致肾盂肾炎大肠杆菌P菌毛粘附素基因的型别鉴定

目的 从基因水平鉴定致肾盂肾炎大肠杆菌P菌毛粘附素的类型。方法 根据P菌毛I型（PapGJ96)、Ⅱ型（PapGIA2)和Ⅲ型（PrsGJ96)粘附素的基因序列，选择非同源区设计合成三对引物。以全菌DNA样品为模板，应用普通PCR和复合PCR技术获得三型papG的扩增。结果 UPEC J96分别产生461bp和258bp的DNA片段；UPEC132和UPEC136均产生190bp的DNA片段。无P菌毛对照株为阴性扩增。复合PCR结果与普通PCR完全一致。PapG132扩增产物的序列分析表明其与PapGIA2之间具有97．9％的同源性，但存在4处点突变。结论 UPEC132株P菌毛粘附素为Ⅱ型PapG，但与国外同型PapG比较，存在基因变异。复合PCR技术用于papG基因分型具有很高的敏感性和特异性。     

尿路致病性大肠杆菌溶血素A基因的克隆和序列分析

目的构建尿路致病性大肠杆菌（Uropathogenic Escherichia coli,UPEC）溶血素A（hemolysin A,HLYA）hlya基因重组质粒。方法根据已知GenBank中的hlya基因序列,设计合成一对引物,用PCR方法从尿路致病性大肠杆菌溶血素A基因组DNA中扩增编码hlya的基因片段,克隆至pUC18质粒,转化大肠杆菌DH5aЭ感受态细胞,经酶切及PCR鉴定,而后进行测序。结果hlya基因体外扩增产物大小约744bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,测序结果与己知序列基本吻合。结论在国内首次克隆了尿路致病性大肠杆菌hlya基因,为研究hlya的功能和探讨hlya作为特异性诊断靶抗原的研究奠定了基础。     

致肾盂肾炎大肠埃希菌黏附素表达载体构建及表达产物抗原性检测

目的 构建致肾盂肾炎大肠埃希菌(UPEC)P菌毛黏附素PapG重组融合蛋白表达载体．检测该重组蛋白的免疫原性。方法 设计并合成一对P菌毛PapG黏附素结构基因的PCR扩增引物；筛选、鉴定重组质粒。以IPTG诱导PapG与GST重组融合蛋白表达．表达产物经亲和层析纯化后用Western blot分析。结果 成功地构建papG结构基因重组表达载体．所表达的重组蛋白相对分子质量约63kD．可为UPECP菌毛多克隆抗体所识别。结论 所获得的PapG-GST重组融合蛋白纯化产物保持了天然抗原性．可用于疫苗研制及其他免疫学研究。     

hHGF-αcDNA的克隆及表达载体的构建

目的定点突变法扩增制备完整hHGF-α cDNA,克隆并构建其原核表达载体。方法与结果以含有人HGF cDNA全序列的质粒pRC/CMV-hHGF为模板,设计合成一对特异引物进行聚合酶链反应(PCR),扩增hHGF-α cDNA基因,琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示扩增得到了1.34 kb长的目的基因产物。将扩增产物以限制性内切酶Xho Ⅰ酶将其切为386 bp、954;bp两个片段,分别以EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ、Xho Ⅰ/BamH Ⅰ与pBSKS载体连接重组,对目的基因分段克隆后进行序列测定,结果表明除通过定点突变引入的起始密码ATG、终止密码子TAA、TGA及EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ识别位点外,扩增得到的PCR产物序列与Nakamura等报道的HGF cDNA中不包括前体序列的α链部分完全相同。将以EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ、Xho Ⅰ/BamH Ⅰ从pBSKS-HGF-α 386、pBSKS-HGF-α 954中切出的386 bp、954 bp两个片段以EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ与pBV220连接构建重组表达质粒pBV220-HGF-α,限制性内切酶图谱分析显示HGF-α cDNA插入到载体pBV220的EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ位点,插入方向正确。温度诱导表达,SDS-PAGE显示一分子量与单体hHGF-α链吻合的蛋白带,证明表达质粒构建成功。结论设计制备了hHGF-α链cDNA,克隆建立了hHGF-α链原核表达质粒。     

