肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞迁移的影响

目的研究肝细胞生长因子（HGF）对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）迁移的影响。方法采用Percoll密度梯度离心法分离BMSCs,进行表面抗原表达及分化鉴定。使用Dunn chamber装置研究BMSCs的定向迁移。并且研究PI3K抑制剂LY294002对HGF诱导BMSCs迁移的影响。结果分离培养的BMSCs呈CD29、CD90、CD106阳性表达,CD34、CD45阴性表达,BMSCs可诱导分化为成骨细胞及脂肪细胞。Dunn chamber迁移实验显示,外槽加入不同浓度的HGF,BMSCs迁移速率没有变化,迁移效率随着HGF浓度的增加而增加,50ng/ml与100ng/mlHGF均显著提高了细胞迁移效率;内外槽同时加入50ng/mlHGF,迁移速率与迁移效率均没有变化;经30μmol/LLY294002预处理1h后,HGF诱导的BMSCs的定向迁移受到抑制。结论 HGF能够趋化BMSCs的定向迁移,PI3K信号通路参与介导这一过程。     

肝细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞

目的人骨髓间充质干细胞（hMSC）经过腺病毒介导转染肝细胞生长因子（Ad-HGF）后进行鉴定。方法密度梯度离心法分离培养原代hMSC,取第三代hMSC转染Ad-HGF。比较转染前后的细胞形态变化,流式细胞仪鉴定hMSC/Ad-HGF的表面标志物,ELISA测定培养液上清的HGF浓度。结果 HGF基因修饰前后,均为成纤维样细胞形态;流式测定hMSC/Ad-HGF与hMSC细胞表型一致;ELISA测得hMSC/Ad-HGF的培养液上清HGF浓度显著高于hMSC（P〈0.001）。结论经HGF基因修饰的hMSC,维持了原有的细胞形态及特异性细胞表型,且高表达HGF。     

人肝细胞生长因子基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的:构建人肝细胞生长因子(HGF)基因慢病毒载体pNL-HGF-增强绿色荧光蛋白(EGFP)并转染骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测HGF基因在BMSCs中的表达.方法:采用基因重组技术,利用限制性内切酶酶切获取HGF基因序列并克隆到慢病毒载体pNL-EGFP上,构建重组慢病毒质粒pNL-HGF-EGFP;将慢病毒...     

Notch-1蛋白在诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化中的表达

目的探讨肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）、成纤维生长因子-4（fibroblastg rowth factor-4,FGF-4）和间接共培养条件下诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞定向分化可行性及Notch信号系统在此分化过程中作用。方法分别采用含有HGF、FGF-4条件诱导液单独培养骨髓间充质干细胞（bone mesenchymM stem cell,BMSC）以及Transwell培养板联合培养MSC和肝细胞,同时加入Notch-1蛋白抑制剂DAPT,通过免疫细胞化学检测白蛋白和Notch-1蛋白表达,RT．PCR检测Notch-1mRNA表达。结果条件诱导液培养第9天免疫细胞化学染色出现白蛋白表达,Notch-1蛋白及Notch-1mRNA表达降低;联合培养组第3天免疫细胞化学染色出现白蛋白表达,Notch-1蛋白及Notch．1mRNA表达降低。加入DAPT抑制Notch信号系统,提高诱导分化率。结论在一定诱导因素作用下,骨髓间充质干细胞可以向肝细胞转化,而且转化的肝细胞具有合成白蛋白功能。在此转化过程中Notch信号系统起到关键作用。     

肝细胞生长因子在心血管领域的研究概况

肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）是由间质细胞分泌的一种多功能细胞因子，具有促进细胞生长、抗凋亡、抗组织纤维化等作用，其作用机制受到了广大研究者的关注。业已从骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞及心肌干细胞中检测到肝细胞生长因子及其受体的表达，它与干细胞的分化、迁移、增殖等均有着密切的关系，在干细胞治疗心血管疾病的应用中起着重要的作用，成为人们近年来研究的热点之一。本文主要阐述了肝细胞生长因子对干细胞生物学功能的影响，及近年来关于肝细胞生长因子在心血管疾病中的研究进展。     

