人巨细胞病毒p52蛋白基因的克隆及表达

制备人巨细胞病毒Ｐ５２蛋白特异性抗原。方法用ＰＣＲ技术扩增ＨＣＭＶＰ５２蛋白ＩｇＭ抗原决定簇编码区ＤＮＡ片段，克隆表达载体ＰＢＶ２２０中，转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ株，用氨苄青霉素抗性和质粒酶切图谱分析法筛选阳性克隆，经温控诱导基表达。     

重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因的克隆与表达

重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因的克隆与表达颜真，韩苇，李芳梅，赵宁，张英起（生物技术中心）关键词粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；基因克隆；基因表达中图法分类号　Ｒ３３４粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）是一功能很强的造血生长因子，人ＧＭ－Ｃ...     

纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用ＰＣＲ方法以分泌纳豆激酶的纳豆杆菌染色体ＤＮＡ为模板扩增纳豆激酶基因,将该基因克隆到质粒载体ＰＵＣ１９上,筛选重组子,通过限制性内切酶和ＰＣＲ技术分析初步确定该重组子所携外源基因为纳豆激酶基因。利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的表达载体,并在大肠杆菌中进行了表达,凝块溶解时间法（ＣＬＴ）测出表达产物具有溶解血栓性。在确定了最佳培养时间与诱导时间后,ＳＤＳＰＡＧＥ分析结果表明基因表达产物为分泌     

人血管内皮生长因子基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的：克隆人血管内皮生长因子基因VEGF165片段。构建pcDNA3／VEGF165真核表达质粒。方法：采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从人肝癌细胞株SMMC-7721中扩增出血管内皮生长因子VEGF165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA3真核表达载体上,构建成pcDNA3／VEGF165重组质粒,分别用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定。结果：经PCR扩增、酶切电泳分析和DNA测序证实,本实验构建的重组质粒目的基因片段为人VEGF165cDNA。结论：本实验成功地克隆了VEGF165基因并构建了其真核表达质粒。为进一步研究用VEGF基因转染的方法来恢复或增强放疗后组织的血管生成能力奠定了基础。     

人热休克蛋白72基因的克隆、原核表达与纯化

目的：克隆人热休克蛋白72（HSP72）基因，原核表达并纯化蛋白产物，以探讨其生物学功能。方法：从热休克的人肝癌细胞株SMMC－7721中，用RT－PCR方法扩增得到HSP72基因并克隆到原核表达载体pQE-30中，在大肠杆菌JM109中用IPTG诱导下表达的蛋白经FPLC梯度洗脱和SephacrylS200凝胶过滤纯化，经SDS－PAGE电泳后转印到NC膜上，用anti-HSP72单抗作探针，进行Western blot鉴定。结果：克隆的基因序列分析结果与有关报道一致，所构建的pQTE-30HSP72载体 大肠杆菌中表达出与预大小相符的Mr为72000的蛋白，经鉴定确系HSP72蛋白。结论：克隆了人HSP72基因，并对该基因进行了原核表达与纯化，为进一步研究其生物学功能奠定了良好基础。     

人ApoC-Ⅰ基因的克隆、原核表达与纯化

【目的】进行含信号肽ApoC-Ⅰ(signal-ApoC-Ⅰ)和ApoC-Ⅰ成熟肽(mature-ApoC-Ⅰ)的基因克隆、原核表达和纯化。【方法】取肝癌切除手术患者的癌旁组织,提取总RNA后,逆转录成c DNA,并设计带酶切位点的特异引物分别扩增出signal-Apo C-Ⅰ、mature-Apo C-Ⅰ基因;将扩增出的基因通过T克隆入PMDTM19-T载体;T克隆经测序验证后,双酶切出目的基因,连入同样双酶切后的PET28a载体,构建原核表达质粒;再次测序验证后,将质粒转入BL21Star(DE3)中,表达条件优化后进行融合表达;将表达后产物用Ni-NTA树脂亲和层析进行重组蛋白纯化;纯化产物采用Western blot进行验证。【结果】构建了PET28a-signal-ApoC-Ⅰ、PET28a-mature-Apo C-Ⅰ表达质粒,重组质粒都经过测序鉴定正确;PET28a-signalApoC-Ⅰ诱导表达后能抑制宿主菌生长,但经过条件优化2个表达质粒都在BL21Star(DE3)菌中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导大量表达和纯化,Western blot证实了表达的结果。【结论】含信号肽ApoC-Ⅰ、ApoC-Ⅰ成熟肽的基因克隆、原核表达和纯化成功,为进一步研究重组人Apo C-Ⅰ的作用奠定了基础。     

重组人呷α8干扰素在大肠杆菌中的克隆与高表达

利用基因重组技术构建了人干扰素α８高表达菌株Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１－ｂＬＵＥ／ｐＢｍ，经酶切鉴定、ＤＮＡ测序、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ及生物活性测定等分析，表明能特异性地表达具有生物活性的ＩＦＮ－α８，表达量达到总菌体蛋白的２３％，经复性后活为４．８×１０＾７ＩＵ／ｍｇ，具有良好的应用前景。     