尿路致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fim H基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建以尿路致病性大肠杆菌临床分离株Ⅰ型菌毛编码基因fimH 为目的基因的真核表达载体pcDNA3.0-fimH.方法 提取尿路致病性大肠杆菌临床株基因组DNA,PCR扩增fimH基因片段,然后克隆至TA载体,通过PCR 、酶切及测序鉴定后,将fimH基因片段用限制性内切酶切下克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-fimH重组质粒.通过PCR 、酶切对重组质粒pcDNA3.0-fimH进行鉴定.结果 PCR 法克隆出全长为903 bp 的fimH基因并构建了pcDNA3.0-fimH重组质粒.结论 本研究成功构建尿路致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimH基因真核表达质粒pcDNA3.0-fimH,为尿路致病性大肠杆菌基因疫苗的研制奠定了基础.     

hGF—α cDNA的克隆及表达载体的构建

目的 定点突变法扩增制备完整hHGF-α cDNA,克隆并构建其原核表达载体。方法与结果 以含有人HGF cDNA全序列的质粒pRC/CMV-hHGF为模板,设计合成一对特异引物进行聚合酶链反应（PCR）,扩增hHGF- α cDNA基因,琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示扩增到了1．34kb长的目的基因产物。将扩增产物以限制性内切酶Xho Ⅰ酶将其切为386bp,954bp两个片段,分别为EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ／Xho Ⅰ,Xho Ⅰ/BamH ⅠⅠ与pBSKS载体连接重组,对目的基因克隆后进行序列测定,结果表明除通过定点突变引入的起始密码ATG、终止密码子TAA、TGA及EcoR Ⅰ、ⅠBamH Ⅰ识别位点外,扩增得到的PCR产物序列与Nakamura等报道的HGF cDNA中不包括前体序列的α链部分完全相同。将以EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ、XhoⅠ／BamH Ⅰ从pBSKS-HGF-α386,pBSKS-HGF-α954中切出的386bp,954bp两个片段以EcoR Ⅰ／BamHⅠ与pBV220连接构建重组表达质粒pBV220-HGF-α,限制性内切酶图谱分析显示HGF－αcDNA插入到载体pBV220r EcoR Ⅰ/BamⅠ位点,插入方向正确。温度诱导表达,SDS－PAGE显示一分子量与单体hGF-α链吻合的蛋白带,证明表达质粒构建成功。结论 设计制备了hGF-α链cDNA,克隆建立了hGF-α链原核表达质粒。     

LMP-3功能区真核表达质粒的构建

目的:构建LMP-3功能区真核表达重组质粒.方法:设计合成LMP-3活性区引物,应用PCR方法,扩增其基因片段,亚克隆至真核表达质粒pEGFP-N1,最终构建重组表达质粒pEGFP-N1-LMP-3,同时进行酶切鉴定和测序.结果:PCR扩增LMP-3基因序列正确,构建的重组表达质粒pEGFP-N1-LMP-3经EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切及测序鉴定正确.结论:成功获得真核表达重组质粒pEGFP-N1-LMP-3,为进一步研究其成骨功能奠定基础.     

西尼罗Ⅰ型病毒亚克隆的构建及其鉴定

目的 构建西尼罗病毒基因组的cDNA亚克隆,为西尼罗病毒全长cDNA克隆的研发和应用打下基础.方法 根据基因组中限制性酶切位点的分布设计4对引物,QIAamp RNA抽提试剂盒提取西尼罗病毒培养细胞BHK-21的总RNA,长片段RT-PCR技术扩增目的 基因片段.将目的 基因片段与pMD18-T载体进行连接,转化入感受态细胞E.coli DH5α,进行蓝白斑筛选后得到阳性克隆,将重组质粒进行PCR和测序鉴定.结果 获得的目的 基因片段经PCR和测序结果表明西尼罗病毒功能基因正确地克隆进入载体.结论 成功获得西尼罗Ⅰ型病毒功能基因的cDNA亚克隆,可应用于西尼罗病毒全长cDNA克隆的制备.     

日本血吸虫卵壳蛋白编码基因的扩增和克隆

目的　克隆日本血吸虫卵壳蛋白基因 ,以研究其在诊断和作为候选疫苗分子的作用。方法　设计合成引物 ,以日本血吸虫雌性成虫cDNA第一链为模板 ,用PCR法扩增日本血吸虫卵壳蛋白 (SchistosomajaponicumeggshellproteinSjEP)基因编码序列 ,并克隆入pGEM T质粒载体。结果　PCR法扩增出大小为 62 4bp的单一条带 ,将其克隆入载体获重组质粒 pGEM T SjEP ,经双酶切和以质粒为模板进行PCR扩增 ,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段。结论　日本血吸虫卵壳蛋白的编码基因重组质粒的成功构建 ,为进一步研究提供了条件。     

