应用蛋白质组学分析结直肠癌促泌素和糖调节蛋白78蛋白变化及其意义

目的分析结直肠癌、配对正常黏膜组织差异表达蛋白质,寻找与结直肠癌发生、发展相关的分子标记物。方法固相pH梯度双向凝胶电泳分离结直肠癌患者配对癌及正常黏膜组织的总蛋白,液相色谱串联质谱鉴定差异表达蛋白质点。半定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、Western blot及免疫组织化学（EnVision法）方法检测促泌素（SCGN）及糖调节蛋白78（GRP78）两个差异表达蛋白质及组织定位,并检测54例神经内分泌肿瘤SCGN的表达。结果比较结直肠癌、配对正常黏膜组织蛋白质表达图谱,共获得5倍以上差异蛋白质点35个,癌组织中表达上调15个、下调20个。质谱分析鉴定14个蛋白质。RT-PCR及Western blot证实结直肠癌组织SCGN低表达,免疫组织化学染色发现正常结直肠黏膜神经内分泌细胞及98％（53／54）的神经内分泌肿瘤SCGN阳性。GRP78蛋白在结直肠癌组织中的表达明显高于正常黏膜组织,但在mRNA水平上癌组织和正常组织之间差异无统计学意义。结论双向凝胶电泳结合质谱分析是筛选肿瘤异常表达蛋白质的有效手段,所获得的35个差异表达候选蛋白质可能与结直肠癌的发生、发展有关。SCGN是一个候选神经内分泌标记物,GRP78蛋白表达增高可能涉及翻译后修饰。     

结直肠癌转移动物模型血清中几种蛋白变化的观察

目的建立可视化结直肠癌转移模型,并应用血清蛋白质组学技术分析可视化结直肠癌转移模型血清蛋白质的变化。方法用pEGFP—N1绿色荧光蛋白基因转染具有转移能力的SW480细胞株,在裸鼠皮下接种成瘤后,再原位接种于裸鼠右半结肠,利用整体荧光成像系统观察结直肠癌原位成瘤及发生转移的情况。同时采集裸鼠原位成瘤后不同转移阶段的血清,进行双向电泳联合时间飞行质谱分析差异蛋白质,观察结直肠癌转移模型裸鼠癌转移前后血清蛋白的变化。结果获得稳定表达绿色荧光蛋白的SW480-EGFP细胞株,裸鼠皮下接种成瘤率为100％,原位种植成瘤率为10／10,区域淋巴结转移为10／10,肝转移率为4／10,肺转移率为3／10。通过血清蛋白质组学技术成功鉴定了5个在癌转移发生后血清内显著升高的血清蛋白：结合珠蛋白α链,载脂蛋白A4,载脂蛋白E,免疫球蛋白κ型V区L链和转铁蛋白。结论成功建立结直肠癌可视化转移模型,利用不同转移阶段鼠血清进行双向电泳图谱差异分析筛选出5个在癌转移发生后血清中显著升高的蛋白可能是与结直肠癌转移相关的蛋白。     

基于质谱技术对结直肠腺癌组织表达蛋白质的分析

目的 分析结直肠腺癌蛋白质组学图谱,评价蛋白质分子作为潜在结直肠腺癌的肿瘤标志物的诊断价值。方法 本研究纳入26例结直肠腺癌患者,分别采集患者的结直肠腺癌组织和其癌旁正常组织,我们使用非标定量法(label free)对26个结直肠腺癌组织和26个匹配的正常组织进行了大规模的蛋白质组学检测,分析结直肠腺癌蛋白质组学图谱。用ROC曲线对候选肿瘤标志物进行诊断效能分析。结果 主成分分析(PCA)结果表明,肿瘤组织和正常组织的蛋白质组之间有明显的区别。我们共鉴定了3 674个蛋白,具有统计学意义的差异蛋白419个,其中包括226个上调蛋白和193个下调蛋白;筛选出2个具有诊断价值的结直肠腺癌候选标志物,RNA结合基序蛋白3(RBM3)的曲线下面积为0.793,灵敏度为80.0%,特异性为71.4%;中性粒细胞胞质因子1(NCF1)的ROC曲线下面积为0.802,灵敏度为85.7%,特异性为72.7%。结论 结直肠腺癌发生时,机体发生明显的蛋白质分子水平的变化,NCF1和RBM3可作为辅助诊断的潜在肿瘤标志物。     

