Slug基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建Slug基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体。方法针对人Slug基因的序列,设计出RNA干扰的靶序列,合成靶序列Oligo DNA,退火形成双链DNA,通过Age I和EcoR I酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生shRNA慢病毒载体,质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆并用插入鉴定引物进行PCR鉴定阳性克隆并测序,同时应用Real-time PCR和Western blot方法检测HCT116结肠癌细胞中Slug基因mRNA和蛋白的表达情况。结果 PCR鉴定与DNA测序证实合成的含Slug shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。Western blot证实Slug RNAi慢病毒载体能够抑制Slug的表达。结论成功构建Slug基因RNAi慢病毒表达载体,为后续感染结肠癌细胞,为探索在结直肠癌发生和发展中的作用奠定基础。     

脯氨酰羟化酶RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

背景：慢病毒载体可稳定介导基因沉默且具有较高的转染效率。 目的：构建并鉴定脯氨酰羟化酶 RNA干扰慢病毒载体。 方法：针对脯氨酰羟化酶2基因序列设计RNA干扰靶序列,合成靶序列的寡聚DNA,退火形成双链DNA,与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切的pGCSIL-GFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞,产生重组RNA干扰慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。 结果与结论：PCR和DNA测序证实合成的含脯氨酰羟化酶短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pGCSIL-GFP载体。说明实验成功构建脯氨酰羟化酶基因RNA干扰慢病毒载体。     

BIRC5 shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的:应用RNA干扰技术,以人BIRC5基因为靶基因,设计合成3对短发夹结构的互补DNA序列和一对阴性对照序列,构建慢病毒干扰载体并鉴定。方法:将设计合成的单链引物退火成双链oligo序列,连接入经AgeI和EcoR I双酶切线性化的pMAGic慢病毒质粒载体中,经转化DH5α感受态细胞并筛选出阳性克隆,采用PCR扩增和DNA测序鉴定阳性克隆。结果:PCR扩增产物经凝胶电泳阳性克隆得到335 bp条带,阴性克隆得到298 bp条带,DNA测序结果证实其含设计合成序列。结论:4对BIRC5 shRNA重组慢病毒表达载体构建成功,为研究靶向BIRC5 siRNA对肿瘤细胞增殖抑制与诱导凋亡作用及基因治疗研究奠定了实验基础。     

蛋白激酶B2慢病毒载体的构建及其沉默效果的验证

目的:利用RNA干扰技术,以蛋白激酶B 2(AKT2)的mRNA为靶点,设计、构建AKT-2的RNA干扰慢病毒载体,并对其沉默效果进行验证.方法:根据目的基因设计3个小干扰RNA(siRNA)靶点,进行引物合成.将单链的引物退火成双链oligo序列,连接入双酶切线性化的RNA干扰载体.测序验证正确的转化子,进行高纯度质...     

小鼠水通道蛋白1基因shRNA慢病毒载体构建与鉴定

目的 应用RNA干扰技术,构建小鼠水通道蛋白1(AQP1)基因重组慢病毒载体并鉴定.方法 对小鼠AQP1 mRNA分析,设计合成的单链引物经退火形成双链寡核苷酸序列,连接入经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切线性化的pLKO.1-TRC慢病毒质粒载体中,菌液PCR鉴定并经测序验证.测序正确后与慢病毒包装辅助质粒共转染293T细胞,收集病毒上清经高速离心浓缩后感染小鼠小胶质细胞BV-2,Western blot法分析筛选有效shRNA序列.结果 成功退火合成3对发夹shRNA序列并将其克隆到pLKO.1-TRC载体中,构建重组质粒pLKO-AQP1-SH1、2、3,经菌液PCR鉴定和测序验证载体构建成功.Real-time PCR检测发现重组质粒pLKO-AQP1-SH2感染BV-2细胞后AQP1 mRNA表达最低,Western blot结果进一步验证结果的准确性.结论 成功构建出AQP1基因shRNA慢病毒载体.     

