新生大鼠HIBD后海马增殖细胞分化和bFGF的相关性探讨

目的: 观察新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后海马齿状回增殖细胞分化情况,及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 干预对其的影响,探讨实验大鼠的远期行为学变化.方法: 7日龄SD大鼠随机分为假手术组、缺氧缺血组和bFGF干预组,建立HIBD模型(假手术组不予缺氧处理),分别于术后5、10、14、21 d取脑,采用免疫荧光双标记观察大鼠海马齿状回BrdU/MAP-2、BrdU/GFAP阳性细胞表达,并应用Y-迷宫法进行行为学测定.结果: 缺氧缺血组及bFGF干预组BrdU/MAP-2、BrdU/GFAP阳性细胞于术后10、14 d较5 d时有所升高(P＜0.05),21 d下降至5 d时的水平.与假手术组及缺氧缺血组比较,bFGF干预组于HIBD后各个时间点BrdU/MAP-2、BrdU/GFAP阳性细胞均有所增加(P＜0.05).Y-迷宫测试显示bFGF干预组学习记忆能力较缺氧缺血组有所提高(P＜0.05).结论: HIBD后海马齿状回增殖细胞存在分化为神经元及星形胶质细胞的现象,bFGF能够促进HIBD后海马齿状回增殖细胞向神经元及星形胶质细胞分化,并可以改善大鼠后期行为记忆能力.     

17β-雌二醇对神经干细胞分裂分化作用的观察

目的　探讨雌激素对神经干细胞分裂分化的作用。方法　大鼠神经干细胞培养模型加入剂量为 10mg/L 17β 雌二醇和 10mmol/LBrdU ,分别在培养 4、12h取出细胞 ,进行免疫细胞化学标记。结果　培养 4h ,雌二醇组单位面积细胞总数和BrdU标记细胞与对照组比较差别无显著性 (P=0 2 5 9,P =0 0 6 7) ,培养 12h ,雌二醇组细胞BrdU胞核着色变浅 ,胞浆有着色 ,有 4 0 %的细胞可见明显突起 ,单位面积的细胞总数较对照组无显著性改变 (P =0 0 6 ) ,BrdU标记细胞数目减少 (P =0 0 0 3) ,提示分裂细胞减少。另一方面 ,培养 12h时的雌二醇处理组BrdU免疫荧光阳性细胞的光密度 (OD)显著高于对照组 (P <0 0 1)。结论　 17β 雌二醇可以抑制大鼠神经干细胞分裂 ,促进神经干细胞分化。     

脑梗死大鼠原位神经干细胞的增殖和分化

目的研究成年大鼠脑梗死后原位神经干细胞的增殖和分化。方法运用BrdU标记法检测脑局灶梗死大鼠侧脑室下区(SVZ)与海马齿状回颗粒细胞层下区(SGZ)原位神经干细胞的增殖情况,运用荧光双标法检测其分化的细胞表型。结果SVZ BrdU 细胞数量于脑梗死后1 d开始升高(P<0.01),而SGZ BrdU 细胞则于梗死后4 d开始升高。SVZ与SGZ BrdU 细胞均于7 d达到高峰(P<0.01),14 d开始下降(P<0.01),至28 d后与对照组差异无显著性意义(P>0.05)。半定量显示脑梗死7 d后,SVZ与SGZ BrdU 细胞数分别较假手术组升高5倍和8倍。对原位神经干细胞分化的研究发现,脑梗死后35 d在梗死侧大脑半球,BrdU 细胞总数中约(73.5±15.7)%表达神经元细胞表型NeuN,(37.6±9.9)%表达胶质细胞表型GFAP。结论大鼠脑梗死能刺激原位神经干细胞的增殖并促进了神经再生。     