骨髓间充质干细胞向肝细胞分化过程中肝细胞相关转录因子的表达

目的 观察体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化过程中肝细胞相关转录因子的表达和分布.方法 从大鼠骨髓中分离间充质干细胞,体外诱导分化为肝细胞.采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法 比较肝细胞分化过程中转录因子肝细胞核因子4α(HNF4α)、CCAAT增强子结合蛋白α和β(C/EBPα和C/EBPβ)在诱导分化组和对照组中的表达水平;免疫荧光染色方法 检测HNF4α在细胞中的表达定位.结果 在肝细胞分化成熟过程中,转录因子HNF4α和C/EBPα的mRNA表达水平在诱导分化早期的细胞中显著高于对照组细胞,而C/EBPβ mRNA表达水平在分化成熟的细胞中显著高于对照组细胞(P<0.05).免疫荧光染色结果 显示,HNF4α定位于分化细胞核内.结论 在肝细胞分化过程中,转录因子HNF4α、C/EBPα和C/EBPβ呈特征性时序表达,表明骨髓间充质干细胞在向肝细胞分化时,肝细胞相关转录因子的表达与细胞分化的启动和维持密切相关.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞（mMSCs）在体外定向诱导分化为肝细胞及其方法。方法：采用梯度离心法分离纯化雄性SD大鼠的mMSCs。A组原代培养；B组原代培养分别加刺激因子50ng／ml肝细胞生长因子（HGF）和50ng／ml成纤维细胞生长因子4（FGF-4），倒置显微镜连续观察细胞分化过程的形态学变化。于培养的7、14、21、28d，细胞免疫荧光法检测各组细胞甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）、细胞角蛋白18（CK-18）、细胞角蛋白19（CK-19）的表达。采用过碘酸希夫（PAS）染色法检测各组细胞糖原染色情况。结果：分离纯化B组大鼠的mMSCs，应用HGF和FGF-4诱导10d后变为肝细胞样圆形。细胞免疫荧光测定B组显示，培养第7dAFP即出现阳性，第21d表达明显减弱；第7dCK-19染色阳性，以后增强；第14d白蛋白与CK-18染色开始阳性，以后表达逐渐加强。A组在培养过程中不表达AFP、ALB、CK-18和CK-19。糖原染色显示，B组第14d开始阳性，-直持续到第28d；A组未见阳性染色。结论：大鼠mMSCs在较高浓度的HGF及FGF-4诱导下可分化为肝细胞。     

肝细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞的研究进展

<正>肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)最初发现于肝组织中,是一种多功能细胞生长因子,拥有促血管生成、促细胞分裂等作用。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs)具有多向分化潜能。有研究[1]表明,更多还原     

人肝细胞生长因子基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的: 构建含人肝细胞生长因子(hHGF)基因的骨髓间充质干细胞(MSCs),获得高表达hHGF的MSCs.方法: 构建含hHGF基因的腺病毒表达载体pDC316-HGF-IRES-EGFP.同源重组法获得含hHGF的重组腺病毒Ad-HGF.以仅表达GFP基因的重组腺病毒Ad-GFP为对照,体外分别以Ad-GFP, Ad-HGF感染MSCs.荧光激活细胞分选术检测受染细胞的基因表达效率.酶联免疫吸附测定法检测转导细胞培养上清中hHGF表达的浓度和持续时间.结果: 腺病毒表达载体经限制性内切酶切后有2.2 kb的hHGF目的基因片段和5.2 kb的线性化载体片段;目的片段测序结果与基因库中hHGF cDNA序列一致.病毒液Ad-HGF纯化后滴度可以达到8.02×1010 pfu/ml.FACS检测HGF/MSCs的GFP阳性率达95.19%.HGF/MSCs细胞培养上清中hHGF能持续表达至少14 d;最高浓度达到99 ng/ml.结论: 本实验中腺病毒表达载体构建正确;重组腺病毒液Ad-HGF滴度高;转导后在MSCs中获得高效、稳定和持续表达的hHGF.该载体达到实验设计要求,为进一步的体内外研究提供了实验依据.     

体外诱导人骨髓间充质干细胞定向肝细胞分化

目的:研究人骨髓间充质干细胞向肝细胞的诱导分化,为肝组织工程提供理想的细胞来源。方法:以肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4对种植于基底膜基质中的人骨髓间充质干细胞进行三维立体诱导培养,在培养后不同时间,分别进行形态观察、AFP、Alb的免疫组化荧光染色及靛青绿的摄取与排泌试验。结果:该条件下诱导后的人骨髓间充质干细胞生成肝细胞样细胞,阳性表达肝细胞特有表面标志AFP、Alb,并具备肝细胞特有的摄取与排泌靛青绿的活性功能。结论:肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4及基底膜基质可能在体外人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的过程中提供适宜的微环境并起重要作用,这为间充质干细胞在肝组织工程中的应用提供了理论与技术上的支持。     