α-珠蛋白基因的RNAi慢病毒载体的构建

目的构建α-珠蛋白基因RNAi重组慢病毒载体。方法合成靶序列Oligo DNA,退火形成双链DNA,克隆到慢病毒p LKO载体,重组载体进行酶切和测序鉴定。在脂质体的介导下将ps PAX2、pMD2.G及慢病毒载体三质粒共转染293T细胞,48h后收集细胞培养上清液。采用终点稀释法测定病毒滴度。结果酶切和测序证实重组载体构建成功。病毒的滴度为3.9×106TU/ml。结论成功构建α-珠蛋白基因RNAi慢病毒载体,为采用RNAi技术治疗β-地贫的研究创造了条件。     

HJURP基因缺陷表达的人胚胎绒毛细胞模型的构建与鉴定

目的构建HJURP基因的RNA干扰慢病毒表达载体并在人胚胎绒毛细胞上鉴定其沉默效率,进而提供HJURP基因缺陷表达的原代胚胎绒毛细胞模型。方法针对目的基因HJURP的序列,按照RNA干扰序列的设计原则,设计合成3个HJURP基因特异性的小分子干扰RNAi靶点,将其合成短发夹RNA(sh RNA)并退火形成双链RNA,克隆至慢病毒载体中形成sh RNA表达载体,通过PCR和测序鉴定获取正确重组载体。将筛选出的重组载体与慢病毒包装质粒共转染293T细胞并测定病毒滴度。随后将其干扰人胚胎绒毛细胞,采用Western blotting和real-Time PCR检测靶基因的沉默效率。结果对重组载体p HBLVU6-Zs Green-Puro进行测序鉴定,证实插入的sh RNA序列无碱基变异。重组慢病毒载体经293T细胞包装后,病毒滴度为108PFU/ml。RNA干扰人胚胎绒毛细胞HJURP基因后,可见感染后内源HJURP的蛋白表达水平显著下降,HJURP m RNA水平明显下降,其中sh RNA1干扰效率大于70%。结论成功构建了HJURP基因的sh RNA慢病毒表达载体,该重组载体可以在细胞水平有效沉默靶基因,为后续研究HJURP基因表达抑制对人胚胎绒毛细胞的增殖凋亡和染色体分离的影响,探索HJURP基因在自然流产发生中的作用机制提供细胞模型。     

人神经菌毛素-1基因shRNA慢病毒载体的构建

目的:构建并鉴定靶向人神经菌毛素-1(NRP-1)基因的小发卡RNA的慢病毒载体.方法:针对NRP-1mRNA设计了4条shRNA,并构建pGCSIL-RFP-shNRP1慢病毒质粒,PCR扩增阳性克隆并测序鉴定.用pGCSIL-RFP-shNRP1、pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞包装产生慢病毒,测定病毒滴度.将慢病毒干扰RNA及含有NRP-1过表达载体共转染293T细胞,Western blot法检测Flag表达,观察NRP-1蛋白相对表达抑制效果.结果:PCR和测序结果与设计的干扰序列一致,病毒滴度达1×109 Tu/mL.转染细胞中NRP-1蛋白相对表达显著降低.结论:成功构建了高效率的人NRP-1基因shRNA慢病毒载体.     