永生化神经前体细胞治疗大鼠局灶性脑缺血的实验研究

目的 探讨永生化神经前体细胞(INPC)移植对局灶性脑缺血大鼠神经功能的影响及移植细胞在模型大鼠脑内的存活以及分化情况.方法 雄性SD大鼠24只,均采用线栓法建立大脑中动脉缺血(MCAO)模型,随机分为2组(每组12只):脑缺血对照组、INPC移植组.缺血后3 d通过立体定位注射方法分别将等体积的磷酸盐缓冲液、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的INPC悬液注射到2组大鼠纹状体缺血半暗带区.缺血再灌注后对大鼠进行神经损害严重程度评分(NSS).细胞移植后1和4周分别随机处死2组大鼠各6只,取脑组织制作冰冻切片,通过免疫荧光双标技术检测BrdU、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)双阳性细胞和BrdU、神经元特异性烯醇化酶(NSE)双阳性细胞,观察INPC在移植区域的存活及分化情况.结果 脑缺血对照组与INPC移植组比较,细胞移植前后各时点的NSS评分差异均无统计学意义(均P＞0.05).INPC移植组细胞移植后1及4周,均可在移植针道附近及缺血灶周围检测到聚集较明显的BrdU免疫荧光染色阳性的植入细胞,并观察到BrdU染色阳性细胞扩散至全脑,免疫荧光双标技术检测见部分细胞为BrdU、GFAP双阳性的星形胶质细胞或BrdU、NSE双阳性神经元.结论 INPC可在局灶性脑缺血大鼠脑内存活并分化为神经元和星形胶质细胞.     

低(无)糖、缺氧和缺氧/复氧对培养鼠脑胶质细胞活力及致损的影响

目的 :研究氧、糖剥夺和缺氧 /复氧单一或联合因素对培养鼠脑星形胶质细胞活力和引起损伤的影响及其时效反应。方法 :培养的鼠脑星形胶质细胞分为 3组 :无糖组 (D Hanks液 )、低糖组 (DMEM中含 2 .75mmol葡萄糖 )和正常糖组 (DMEM中含 5 .4 9mmol葡萄糖 ) ,各组分别进行不同时间的缺氧和 /或缺氧 /复氧。通以 5 %CO2 +95 %N2 混合气造成缺氧 ,以乳酸脱氢酶 (LDH)漏出率作为细胞受损指标 ,噻唑蓝 (MTT)降解率评测细胞活力。结果 :①在正常氧培养 2 4h ,低糖和无糖培养的细胞LDH漏出率和MTT降解率并不出现明显变化 ;② 3组二项指标在缺氧培养的各时间点依次出现明显变化 ,无糖组为 8h(P <0 .0 5 ) ,低糖组和正常糖组为 12h(P <0 .0 5 ) ,2 4h(P <0 .0 1) ;③缺氧 /复氧引起 3组二项指标出现明显变化 ,其时间点分别为无糖组缺氧 4h +复氧 12h(P <0 .0 5 ) ;低糖组缺氧 8h +复氧 12h (P <0 .0 5 ) ;正常糖组缺氧 8h +复氧 2 4h (P <0 .0 5 ) ;④在同一缺氧和缺氧 /复氧时间点 ,指标值变化程度为无糖组 >低糖组 >正常糖组 ;且两项指标的变化具有时间依赖性 ,呈反变关系。结论 :①氧、糖剥夺和缺氧复氧能引起培养的鼠脑星形胶质细胞的损伤 ;②氧、糖剥夺和缺氧 /复氧联合作用时能增加对培养的鼠脑星形胶质细胞     

绞股蓝皂苷对体外培养神经前体细胞增殖的影响

目的 探讨不同浓度绞股蓝皂苷(GPs)对体外培养的神经前体细胞(NPCs)增殖能力的影响.方法 从孕14d大鼠胚胎端脑分离NPCs,体外贴壁培养7d传代.传代第1代细胞培养3d,免疫荧光法鉴定NPCs纯度后进行分组实验.加不同浓度GPs(0、25、50、100、200、400μg/mL)作用48h后再次鉴定NPCs纯度,采用MTT法检测细胞活力、细胞计数绘制生长曲线、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入法检测细胞增殖能力、Western blot法检测细胞内增殖细胞核抗原(PCNA)表迭情况.结果 传代第1代培养3d的NPCs纯度达97%,GPs作用后不影响NPCs纯度,可使细胞活性增强,生长速度加快,BrdU阳性率增高,PCNA表达水平上调.结论 GPs可通过提高PCNA的表达量,促进体外培养的NPCs增殖,100μg/mL为GPs最佳作用浓度.     