磷酸化MEK2 (Thr394)在结直肠癌中的表达及其临床意义

 目的：探讨MAPK信号转导途径中MEK2蛋白第394号位点苏氨酸残基(Thr394)磷酸化在结直肠癌发病机制中的作用及临床意义。方法：采用组织芯片和免疫组织化学方法检测96例结直肠癌组织、24例结直肠腺瘤组织和24例癌旁正常组织的p-MEK2（Thr394）蛋白表达并比较其表达差异;此外,对前面的96例以及另外的337例临床病例参数和预后资料完善的结直肠癌患者,采用组织芯片-免疫组织化学方法检测p-MEK2（Thr394）的表达,并分析其与结直肠癌的预后及临床病例参数的相关性。结果：p-MEK2（Thr394）在癌旁正常组织、结直肠腺瘤和结直肠癌组织中表达呈递减趋势,其高表达率分别为100%、66.7%、19.8%,差异有统计学意义（P<0.01）。 p-MEK2（Thr394）蛋白的表达与性别、年龄、体重指数、分化程度、T分期、N分期、TNM分期、肝转移及K-ras基因突变情况等临床病理参数间均无显著相关性（P>0.05）。Kaplan-Meier 分析显示,p-MEK2 (Thr394) 表达与结直肠癌患者预后无显著相关性。结论：MEK2蛋白第394号位点上的苏氨酸残基磷酸化在癌旁正常组织和结直肠腺瘤、结直肠癌组织中的表达呈下降趋势,提示其可能与结直肠癌的发生及发展相关。     

癌胚抗原阴性的结、直肠癌检测和结直肠癌预后相关生物标记

目的探讨结直肠癌的发生、发展过程中患者血清质谱多肽蛋白图谱的变化,筛选与结直肠癌预后及癌胚抗原(CEA)阴性检测相关的肿瘤标记分子。方法用蛋白指纹图谱技术检测结直肠癌,结直肠管状腺瘤患者和健康者血清质谱多肽蛋白图谱。结果初步筛选出对结直肠癌有代表性的7个差异蛋白;2个与其淋巴结转移相关的差异蛋白;4个与其远处转移相关的差异蛋白;3个在其根治性切除后表达下降的差异蛋白;而由3398·3u、5477·1u和8453·9u组成的诊断模型对CEA阴性表达结直肠癌的阳性检测率为100%。结论蛋白指纹图谱技术可筛选出有意义的生物标记差异蛋白,这对结直肠癌预后判断、CEA阴性的结直肠癌检测和改变结直肠癌的进程具有重要意义。     

利用SELDI-TOF质谱技术分析大肠癌患者血清蛋白质谱的变化

目的：研究大肠癌血清蛋白质谱的变化，从而筛选特异性蛋白标志物。 方法： 利用IMAC3蛋白质芯片和SELDI-TOF质谱技术，对64例大肠癌病人和40名正常人的血清蛋白质谱进行分析。获得的蛋白质谱采用Ciphergen公司的Biomarker Wizard和Biomarker Pattern软件分析。 结果： 通过对大肠癌术前血清与正常人血清蛋白质谱分析发现共有19个蛋白质表达量有明显差异。并获得分子量为5 972.67 D、5 927.21 D、6 113.48 D、5 908.55 D和4 292.51 D这5个蛋白质组成的模板，可将大肠癌与正常人正确分组，其正确分组率分别为97.5％（56/64）和80％（32/40）。术后血清蛋白质谱中，原高表达的蛋白质明显下调。 结论： 结果表明通过大肠癌手术前后及正常对照血清中蛋白质谱的比较，筛选得到用以诊断大肠癌的特异性蛋白标志物并用以预后的判断。SELDI-TOF蛋白质芯片技术为建立蛋白质模板从而早期诊断大肠癌提供了可靠的技术平台。     

结直肠腺瘤及腺癌组织中FOXO1表达及其临床意义

目的检测结直肠腺瘤及腺癌组织中转录因子FOXO1的表达,在组织学水平上初步探讨FOXO1在结直肠腺瘤癌变过程中的作用及其与临床病理特征的关系。方法采用Western blot法免疫组化SP两步法检测146例结直肠腺瘤、48例结直肠腺癌及48例癌旁组织中FOXO1蛋白的表达水平。结果 FOXO1在结直肠腺瘤及腺癌组织中的表达明显低于正常组织,组间比较差异有统计学意义(P0.01)。结直肠腺瘤组织中FOXO1表达与肿物大小相关,腺癌组织中FOXO1表达与肿瘤分化程度相关。结论 FOXO1在人类肠道癌前病变(腺瘤)及腺癌组织细胞核表达减少和缺失,可能是导致结肠腺癌发病的机制之一,其在结直肠癌的发生、发展过程中起抑癌基因的作用,有望成为下一个潜在的临床治疗靶点。     