人肝细胞生长因子在CHO细胞中的表达

以ｐＲＣ／ＣＭＶ作为真核细胞表达性载体，用限制性内切酶ＢａｍＨＩ／ＸｂａⅠ将ＨＧＦｃＤＮＡ全序列定向重组到ｐＲＣ／ＣＭＶ的多克隆位点上。筛选得到的重组质粒以磷酸钙ＤＮＡ共沉淀的方法转染ＣＨＯ细胞，经８００ｍｇ／Ｌ的Ｇ４１８筛选，获得阳性细胞克隆。用ＨＣＣ－７９０２细胞及原代培养的成年大鼠肝细胞对转染阳性细胞培养基收集上清进行活性测定。３Ｈ－ＴｄＲ掺入等分析证明，它能有效地抑制体外培养的人肝癌细胞的生长，并可明显刺激鼠肝细胞ＤＮＡ的合成。结果表明，重组人ＨＧＦ基因在ＣＨＯ细胞中成功地获得表达，为基因工程大量制备和纯化ＨＧＦ奠定了基础     

Construction of hepatocyte growth factor gene recombinant adenovirus vector and its expression in rat bone marrow mesenchymal stem cells

ObjectiveTo construct the adenoviral expression vector system containing human hepatocyte growth factor (hHGF) cDNA, and to further study the transduction efficiency and the expression of HGF in mesenchymal stem cells (MSCs). MethodsThe HGF cDNA was amplificated from the expression plasmid pCMV-HGF, and was subcloned into the adenovirus shuttle plasmid pDC316-IRES-EGFP vector containing a green fluorescence protein (GFP) reporter gene. Virus Ad-HGF was produced by homologous recombination in HEK293 package cells. Bone marrow derived MSCs were harvested and cultured, and then were transduced with Ad-HGF. The efficiency of Ad-HGF transduction was assessed by FACS analysis using GFP gene expression. And HGF/MSCs were generated. The HGF concentrations in supernatants of HGF/MSCs were determined by ELISA using anti-human HGF monoclonal antibody. Results The recombinant, named pDC316-HGF-IRES-eGFP, was digested with restriction enzyme, and the DNA sequencing of HGF was identical to the report in Genebank and did not reveal any mutation. GFP expression could be observed on the second day after packing of the linearized pAd-HGF in HEK293 cells and 7.15×1010pfu/ml titer of Ad-HGF was obtained. Forty-eight hours after transduction, 96.89% of HGF/MSCs were GFP positive. Peak concentration levels of hHGF(103ng/mL) in the cultured supernatants were detected on day 2 post-transduction, and the adenovirus-mediated expression of HGF by MSCs was maintained for at least 2 weeks in vivo. ConclusionOur data demonstrated that the adenovirus expression'vector system pDC316-HGF-IRES-EGFP has been constructed successfully, and their effective expressions also have been obtained in MSCs. This will provide material basis for the next study on liver regeneration after small-for-size liver transplantation.     

HGF在增生性玻璃体视网膜病变增生膜中的表达

目的观察肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）在实验性增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy,PVR）增生膜中的表达。方法采用玻璃体腔内注入体外培养兔视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞法建立PVR动物模型,免疫组织化学法检测PVR增生膜中HGF的表达。结果 HGF在造模后7天已经有高表达,30天后达到高峰,60天时较30天表达略下降。结论 HGF在实验性PVR动物模型中高表达,提示HGF参与了PVR增生膜的形成。     

肝细胞生长因子及其受体在胃癌组织中的表达

目的 探讨肝细胞生长因子(HGF)及其受体(c-Met)在胃癌组织中表达的意义.方法 采用即用型免疫组化染色法检测44例胃癌、20例慢性浅表性胃炎、10例慢性萎缩性胃炎和16例胃溃疡组织中HGF/c-Met的表达.结果 慢性浅表性胃炎组织细胞内均无HGF/c-Met表达,HGF在胃癌、慢性萎缩性胃炎和胃溃疡组织中表达阳性率分别为72.7%(32/44)、20%(2/10)和37.5%(6/16),胃癌HGF阳性率显著高于慢性萎缩性胃炎组(P＜0.005)及胃溃疡组(P＜0.025);c-Met在胃癌、慢性萎缩性胃炎和胃溃疡组织中表达阳性率分别为77.3%(34/44)、40%(4/10)和37.5%(6/16),胃癌c-Met阳性率也显著高于慢性萎缩性胃炎组(P＜0.05)及胃溃疡组(P＜0.025).结论 胃癌组织中存在HGF和c-Met的共同表达,可能是促进肿瘤恶性演变的生物学行为,也为胃癌的治疗提供一条新的有效途径.     

