZD-hTERT>Ad-hTERT>ZD-EGFP>Ad-EGFP;抑制Bel-7402细胞生长及细胞毒作用依次为ZD-hTERT>ZD-EGFP=Ad-hTERT>Ad-EGFP.感染ZD-hTERT、ZD-EGFP、Ad-hTERT、Ad-EGFP的Bel-7402细胞凋亡率(%)分别为(88.1±2.2)、(39.2±2.1)、(42.1±5.1)、(7.5±2.1),ZD-hTERT诱导凋亡作用最高(P<0.01).结论 表达hTERT-siRNA的增殖腺病毒能显著抑制人肝癌Bel-7402细胞hTERT基因表达,进而抑制其增殖,促进其凋亡.     

粉防己碱对膀胱癌BIU-87/ADM细胞株的耐药逆转作用及其机制

目的 探讨粉防己碱(TET)对膀胱癌耐药株BIU-87/ADM多药耐药性(MDR)的逆转作用及其机制。方法 应用CCK法观察不同浓度TET( 1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L)对BIU-87和BIU-87/ADM细胞生长的抑制作用,并测定1 mg/L TET逆转多药耐药的活性;Annexin-V与PI双染法流式细胞术分析1 mg/L TET对细胞凋亡的影响;免疫荧光法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测1 mg/L TET对P-gp蛋白和MDR1表达水平的影响;细胞免疫化学法和RT-PCR法检测1 mg/L TET对BIU-87/ADM细胞Caspase-3和Survivin表达水平的影响。结果 1.0 mg/L无毒剂量下的TET显著增加阿霉素(ADM)对耐药株BIU-87/ADM的细胞毒性作用(P＜0.01),逆转指数(RF)为5.33,而对敏感株BIU-87无明显作用(P＞0.05),RF为1.33;1.0 mg/L TET和1.5 mg/LADM共同作用48 h,能使BIU-87/ADM细胞凋亡率增加至(40.86±4.35)％,与单独应用ADM的(12.42 ±3.24)％比较差异有统计学意义(P＜0.01)。而BIU-87细胞凋亡率为(61.23 ±5.46)％,与单独应用ADM的(57.79±4.73)％比较差异无统计学意义(P＞0.05)。TET能明显抑制mdr1mRNA和P-gp蛋白在BIU-87/ADM的表达;与单用ADM比较,TET和ADM联用能使BIU-87/ADM细胞株中Caspase-3的表达水平明显升高(P＜0.01),Survivin的表达水平显著降低(P＜0.01)。结论 粉防己碱能逆转BIU-87/ADM细胞的多药耐药性,这一作用可能与粉防己碱抑制P-gp的表达和增强化疗药诱导细胞凋亡有关。     

siRNA抑制肝癌细胞甲硫氨酸腺苷转移酶2A基因表达

目的构建siRNA体内表达载体pSilence-2．1-U6-siRNA，筛选出抑制甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT)2A表达的有效靶序列，为MAT2A的功能研究奠定了基础。方法以MAT2A为目的基因，以产生siRNA质粒载体pSilence-2．1-U6为表达模板，细胞内转录合成4条siRNA，并构建携带荧光素酶报告基因的重组质粒载体plucF-MAT2A。脂质体转染法将重组质粒载体plucF-MAT2A与产生siRNA的质粒pSilence-2．1-U6共转染293T细胞，定量测量荧光素酶活性，初步筛选出抑制荧光素酶表达的有效siRNA，然后将有效的siRNA转染Bel-7402肝癌细胞，半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测MAT2A mRNA表达，并检测转染后肝癌细胞MAT的活性及细胞凋亡情况，进一步证实siRNA对MAT2A表达的抑制效果。结果所合成的4条小干扰RNA中有2条抑制荧光素酶表达，抑制效率分别为81％和89％，并特异性抑制肝癌细胞MAT2A mRNA表达，降低了肝癌细胞中MAT活性，诱导肝癌细胞凋亡。结论siRNA抑制肝癌细胞MAT2A基因表达。     