BrdU标记人脐带间充质干细胞及对细胞生物学行为影响的体外研究

目的：探讨5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU）标记人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs）的方法及其对细胞存活、增殖以及凋亡的影响。方法：将hUC-MSCs分离培养并进行细胞表面标志物及多向分化潜能鉴定,取第5代细胞以终浓度分别为10、15、20、25 ?滋mol/L BrdU进行标记,采用空白BrdU作为对照组,分别培养24、48、72 h及96 h后,台盼蓝排斥实验检测细胞活力;MTT法检测细胞增殖能力;AnnexinV-FITC检测细胞存活率及凋亡率,免疫组化法检测各组标记率。结果：台盼蓝排斥实验检测细胞活力都在96%以上,实验组与对照组比较均无统计学意义（不同浓度组间比较P=0.89,各时间点比较P=0.61,时间与不同浓度的交互作用P=0.89）。MTT结果显示BrdU对细胞增殖无抑制（P ＞0.05）。不同浓度标记组间细胞增殖率及凋亡率的差异（增殖率F=12.02,P＜0.001,凋亡率F=6.14,P=0.009）。结论：BrdU标记hUC-MSCs是安全可靠的,BrdU标记hUC-MSCs的最佳剂量和时间为20 ?滋mol/L、72 h,适于hUC-MSCs在临床前实验研究的体内示踪。     

心脉隆注射液对新生SD大鼠海马神经干细胞增殖分化的影响

目的初步探讨心脉隆注射液对新生SD大鼠海马神经干细胞增殖分化作用的影响。方法分离新生SD大鼠海马组织,采用无血清及单克隆培养方式获得大量神经干细胞,将不同浓度心脉隆注射液加入第3代神经干细胞单细胞悬液中有血清贴壁培养并分实验组和对照组,应用免疫荧光及细胞化学染色检测Nestin、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)、微管相关蛋白2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,计算MAP-2阳性细胞百分率。四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法观察心脉隆注射液对神经干细胞增殖能力的影响。结果海马NSCs在分化后,各心脉隆注射液干预组MAP-2阳性细胞比例均较空白对照组增高(P<0.05),MTT结果显示培养5 d后各药物组NSCs增殖能力均较对照组增强(P<0.05)。结论心脉隆注射液具有促进神经干细胞增殖并向神经元方向分化的作用。     

低氧去血清培养条件下半乳糖凝集素-1对大鼠星形胶质细胞增殖和细胞周期的影响

目的：研究低氧去血清培养条件下半乳糖凝集素-1（Gal-1）对星形胶质细胞增殖和细胞周期的影响。方法：低氧去血清条件下体外培养大鼠星形胶质细胞,分别用高（10mg/L）、中（1mg/L）、低（0.1mg/L）剂量Gal-1干预。采用BrdU掺入法检测星形胶质细胞增殖,流式细胞术检测星形胶质细胞的细胞周期变化。结果：干预1d后,Gal-1高、中、低剂量组BrdU阳性细胞率均低于无干预对照组（P〈0.05）;干预3d后,Gal-1高剂量组BrdU阳性细胞率仍低于无干预对照组（P〈0.05）,中、低剂量组BrdU阳性细胞率与对照组比较,差异无统计学意义（P〈0.05）。干预1d后,Gal-1高、中剂量组星形胶质细胞S期细胞比例降低,G0/G1细胞比例增高（P〈0.05）。结论：Gal-1抑制星形胶质细胞的增殖和细胞周期进程,可能参与抑制脑缺血后的胶质疤痕形成。     