重组腺病毒Ad-HGF转染骨髓基质干细胞及其表达的实验研究

目的 构建人肝细胞生长因子(HGF)重组腺病毒表达载体,体外转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),检测HGF基因表达,探讨转HGF基因的BMSCs治疗股骨头缺血性坏死(ANFH)的可行性.方法 利用RT-PCR方法,从共表达人HGF-Met的NIH3T3-H0细胞株中扩增人HGF cDNA,插入腺病毒穿梭质粒pDC316,与辅助质粒共转染HEK293细胞,重组产生重组腺病毒Ad-HGF,PCR鉴定毒种正确后,在293细胞中扩增、纯化,TCID50法测定感染性滴度,然后感染BMSCs,RT-PCR、原位杂交、免疫组化检测转染后细胞中HGF的转录和表达.结果 成功制备了Ad-HGF,感染性滴度为2.6×1010TCID50/ml,转染后的BMSCs在mRNA和蛋白水平均有HGF表达.结论 获得高表达人HGF基因的BMSCs,为其用于早期ANFH的治疗奠定了基础.     

肝细胞生长因子（HGF）在胎儿各脏器的分布

本实验应用免疫组织化学法，研究人肝细胞生长因子在６－７个月胎儿各脏器的分布情况，结果显示了ＨＧＦ大量分布于胎儿的肝脏，其中以较小的、核深染的肝细胞为主。在肾脏，ＨＧＦ呈中等量分布。在胃、十十指肠、胰腺、肾上腺等ＨＧＦ只有少量的分布。     

肝细胞生长因子在急性肾功能衰竭患者血清中的表达

目的：探讨急性肾功能衰竭（ARF）患者血清中肝细胞生长因子（HGF）的表达及其临床意义。方法：用ELIAS方法测定31例急性肾衰竭患者不同时期和28例健康人血清HGF水平。结果：ARF患者少尿期、多尿期血清中的HGF水平均明显高于健康人（Ｐ<0.001）,以少尿期上升最明显,随后呈下降趋势,至恢复期接近健康人水平（P>0.05）。急性肾功能衰竭患者各时期血清中的HGF水平与血肌酐（SCr）和尿素氮（BUN）呈正相关（ｒ=0.741,Ｐ<0.001;ｒ=0.763,Ｐ<0.001）。结论：ARF患者血清HGF水平显著上升,与肾功能受损的程度呈正相关。血清HGF的变化可帮助了解肾损害严重程度,间接判断肾小管的再生修复能力。     

近交系五指山小型猪骨髓间充质干细胞体外分泌 肝细胞生长因子延缓慢性肾脏病纤维化进展

目的：分离培养近交系五指山小型猪骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs), 并建立其慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)模型,体外研究同物种BM-MSCs对CKD肾纤维化的修复作用及其 可能机制。方法：采用密度梯度法分离培养BM-MSCs,并从细胞形态、表面抗原、分化能力等方面鉴定;采用左侧 输尿管部分梗阻(left partial ureteral obstruction,LPUUO)方法制作CKD模型,并通过B超、单光子发射计算机断层成像 术(single-photon emission computed tomography,SPECT)、病理染色等评估;体外实验分为肾组织与BM-MSCs共培养、 肾组织单独培养、BM-MSCs单独培养3组,体外培养7 d,每天收集3组上清液,酶联免疫吸附法测定肝细胞生长因子 (hepatocyte growth factor,HGF)累积分泌量。肾组织行HE染色,Masson染色。结果：分离培养的BM-MSCs表达抗原 CD29,CD90而不表达CD45,成骨诱导茜素红染色阳性,成软骨诱导阿利新蓝染色阳性。LPUUO术后12周,B超示 左肾皮质变薄、肾盂积液;SPECT示左肾充盈延迟、梗阻性肾功能受损。上清液HGF累积含量示BM-MSCs+CKD肾组 织共同培养组第1,5,6,7天HGF累积分泌量明显高于CKD肾组织单独培养组(P<0.05)。HE染色显示BM-MSCs+CKD 肾组织共同培养组和CKD肾组织单独培养组中肾均出现不同程度的病变,并随时间延长加重,但CKD肾组织单独培 养组病变更严重;Masson染色显示BM-MSCs+CKD肾组织共同培养组术后第5,6,7天肾组织被染成蓝色的胶原纤维 的累计光密度值明显低于CKD肾组织单独培养组(P<0.05)。结论：近交系五指山小型猪BM-MSCs体外分泌HGF,抑制 或延缓CKD纤维化进展。