阴道毛滴虫黏附蛋白33基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定阴道毛滴虫黏附蛋白33基因(adhesionprotein33gene,ap33gene)真核表达载体。方法提取阴道毛滴虫分离株基因组DNA,PCR扩增黏附蛋白33基因,克隆入pMD-18T线性质粒,重组子经双酶切、PCR鉴定及测序分析。鉴定出的重组质粒pMD-18T-ap33和pcDNA3.1( )空质粒经BamHⅠ和XbaⅠ限制性内切酶双酶切,凝胶电泳后回收ap33目的基因和pcDNA3.1( )空质粒酶切片段,将ap33基因亚克隆入pcDNA3.1( )载体并进行筛选和鉴定。结果PCR扩增出阴道毛滴虫黏附蛋白33基因,重组质粒pMD-18T-ap33经双酶切,PCR及序列分析,ap33基因的长度为930bp,与GenBank上公布的ap33基因序列同源性达99%。经凝胶电泳、PCR鉴定和限制性酶切鉴定,构建出pcDNA3.1( )-ap33重组质粒。结论成功构建了阴道毛滴虫pMD-18T-ap33克隆质粒及pcDNA3.1( )-ap33重组质粒。     

金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的克隆和序列测定

根据已公布的金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的序列，设计并合成一对特异性的引物。以鼠金黄色葡萄球菌临床分离株SA.m0109的基因组DNA为模板，利用PCR技术对其耐热核酸酶nuc基因片段进行扩增，获得了预计大小的片段。将这一片段克隆到质粒载体pGEM-T中，对重组质粒pGEM-NUC进行限制内切酶分析，PCR鉴定和克隆片段的序列测定。证实了克隆片段的可靠性。     

创伤后增生性疤痕中α1(Ⅰ)及(Ⅲ)型前胶原基因片段的克隆及鉴定

【目的】胶原蛋白是构成细胞外基质的主要组分之一 ,它的过量沉积是创伤后增殖性瘢痕形成的原因之一 ,本实验的目的就是要克隆出疤痕中α 1(Ⅰ )型及 (Ⅲ )型前胶原基因片段并进行鉴定。【方法】本研究根据α 1(Ⅰ )型及 (Ⅲ )型前胶原基因的核苷酸序列分别设计 3条引物 ,从瘢痕组织中经RT PCR分别扩增Ⅰ及Ⅲ型前胶原基因的第 2外显子 (Exon 2 )区域的基因片段 (ⅠF2 ,ⅢF2 ) ,克隆到T载体 (pGEM Tvector)。得到阳性重组质粒后经限制性内切酶酶切 ,PCR及测序加以证实。【结果】分别获得长度约为 12 9bp的DNA片段 (简称为ⅠF2 ) ,与长度约为 189bp的DNA片段 (简称为ⅢF2 ) ,与预期片段大小一致。得到重组质粒 pT Ⅰ及 pT Ⅲ ,并得到证实。【结论】获得的α1(Ⅰ )型及 (Ⅲ )型前胶原基因片段是预期所要得到的正确片段。     

大肠杆菌asd基因PCR引物设计及其长模板PCR扩增

目的 获得大肠杆菌全长ａｓｄ基因，方法 采用计算机引物设计软件，长模板ＰＣＲ扩增法及限制性内切酶切分析。结果 设计一对Ｅ．ｃｏｌｉａｓｄ基因ＰＣＲ引物，经长模板ＰＣＲ扩增获得１５１０ｂｐＰＣＲ扩增片段，经限制性内切酶酶切分析，证明该片段与电脑查询的Ｅ．ｃｏｌｉａｓｄ基因酶切谱相同。结论 本文设计的引物用长模板ＰＣＲ扩增法得到的片段初步确认为Ｅ．ｃｏｌｉａｓｄ基因。     

PCR靶向克隆法构建携带人类神经生长因子β基因的含有EGFP的重组腺病毒穿梭质粒

目的:在靶向克隆酶的作用下,利用PCR靶向克隆构建携带人神经生长因子的重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-hNGFβ-EGFP。方法:按PCR引物设计原则设计两条引物,分别在上下游引物的5′端加上12个碱基与线性化载体切口两端同源载体序列,引物合成后PCR反应扩增目的基因hNGF-β,提纯后与EcoRⅤ酶切的穿梭质粒pShuttle-IRES-hrEGFP在靶向克隆酶(LPReccoenzyme)的作用下37℃孵育15min,转化感受态大肠杆菌,碱裂解法制备及纯化质粒DNA。结果:EcoRⅤ酶切鉴定证实pShuttle-hNGFβ-EGFP构建成功。结论:在不需要限制性内切酶的情况下用靶向克隆酶连接可快速、准确得到穿梭质粒pShuttle-hNGFβ-EGFP。     