体外培养大鼠皮层神经元和星形胶质细胞氧糖剥夺后DDR1的表达情况

目的:探讨DDR1蛋白在氧糖剥夺后的神经元细胞及星形胶质细胞中的表达情况,推测可能机制。方法:采用SD孕鼠的胚鼠皮层培养神经元,采用新生SD大鼠皮层培养星形胶质细胞。建立氧糖剥夺(OGD)损伤模型并随机分为神经元正常对照组、神经元OGD组、星形胶质细胞正常对照组和星形胶质细胞OGD组。噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞活性;免疫荧光染色及Western blot方法检测各组DDR1的表达情况。结果:与正常对照组相比,OGD组细胞形态发生明显改变,MTT法测得细胞活性值降低;与神经元正常对照组相比,神经元OGD组的DDR1蛋白表达水平增加(P<0.05);与星形胶质细胞正常对照组相比,星形胶质细胞OGD组的DDR1蛋白表达水平无明显增加(P>0.05)。结论:OGD处理可诱导DDR1蛋白在大鼠皮层神经元中的表达,提示DDR1蛋白可能参与OGD后细胞凋亡等病理生理过程。     

大鼠诱导性多能干细胞向神经前体细胞诱导分化研究

目的探讨大鼠来源的诱导性多能干细胞(iPS细胞)向神经前体细胞(NPC)定向诱导分化的方法。方法在大鼠iPS细胞培养到悬浮类胚体阶段加入维甲酸(RA)诱导分化,对分化获得的细胞,分别通过免疫荧光染色和实时定量PCR方法检测NPC标志物、用BrdU免疫荧光染色检测其增殖能力、并通过大鼠视网膜下腔移植对其存活、整合情况及分化能力进行检测。结果经诱导分化获得的细胞能够在贴壁培养条件下形成Rosette结构、表达NPC标志物并且绝大多数呈BrdU阳性,移植到大鼠视网膜下腔后能分化为神经元和胶质细胞。结论大鼠iPS细胞能够通过悬浮EB加RA诱导的方法分化为NPC,有可能作为细胞移植治疗视网膜退行性疾病的供体细胞。     

癫痫大鼠海马区增殖的内源性神经前体细胞演变过程的研究

目的 追踪观察匹罗卡品诱导癫痫模型大鼠海马区增殖的内源性神经前体细胞的分化及演变过程，从而探讨痫性发作对增殖的内源性神经前体细胞的影响。方法 氯化锂和匹罗卡品联合诱导大鼠癫痫模型，正常对照组注射生理盐水，干预后14d腹腔注射5-溴脱氧尿苷嘧啶（BrdU）标记海马DG区增殖的内源性神经前体细胞；用免疫组化方法分别观察标记后5、14、28d海马DG区BrdU／神经元核性蛋白（NeuN）、BrdU／胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达；TUNEL标记方法观察BrdU／TUNEL的表达。结果 与正常对照组相比，癫痫模型组大鼠海马区出现的BrdU阳性细胞明显增多，增殖的细胞大多数分化为神经元（约70％），只有少数分化为星形胶质细胞。随标记时间延长，存活的增殖细胞逐渐减少，部分BrdU阳性细胞表现为TUNEL阳性。结论 癫痫发生后出现了神经前体细胞的增殖，增殖的细胞大多数分化为神经元。但只有少部分细胞存活下来参与海马结构的重组。     

Biological properties of neural progenitor cells isolated from the hippocampus of adult cynomolgus monkeys