靶向Plk1基因的shRNA对肝癌BEL-7402细胞株生物学行为及化疗增敏的影响

目的 利用RNA干扰技术(RNAi),研究表达Polo-like kinase 1 (Plk1)的短发夹RNA (shRNA)载体对肝癌细胞株BEL-7402生物学行为及对化疗药物长春新碱敏感性的影响. 方法 根据靶基因的不同区域构建针对Plk1mRNA的两组干扰质粒shRNA-Plk1:Plk1siRNA-251,Plk1siRNA-1396以及阴性对照质粒Plk1siRNA-hk,利用电穿孔法转染入肝癌细胞株BEL-7402,用长春新碱处理细胞后,用MTT法检测四组细胞的生长抑制率,计算IC50值,流式细胞仪检测各组细胞凋亡. 结果 半定量RT-PCR检测Plk1siRNA-251,Plk1siRNA-1396组Plk1mRNA、Cdc25CmRNA表达较Plk1siRNA-hk转染组与空白对照组明显下降(P＜0.01),p53mRNA表达增加.长春新碱处理后,Plk1siRNA-251组和Plk1siRNA-1396组与BEL7402组之间的生长抑制率有显著性差异(P＜0.01).5 μg/ml浓度长春新碱作用24h后,Plk1siRNA-251组和Plk1siRNA-1396组凋亡指数分别为19.09％ ±3.97％、19.80％ ±5.47％明显高于Plk1siRNA-hk组和BEL7402组(P＜0.01).结论 成功筛选出两条能特异而高效抑制Plk1基因表达的shRNA,可以显著抑制Plk1 mRNA、Cdc25CmRNA及Plkl蛋白的表达,并使p53mRNA表达增高,并明显抑制细胞增殖,能增加长春新碱的化疗敏感性,从而为进一步研究该基因的功能和作用机制提供了新的手段.     

RNA干扰逆转人胃癌细胞多药耐药的研究

目的：研究RNA干扰沉默多药耐药（multidrug resistance,MDR）基因对胃癌多药耐药细胞株BGC-823/5-Fu生长的影响。方法：构建靶向MDR1的shRNA干扰质粒转染人胃癌多药耐药细胞株BGC-823/5-FU,噻唑蓝（MTT）法检测耐药细胞对5-Fu的敏感性,实时荧光定量PCR（Real-time-PCR）检测MDR1 mRNA表达的变化,Western blot检测各组细胞P-gp表达的变化,流式细胞术检测细胞周期变化、凋亡情况。结果：与RNAi-control组和normal组相比,RNAi-MDR1组细胞干扰质粒细胞的IC50明显降低,为2.104±0.242（P〈0.05）,敏感性的相对逆转率为76.8%;MDR1 mRNA表达明显下调（P〈0.05）;P-gp的表达水平降低（P〈0.05）;凋亡率明显升高至（5.757±0.684）%。结论：应用RNA干扰有效抑制了MDR1的表达,使P-gp的表达降低,增强了BGC-823/5-Fu细胞对5-Fu的敏感性,为寻找逆转胃癌细胞多药耐药有效方法奠定了基础。     

转基因法建立膀胱癌耐药细胞株

目的　用转基因法建立膀胱癌耐药细胞株 ,研究细胞耐药机制。　方法　利用脂质体(DOTAP)介导的基因转移方法 ,在浸润性膀胱癌细胞株T2 4中转入mdr1全长cDNA ,经阿霉素筛选 ,获得耐药的T2 4细胞株TADM ;免疫组化、MTT、流式细胞仪、基因组PCR、RT PCR等方法鉴定TADM的耐药表型。　结果　TADM细胞的相对耐药指数为 4 1.6 ,基因组中有mdr1cDNA插入 ,P 糖蛋白及mdr1mRNA表达增加。　结论　TADM细胞具有良好的耐药表型 ,其耐药性的产生是由mdr1全长cDNA稳定整合在T2 4细胞基因组中 ,大量表达P 糖蛋白引起。转基因法建立膀胱癌耐药细胞株具有耗时短、耐药强度高而稳定等特点。     

脑源性神经营养因子对肝癌细胞氟尿嘧啶化疗敏感性的影响

目的：探讨外源性脑源性神经营养因子（BDNF）对人肝癌Bel-7402细胞氟尿嘧啶（5-FU）化疗敏感性的影响。 方法：分别用5-FU（5-FU组）和5-FU+BDNF（5-FU+BDNF组）处理Bel-7402细胞,以无干预的 Bel-7402细胞作为对照组。用MTT法、克隆形成试验和流式细胞仪检测细胞生长与凋亡情况,RT-PCR法检测细胞bcl-2 mRNA的表达。 结果：5-FU组细胞OD值、克隆形成数明显降低,细胞凋亡率明显升高,bcl-2 mRNA表达明显下调（均P<0.05）,与对照组比较差异均有统计学意义（均P<0.05）;而5-FU+BDNF组以上指标的改变均不明显,与对照组的差异均无统计学意义（均P>0.05）。 结论：BDNF能降低肝癌Bel-7402细胞5-FU化疗敏感性,该作用可能与BDNF上调bcl-2的表达,从而抑制细胞凋亡有关。