分化型胚胎软骨发育基因1特异性小干扰RNA表达质粒的构建和鉴定

背景：分化型胚胎软骨基因1可调控肿瘤生长、凋亡、衰老相关因子,与肿瘤的发生发展有着重要的联系。 目的：构建针对人分化型胚胎软骨基因1的小干扰RNA表达载体。 方法：从NCBI中查找人分化型胚胎软骨基因1基因全长mRNA序列,利用Katahdin提供的在线小干扰 RNA模板序列设计软件,设计针对分化型胚胎软骨基因1的2条shRNA 的 DNA 模板单链,合成靶向分化型胚胎软骨基因1基因转录可形成茎环结构的寡聚核苷酸,退火后与酶切后的pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒连接,在JM-109菌株中扩增,并进行质粒DNA琼脂糖凝胶电泳分析、紫外分光光度计检测、菌落PCR以及测序鉴定。 结果与结论：将含有分化型胚胎软骨基因1目标序列25 bp 的双链 DNA插入片段,连接到pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒形成重组质粒。质粒DNA琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分析结果确认所提质粒纯度较高,可用于后续实验。菌落PCR结果表明产物大小约为170 bp,与预期相符。测序结果表明pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒已经插入人分化型胚胎软骨基因1的干扰合成片段,无碱基突变。成功构建了靶向分化型胚胎软骨基因1-小干扰 RNA表达载体。     

人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素基因RNAi慢病毒载体的构建及外源性筛选与鉴定

背景:慢病毒载体是一个能够在原代培养的人树突状细胞中进行RNA干扰的有效工具,但目前国内对RNA干扰技术应用于人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素分子的研究却少有报道。目的:拟构建人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素基因RNA干扰慢病毒载体,为调控人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素表达水平提供有利的工具。方法:根据人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素基因的mRNA序列选择4条靶序列,设计合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生DC-SIGN慢病毒载体,采用PCR及测序鉴定,应用Westernblot技术外源性筛选干扰效率高的有效靶序列。用慢病毒包装系统pGCSIL-GFP、pHelper1.0和pHelper2.0共转染包装293T细胞,包装产生慢病毒,以系列稀释法测定病毒滴度。结果与结论:PCR扩增和测序结果显示,人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素核苷酸链序列插入正确,外源性筛选确定两条干扰效率高的有效靶序列。利用筛选确定的有效靶序列,包装产生慢病毒,其浓缩病毒悬液的滴度为1×109TU/mL。证实实验成功构建了DC-SIGN基因慢病毒载体。     

兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体构建与RNA干扰效率的鉴定*

背景：膜联蛋白A1参与细胞凋亡的调控。 目的：针对兔膜联蛋白A1基因构建短发夹RNA慢病毒载体,并检测其对成骨细胞的沉默效率。 方法：针对兔膜联蛋白A1基因设计RNA干扰靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与BamHI和EcoRI 双酶切后的pGLV/H1/GFP载体连接成pGLV-shANXA1,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。pGLV-shANXA1和pGLV/helper-1、pGLV/helper-2、pGLV/helper-3共转染293FT细胞包装产生慢病毒颗粒LV-shANXA1,并测定其滴度,随后将LV-shANXA1感染兔成骨细胞。 结果与结论：经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目标序列一致,shANXA1片段完全正确插入慢病毒载体pGLV/H1/GFP中。包装浓缩慢病毒颗粒LV-shANXA1的滴度为3.8×108 TU/L。经嘌呤霉素筛选后,感染复数为50时,LV-shANXA1对成骨细胞感染效率为80%;感染复数为100时,感染效率为95%。Real-time PCR 和Western blot检测显示,LV-shANXA1-901对膜联蛋白A1基因的沉默效率最高,在感染复数为50时,沉默效率可达71.2%。表明实验成功构建的兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

REST/NRSF基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

背景：神经元限制性沉默因子(REST/NRSF)能负向调控神经元及胰岛细胞分化相关基因的表达。 目的：构建并筛选能高效沉默大鼠REST/NRSF基因的shRNA慢病毒载体。 方法：针对REST/NRSF基因设计4组特异性siRNA靶点,合成靶序列的寡核苷酸序列,退火形成双链DNA,与经Hpa Ⅰ 和Xho Ⅰ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生L-shREST/NRSF慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。包装产生慢病毒颗粒,随后将其感染大鼠骨髓间充质干细胞,采用 Real-time PCR方法检测靶基因在 mRNA 水平的沉默效率。 结果与结论：PCR和测序证实,构建出了REST/NRSF shRNA的慢病毒载体L-shREST/NRSF,并能稳定转染大鼠间充质干细胞,感染效率达100%。4组shRNA序列均有基因沉默效果,并以第3组shRN序列效果最为明显。结果表明,该慢病毒表达载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