Background The existence of neurogenesis in the hippocampus of adult nonhuman primates has been confirmed in recent years, however, the biological properties of adult neural stem cells or neural progenitor cells （NPCs） from this region remain to be extensively explored. The present work was to investigate on the expansion of NSCs/NPCs from the hippocampus of adult cynomolgus monkeys and the examination of their characteristics in vitro. Methods NPCs isolated from the hippocampus of adult cynomolgus monkeys were expanded in vitro in serum-free media containing growth factors, and were then allowed to differentiate by removing mitotic factors. The expansion capacity of NPCs and their differentiation potential were assayed by immunohistochemical and immunocytochemical analysis. Results During primary culture, NPCs underwent cell division, proliferation and aggregation to form neurospheres that were growing in suspension. Without mitotic stimulation, most neurospheres adhered to the culture dish and started to differentiate. Eventually, nearly 12% of the differentiated cells expressed neuron specific marker-β Ⅲ-tubulin （Tuj1） and 84% expressed astrocyte specific marker-fibrillary acidic protein （GFAP）. In addition, the expression of a neural stem cell marker, nestin, was found both in NPCs and in the subgranular zone of adult monkey hippocampus, where NPCs were originally derived. Conclusions NPCs from the hippocampus of adult cynomolgus monkeys can be expanded to some extent in vitro and are capable of differentiating into neurons and astrocytes. Further experiments to promote the in vitro proliferation capacity of NPCs will be required before adult NPCs can be used as a useful cell model for studying adult neurogenesis and cell replacement therapy using adult stem cells.     

Effects of electroacupuncture on the pain threshold and the NMDA R1 mRNA in DRG on neuropathic pain rats

To observe the effect of multiple electroacupuncture (EA) on the pain threshold and theregulation of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor in dorsal root ganglia (DRG) of neuropathicpain rats. Rats were prepared with a unilateral chronic constriction injury (CCI) to the sciatic nerve.EA was done in acupoints "Huan Tiao" and "Yang Ling Quan" for 30 min every day and the thermalthresholds were detected after EA at 3, 5, 7, 10, 14 days after operation. On day 14 after nerve in-jury, the in situ hybridization method was used to investigate the change of NMDA R1 mRNA inL4—L5 DRG. The thermal threshold reduced significantly from day 3 after operation in CCI rats.After multiple EA treatment, the ipsilateral thermal hyperalgesia relieved gradually and the thermalthreshold had no difference with control side after day 5(P>0. 05). From Day 7 after operation, thethermal threshold at each time point were significantly different compared with CCI group respective-ly(P>0.05). Moreover the EA had accumulative effect.     

川芎嗪对大鼠脑缺血再灌注损伤脑室下区细胞增殖的影响

目的:观察川芎嗪(ligustrazine)对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤侧脑室室下区(subventricular zone,SVZ)细胞增殖的影响.方法:将雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为正常组、假手术组、川芎嗪治疗组和对照组.采用线栓法制作局灶性脑缺血再灌注模型,5-溴脱氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine,BrdU)标记增殖细胞并用免疫组织化学方法检测BrdU阳性细胞并对SVZ区BrdU阳性细胞计数.采用Western blot检测神经元型一氧化氮合酶(neuro nitric oxide synthase,nNOS)的表达,并测定吸光度值.结果:正常组、假手术组SVZ有少量BrdU阳性细胞,川芎嗪治疗组、对照组SVZ区BrdU阳性细胞再灌注后1 d开始出现,逐渐增加,7 d达到峰值,持续至14 d,在21 d时下降.川芎嗪治疗1 d和3 d组BrdU阳性细胞明显多于对照组(P＜0.01).在缺血对侧SVZ也有细胞增殖,川芎嗪治疗组、对照组在各时间点的变化与缺血侧相似.川芎嗪治疗1 d,3 d组nNOS表达量明显低于对照组(P＜0.05),川芎嗪治疗7 d组与3 d组相比nNOS表达量增加,但与缺血对照组相比无统计学差异.结论:川芎嗪促进局灶性脑缺血再灌注损伤后SVZ区的细胞增殖,其机制可能与nNOS的表达下降有关.     