乙型肝炎病毒PreS基因的克隆表达及亲和层析纯化

目的：获取乙型肝炎病毒前S区基因（HBVpreS),序列测定正确后进行融合表达,为今后研究其机制及应用创造条件。方法：利用乙型肝炎病毒基因组为模板体外扩增HBVPreS基因后进行基因克隆,目的基因经测序正确后克隆入融合表达载体pRSET-C中,转化大肠杆菌JM109（）DE3）。目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的HBV－PreS蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行纯化。结果：成功地扩增到preS区全长基因,得到融合6个His的HBV－PreS蛋白纯度大于90％,结论：构建了乙型肝炎病毒前S区基因的重组表达载体,获得了稳定表达的工程菌,为以后的深入研究奠定了基础。     

重组人α8干扰素在大肠杆菌中的克隆与高表达

利用基因重组技术构建了人干扰素α８（ＩＦＮ－α８）高表达菌株Ｅ．ｃｏｌｉＸＬｌ－Ｂｌｕｅ／ｐＢｍ，经酶切鉴定、ＤＮＡ测序、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ及生物活性测定等分析，表明能特异性地表达具有生物活性的ＩＦＮ－α８，表达量达到总菌体蛋白的２３％，经复性后比活为４．８×１０７ＩＵ／ｍｇ，具有良好的应用前景。     

胃癌相关基因GCRG213的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：利用硫氧还蛋白融合表达系统表达胃癌相关基因GCRG213。方法：采用PCR技术从pGEM-T质粒上扩增出含完整ORF的GCRG213 cDNA序列，将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pET102／D-TOPO中，转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达重组融合蛋白，SDS-PAGE分析表达产物。结果：高效表达出相对分子量约29.4ku的重组融合蛋白。薄层凝胶扫描显示，其表达量占菌体总蛋白质的28.7％。结论：在大肠杆菌中成功表达了Thioredoxin-GCRG213融合蛋白，为后续功能研究、蛋白制备及其抗体研制奠定了基础。     

人PCK1基因克隆及其表达载体的构建

目的构建人PCK1基因的真核表达载体。方法以人内脏脂肪细胞cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增PCK1基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1( )中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为1 972 bp,以此构建的pGEM-T-PCK1克隆载体,经限制性内切酶酶切证实载体中带有PCK1基因的目的片段,与GenBank中的人PCK1基因cDNA序列一致。重组质粒pcDNA3.1-PCK1经KpnⅠ/XbaⅠ双酶切后显示5.1 kb和2 000 bp左右的2个条带,证明PCK1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1( )中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-PCK1重组真核表达载体。     

霍乱毒素B亚单位基因的克隆和表达

用DNA重组技术构建CT-B表达性质粒pXB1及进一步修饰的pXB2,使CT-B基因在大肠杆菌中得到较高水平的表达(280～350ng/ml),且有71.5％分泌率。表达动力学研究阐明,克隆子培养24h产物收率较高。一定浓度的Mg~(2+)、L-组氨酸和天冬酰胺能刺激CT-B的表达。GM1-ELISA、CHO细胞测毒结合间接免疫荧光检测和家兔肠段结扎试验证实,表达的CT-B能与游离的或活细胞膜上的GM1受体结合,但无细胞和肠段毒性。这种细胞测毒结合免疫荧光序贯试验,为客观证实CT-B的生物学活性开拓了新途径。     

耐热植酸酶基因phyA的克隆及新型表达载体的构建

目的 克隆烟曲霉耐热植酸酶基因，构建分泌性的真核表达质粒，以获取耐热的基因工程植酸酶。方法 提取烟曲霉菌的基因组，以此为模板PCR扩增成熟肽编码序列，双酶切后与包含黑曲霉葡萄糖淀粉酶启动子和基因片断的真核表达栽体pYG1．2相连接，转化入大肠杆菌DH5a，从转化菌株中提取质粒进行序列测定和分析。结果 PCR扩增出1326bp的植酸酶编码序列，插入pYG1．2质粒中，构建了重组质粒，重复实验结果表明，该植酸酶基因序列与已报道的烟曲霉植酸酶序列有2个碱基的差异，编码的蛋白质序列有99．8％的同源性。结论 成功构建了用于黑曲霉菌真核表达耐热植酸酶的重组质粒。     

人苯丙氨酸羟化酶基因克隆及其原核表达质粒的构建

 [目的]克隆健康人苯丙氨酸羟化酶基因全长cDNA序列,构建并鉴定其原核表达质粒pTrcHisB/PAH。[方法]采用RT-PCR方法从人肝组织中扩增PAH基因全长cDNA,T/A克隆到pMD18-T载体中,双酶切后将cDA亚克隆入pTrcHisB载体,构建pTrcHisB/PAH质粒,经限制性内切酶鉴定并测序。[结果]人PAH基因cDNA正确克隆入pTrcHisB表达载体,与Genebank中PAH基因序列一致。[结论]成功构建pTrcHisB/PAH表达质粒,为进一步进行研究PAH蛋白表达和重组蛋白活性鉴定奠定基础。     