大鼠硫酸软骨素蛋白多糖基因shRNA慢病毒载体的构建及干扰效率鉴定

背景：最近研究发现硫酸软骨素蛋白多糖(NG2)在中枢神经系统中参与多种生理病理功能,慢病毒载体可感染分裂期细胞或非分裂期的细胞,并能在细胞内高效稳定的表达。 目的：构建大鼠源性NG2基因shRNA慢病毒载体并检测其干扰效率。 方法：选择大鼠NG2基因RNA干扰的靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与Hpa Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生pLV-NG2-RNAi,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。将重组载体与pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体通过lipofectamineTM 2000共转染293T细胞包装产生慢病毒LV-NG2-RNAi,收集病毒上清并浓缩。采用孔稀释滴度测定法计算病毒滴度。将LV-NG2-RNAi慢病毒感染C6细胞,于感染后96 h提取细胞总蛋白,采用Western blot检测NG2的表达。 结果与结论：经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目的序列一致,实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体LV-NG2-RNAi。包装浓缩慢病毒的滴度为8×1011 TU/L。Western blot检测显示在感染复数为50时,感染LV-NG2-RNAi慢病毒的C6细胞较感染对照慢病毒及未感染细胞NG2的表达明显降低,干扰效率可达100%(P < 0.05)。结果证实了实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体,且该载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

人CDK2基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的： 构建人细胞周期素依赖蛋白激酶2(CDK2)基因RNA干扰慢病毒载体。〖HJ1.8mm〗方法: 利用Invitrogen公司在线软件设计人CDK2（NM001798）shRNA序列，退火形成ds oligo后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端，测序，再与慢病毒载体重组，测序鉴定，在脂质体的介导下将慢病毒的包装混合物和CDK2基因重组慢病毒载体转染293FT细胞，包装成病毒后，收集细胞培养上清液，测定病毒滴度。结果: 测序证实pENTRTM/U6- CDK2-shRNA为阳性克隆，与慢病毒载体重组后测序结果显示也为阳性克隆，CDK2基因重组慢病毒载体传染293FT细胞后48 h, 细胞培养上清液，病毒的滴度为6×108TU/L。结论: 成功构建人CDK2基因RNAi慢病毒载体，为研究CDK2在自身免疫病中的应用提供了稳定的转染细胞载体。     

PYK2靶向短发夹RNA干扰重组体的构建及鉴定

目的:本研究利用RNA干扰技术，以PYK2为靶基因，设计构建重组体，并对重组体进行鉴定，为下一步探索心肌纤维化机制的新途径奠定基础。方法:设计有小发夹结构的8条DNA序列，经退火成互补4对双链，再克隆到载体PAVU6＋27中构建重组体，转化入JM109菌株，提取质粒进行酶切鉴定、测序分析。结果:酶切鉴定和测序分析均提示PYK2靶向RNA干扰重组体的构建成功。结论:PYK2靶向RNA干扰重组体的成功构建，为下一步利用该重组体沉默心脏成纤维细胞中PYK2基因的表达，探索心肌纤维化机制打下基础。     

TCAB1基因RNAi慢病毒载体的构建及在人子宫内膜间质细胞中沉默TCAB1基因的效应

目的构建TCAB1基因RNAi慢病毒载体,为子宫内膜异位症(EMs)的基因靶向治疗提供理论依据。方法化学合成3条靶向TCAB1基因的siRNA,转染HEK-293T细胞,24h后采用荧光素酶报告系统筛选有效siRNA,其对TCAB1mRNA有明显抑制作用。针对已经筛选确定的TCAB1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XhoI和HpaI酶切后的LV1载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV1-shRNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用LV1-shRNA、pRev、pVsvg、pcgv四质粒共转染包装细胞HEK-293T细胞,包装产生慢病毒,分别于转染后48h、72h收取病毒上清,感染人子宫内膜间质细胞(ESC),进行RT-qPCR检测TCAB1基因相对表达量,检测LV1-shRNA干扰效率。结果 PCR和测序证实,成功构建TCAB1 shRNA的慢病毒载体LV1-shRNA。结论成功构建TCAB1基因的RNAi慢病毒载体,其转染ESC细胞后显著抑制了TCAB1的表达,为子宫内膜异位症的基因靶向治疗提供了实验基础。     