酵母质粒PCR扩增及酶切在酵母双杂交中的运用

目的:减少对初步筛选获得的阳性克隆进一步鉴定的工作量,防止阳性克隆的丢失.方法:提取酵母双杂交筛选cDNA表达文库获得的阳性克隆酵母细胞质粒,以文库载体插入片段两端特异序列为引物,PCR扩增插入片段,限制性核酸内切酶酶切扩增产物,琼脂糖凝胶电泳,根据带型对阳性克隆进行分类.结果:将初步获得的107株阳性克隆,分为24类,在PCR扩增过程中发现个别克隆含有两种以上的文库质粒.结论:酵母质粒PCR扩增,酶切分类的方法,不仅可以大大减轻阳性克隆进一步鉴定的工作量,避免不必要的浪费,而且还可以避免阳性克隆的丢失.     

一种有效的体外连接法构建heNOS重组腺病毒

目的：探讨一种新的有效的体外连接方法构建重组腺病毒转移载体。方法：将目的基因heNOS(人内皮型一氧化合酶)亚克隆到穿梭质粒pShuttle启动子CMV的下游，再通过Ⅰ-CeuⅠ和PI—Sce Ⅰ两个稀有酶切位点，将目的基因heNOS与腺病毒质粒DNA(pAdeno—X)进行体外连接，获得含目的基因heNOS重组腺病毒质粒DNA，后经限制性内切酶PacⅠ切割后，两端露出反向末端重复序列(ITR)，利用脂质体转染293细胞．获得含目的基因重组腺病毒上清。PCR双引物检测含有目的基因heNOS片段。结果：PCR双引物检测含有目的基因heNOS片段，表明利用体外连接法成功构建了含目的基因heNOS重组腺病毒转移载体。结论：体外连接法是一种有效的复制缺陷型重组腺病毒构建方法。     

霍乱弧菌毒力表达调控基因toxR的PCR扩增及克隆

为了构建霍乱弧菌和杜氏利什曼原虫双价口服活疫苗候选株,作者采用PCR对霍乱弧菌毒力表达调控基因toxR进行扩增及克隆,并对霍乱弧菌toxR基因进行限制性酶切分析.结果显示:7株霍乱弧菌均扩增出1.3kb的toxR基因片段,toxR基因中部含有EcoRⅠ酶切位点,再将toxR基因克隆在质粒pAT153上,对所获的重组质粒ptR4进行限制性酶切分析,证实质粒ptR4插入的1.3kb的DNA片段为toxR基因片段.     

hTERT基因片段真核表达质粒载体的构建

目的 构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的基因表达载体,为人们建立永生化的细胞系提供材料,为临床细胞移植的实验研究和疾病治疗奠定实验基础.方法 根据hTERT全长cDNA序列设计引物进行PCR扩增,扩增用的模板是人胎脑cDNA文库,PCR扩增产物与pGEM-T载体连接后进行测序鉴定.结果 PCR扩增及限制性酶切法证实重组真核表达质粒的构建成功.产物测序表明,hTERT基因片段与GenBank公布的相应基因同源性比较,核苷酸序列的同源性为98.87%,氨基酸序列的同源性为99.67%.结论 成功构建了hTERT真核表达质粒.     

重叠PCR克隆Exendin-4的基因及序列分析

目的克隆Exendin-4 39肽氨基酸序列基因编码区cDNA。方法根据Exendin-4氨基酸序列编码cDNA,设计正、负向引物/模板链,利用重叠延伸PCR法扩增出Exendin-4编码区基因DNA片段;将获得的基因片段插入pGEM-T-Easy质粒中;转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆,利用限制性内切酶及核苷酸序列分析技术鉴定重组质粒。结果经质粒DNA酶切分析及序列测定,获得了Exendin-4 DNA片段序列。结论本研究成功克隆了Exendin-4 cDNA,为下一步构建Exendin-4真核表达载体打下基础,也为Exendin-4基因治疗糖尿病提供了前提条件。