Bax参与KATP通道对神经元损伤的保护作用

目的 探讨ATP敏感性钾通道(KATP)介导对缺氧海马神经元损伤保护作用的分子机制.方法 原代培养7d后,对神经元进行缺氧(5% CO2和95% N2),同时分别给予神经元KATP通道的阻断剂甲糖宁(100 μmol/L)KATP通道的激动剂二氮嗪(100 μmol/L),MTT法检测细胞活性,RT-PCR检测Bax的mRNA表达水平.结果 单纯缺氧组,缺氧 二氮嗪组和缺氧 甲糖宁组的细胞存活率分别是(75.7±2.8)%(萨7)、(55.7 2.5)%(n=6)和(81.1±2.4)%(n=6),各加药组与单纯缺氧组比较有显著性差异(P＜0.01).缺氧 二氮嗪组中Bax的mRNA表达水平与单纯缺氧组相比明显下降(n=5)(P＜0.01),在缺氧 甲糖宁组中Bax的mRNA表达水平相对于单纯缺氧组高表达(n=5)(P＜0.05);而在常氧时各用药组中细胞存活率以及Bax的mRNA表达水平与对照组相比都均无显著性差异.结论 Bax参与KATP通道对神经元损伤的保护作用.     

电针穴位刺激对致痫大鼠海马齿状回神经发生及行为学变化影响的实验研究

目的:观察电针刺激百会穴对锂-匹罗卡品诱导致痫大鼠海马齿状回神经发生及行为的影响,为进一步揭示穴位刺激治疗癫痫的机制提供基本的实验依据.方法:选用锂-匹罗卡品诱导致痫成年大鼠模型,采用BrdU标记分裂细胞及免疫组织化学方法比较致痫后7,14,42 d时电针刺激穴位干预致痫组大鼠与相应对照组大鼠之间海马齿状回神经前体细胞的增殖速度,并同时观察动物行为学改变.结果:电针穴位刺激后,明显促进了大鼠致痫后7 d,14 d时齿状回的神经发生水平,BrdU免疫阳性细胞数目较相应对照组明显增加(P<0.01),而致痫后第42日时两组大鼠齿状回BrdU免疫阳性细胞数目无显著性差异(P＞0.05).同时,电针穴位刺激干预组大鼠(存活42 d大鼠)平均每周SRSs次数明显少于电针刺激对照组和无刺激对照组大鼠.结论:电针刺激百会穴可促进癫痫后海马齿状回神经发生水平的改变,即电针刺激百会穴在一定的程度上参与了癫痫后海马的神经可塑性变化.     

SOX2对牙髓干细胞神经分化的促进作用及其意义

目的：探讨转录因子SOX2对牙髓干细胞（DPSCs）神经分化的影响,为研究DPSCs神经分化的机制提供依据。方法：从人源第三磨牙牙髓中分离DPSCs（DPSCs组）,通过逆转录病毒感染方法构建过表达SOX2的DPSCs（DPSCs-SOX2组）,以空白载体感染的DPSCs作为对照组（DPSCs-vector组）,采用神经分化培养基诱导各组DPSCs分化为神经前体细胞（NPCs）。采用CCK-8法分析各组NPCs的增殖指数（PI）;采用qPCR和流式细胞术检测各组NPCs中Nestin和Pax6基因的表达水平;采用免疫荧光和流式细胞术分析各组NPCs在神经元分化方面的能力和分化后β3-Tubulin的表达效率。结果：通过神经分化培养基的定向诱导,正常DPSCs、DPSCs-vector和DPSCs-SOX2均可通过分化形成NPCs,但DPSCs-SOX2组NPCs的PI和NPCs中Nestin和Pax6表达水平明显高于DPSCs组和DPSCs-vector组（P<0.05）;DPSCs-SOX2组NPCs在神经元分化方面也具有一定的优势,分化后细胞的β3-Tubulin表达效率明显高于其他2组（P<0.05）。结论：SOX2对DPSCs的神经分化具有一定的促进作用。