大鼠delta阿片受体短发卡RNA干扰真核表达载体的构建和鉴定

背景：长期应用阿片受体治疗疼痛会导致药物耐受或成瘾,可能与delta阿片受体密度上调有关。 目的：设计及构建大鼠delta阿片受体短发卡RNA真核表达载体并鉴定。 方法：根据大鼠delta阿片受体mRNA序列设计并体外合成短发卡RNA寡核苷酸片段,退火形成双链,克隆到线性化质粒pGenesil-1,然后进行酶切和测序鉴定。 结果与结论：酶切证明delta阿片受体-短发卡RNA已经插入到质粒载体pGenesil-1里,测序结果证明均为插入正确的克隆质粒,而且质量均符合设计标准,证实靶向大鼠delta阿片受体基因的短发卡RNA真核表达载体构建成功。     

人NSPc1基因慢病毒过表达系统的建立与鉴定

 目的 建立并鉴定人NSPc1慢病毒过表达系统,以便应用过表达技术进一步研究NSPc1功能。方法 设计针对人NSPc1基因cDNA序列的带酶切位点引物,PCR扩增获得双链DNA后,与酶切后的pLenti6-TO-EGFP-TRIP载体片段进行连接、转化,酶切及DNA测序鉴定重组克隆。提取阳性克隆质粒, 转染293T细胞并用Western blot检测质粒过表达效果。用293T细胞制备慢病毒颗粒,感染293T细胞后收集细胞全蛋白用Western blot检测慢病毒系统过表达效果。 结果 证实人NSPc1基因正确插入慢病毒载体,人NSPc1慢病毒过表达质粒及相应病毒颗粒能有效过表达NSPc1基因。结论 人NSPc1慢病毒表达系统的成功建立,为应用过表达技术研究人NSPc1功能打下了基础。     

增殖抑制基因（HSG）RNAi 慢病毒载体的构建与鉴定

目的为研究HSG基因不同表达程度对肺癌细胞的影响,构建并鉴定HSG基因RNA干扰慢病毒表达载体,以建立HSG基因沉默的人肺癌细胞株。方法针对HSG mRNA设计了4条siRNA,并构建p GCSIL-GFP-HSG慢病毒质粒,通过测序鉴定。采用构建的p GCSIL-GFP-HSG,p Helper1.0和p Helper2.0共感染293T细胞,包装产生慢病毒,测定其滴度。将慢病毒转染人肺腺癌细胞株A549,通过real-time PCR分析HSG基因表达。结果测序结果显示,DNA序列与实验要求序列一致,提示插入人HSG基因RNAi序列正确。荧光显微镜观察转染慢病毒包装质粒后的细胞,见细胞生长良好,荧光强度强烈。测定病毒滴度为3×108TU/ml。real-time PCR分析提示RNA干扰病毒感染A549细胞株后,HSG基因表达显著下调。结论人HSG基因RNAi慢病毒载体构建成功,可用于肿瘤学的进一步应用。     

MEK5基因siRNA重组腺病毒表达载体的构建及其对MEK5的表达抑制

目的 构建人MEK5基因的小干扰RNA(siRNA)重组腺病毒表达载体,观察其在胃腺癌SGC7901细胞中对MEK5的表达抑制.方法 设计并合成针对人MEK5基因3个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,以MluⅠ及XhoⅠ克隆入pRNAT-H1.1/Adeno穿梭载体中,将得到的重组穿梭质粒用PmeⅠ线性化后在大肠...