人苯丙氨酸羟化酶基因克隆及其原核表达质粒的构建

[目的]克隆健康人苯丙氨酸羟化酶基因全长cDNA序列,构建并鉴定其原核表达质粒pTrcHisB/PAH。[方法]采用RT-PCR方法从人肝组织中扩增PAH基因全长cDNA,T/A克隆到pMD18-T载体中,双酶切后将cDA亚克隆入pTrcHisB载体,构建pTrcHisB/PAH质粒,经限制性内切酶鉴定并测序。[结果]人PAH基因cDNA正确克隆入pTrcHisB表达载体,与Genebank中PAH基因序列一致。[结论]成功构建pTrcHisB/PAH表达质粒,为进一步进行研究PAH蛋白表达和重组蛋白活性鉴定奠定基础。     

人CD80基因的cDNA克隆及其在肿瘤细胞中的表达

采用巢式PCR(nested PCR)的方法从Raji细胞中扩增出人CD80 cDNA,并将这一cDNA克隆入载体pUC19中。经PCR扩增和限制性酶切分析,进行初步鉴定后,再将人CD80 cDNA克隆到pcD-NA表达载体上,构建成为pCD-CD80重组质粒。应用脂质体介导的基因转移技术将这一表达载体导入小鼠黑色素瘤B16细胞后,用SABC法进行瞬时表达的检测。结果表明,转染后48h就具有明显人CD80基因的表达产物。     

嗜肺军团菌ip基因的克隆及其原核表达

目的克隆嗜肺军团菌主要免疫原蛋白ip基因,构建重组质粒pET-ip,并在原核系统中表达。方法采用聚合酶链反应(PCR),从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增军团菌主要免疫原蛋白ip基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a( ),构建原核表达重组质粒pET-ip,经限制性内切酶鉴定、PCR及测序分析后,转化宿主菌大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果扩增出了792 bp完整的ip基因,构建的原核表达重组质粒pET-ip表达出49 kDa Trx-IP的融合蛋白质,Western-blot证实获得蛋白为所需要的目的蛋白。结论成功构建了军团菌ip基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中得到了高效表达。     

Arthrobacter globiformis酯酶基因的克隆、表达和酶活性测定

采用聚合酶链反应(PCR)的方法扩增了A rthrobacter g lobiform is中酯酶编码基因,与载体质粒连接后在大肠杆菌BL 21(DE 3)中进行表达。以包涵体形式表达的蛋白在8 m o l/L尿素作用下溶解,经过透析复性后获得了具有活性的粗蛋白。产物活性实验表明,酯酶表现出较高的催化活性,为菊酯作为杀虫剂的应用奠定了基础。     

大鼠β神经生长因子前体基因的克隆及其真核表达载体pEGFP-NGF的构建

目的克隆大鼠脑组织中神经生长因子(NGF)β亚基前体的全长序列,构建其真核表达载体pEGFP-NGF。方法采用RT-PCR方法扩增NGFβ亚基前体的全长序列,克隆入载体pMD18-T,转化大肠杆菌JM109,挑选白色菌落行酶切鉴定、PCR鉴定及序列分析;利用高保真Taq酶自重组质粒pMD 18-T／NGF中扩增目的基因NGF,将目的基因与真核表达载体pEGFP-N1行双酶切,T4连接酶连接,转化大肠杆菌DH-5α,挑选白色菌落行酶切鉴定。结果pMD 18-T／NGF测序结果与GenBank的序列完全一致,pEGFP-NGF、行限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ酶切,可见酶切片断与插入基因长度相符。结论成功从大鼠脑组织中克隆神经生长因子(NGF)β亚基前体的全长序列,并构建其真核表达载体pEGFP-NGF,为从分子水平开展NGF转基因相关研究奠定了基础。     

人神经营养因子-3基因在大肠杆菌中的克隆和表达

目的 :获得人神经营养因子 - 3 (hNT - 3 )在大肠杆菌中的克隆并表达。方法 :采用PCR方法从 2 0周人胎脑cDNA文库中扩增hNT - 3基因 ,通过双酶切法在M 13mp18载体上克隆获得全长基因 ,将正确全长基因插入PBV2 2 0载体 ,通过选择合适宿主菌获得hNT - 3的高效表达。结果 :获得全长基因完全正确的hNT - 3基因 ,获得占细菌总蛋白 3 0 %的hNT - 3表达菌株。结论 :本研究获得了序列正确的hNT - 3基因克隆 ,并实现了在大肠杆菌中的高效表达。