结直肠腺瘤和结直肠癌患者外周血Tc17和 Treg 细胞的变化

目的检测结直肠腺瘤和结直肠癌患者外周血中Tc17与Treg细胞比例的变化，并分析二者相关性。方法流式细胞术检测30例结直肠腺瘤、33例结直肠腺癌患者和20例健康对照者外周血中Tc17和Treg细胞比例；ELISA检测其血清中IL-17A和IL-23水平。结果结直肠腺瘤和结直肠癌患者外周血中Tc17和Treg 细胞比例及细胞因子IL-17 A和IL-23水平均高于对照组（ P＜0．05）。结直肠癌组Tc17细胞比例及细胞因子IL-17A和IL-23水平均高于结直肠腺瘤组（P＜0．05），而Treg细胞比例在两组间并无统计学意义（ P＞0．05）。基于疾病进展，结直肠腺瘤Ⅰ级和早期结直肠癌组Tc17细胞比例及细胞因子IL-17A和IL-23水平分别高于相应的结直肠腺瘤Ⅱ级和晚期结直肠癌组（P＜0．05），Treg 细胞比例变化与 Tc17细胞变化相反，但二者无相关性（r ＝-0．227， P＝0．073）。结论结直肠腺瘤和结直肠癌患者外周血Tc17和Treg细胞比例随着疾病进展呈相反的变化趋势，但二者并不存在相关性。     

结直肠癌中NKD1和β-catenin的表达及意义

目的观察NKD1和β-连环素(β-catenin)在结直肠正常黏膜组织、结直肠腺瘤及结直肠癌中的表达,探讨两者在结直肠肿瘤发生、发展中的作用。方法应用免疫组化SP法检测NKD1和β-catenin在正常黏膜组织、结直肠腺瘤、结直肠癌组织中的表达。结果 NKD1在正常组织中的阳性率明显高于结直肠腺瘤、结直肠癌,其表达与肿瘤的分化程度、Dukes分期及淋巴结转移相关,差异有统计学意义(P<0.05)。β-catenin在癌组织中的表达异常率明显高于癌旁正常组织,其异位表达率与肿瘤的分化程度、Dukes分期、淋巴结转移有关,差异有统计学意义(P<0.05)。NKD1的表达和β-catenin异位表达呈负相关(rs=-0.691,P<0.01)。结论 NKD1的表达下调与β-catenin的异位表达,可能与结直肠肿瘤的发生、发展有关。     

慢性间歇性缺氧大鼠肾脏组织蛋白质组的变化

目的:比较慢性间歇性缺氧大鼠与正常大鼠肾脏组织蛋白质双向电泳图谱,寻找和鉴定慢性间歇性缺氧大鼠肾脏组织中的差异蛋白表达谱。方法:以固相pH梯度等电聚焦为第一向和垂直SDS-PAGE为第二向,分别对正常对照大鼠和慢性间歇性缺氧大鼠的肾脏组织蛋白质样品进行二维分离,2-DE图谱经ImageMaster 2D Platinum V5.0软件分析,选取4个差异蛋白点用基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行鉴定。结果:通过对2-DE图谱蛋白斑点的匹配及对比分析,与慢性间歇性缺氧相关的差异表达蛋白斑点为112个;经质谱鉴定的4个差异表达的蛋白斑点,慢性间歇性缺氧组量下调的差异点1个,即线粒体ATP合成酶δ亚基;上调的差异点3个,分别为己糖激酶、儿茶酚-O-甲基转移酶、脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1。结论:大鼠肾脏组织慢性间歇性缺氧损伤相关的差异蛋白表达变化可能通过多种途经影响肾脏功能。     

蛋白质组学检测β-原肌球蛋白在结肠癌组织中的表达

目的：通过比较结肠腺癌与正常结肠黏膜的蛋白质组表达差异,寻找与结肠腺癌发生相关的蛋白质,筛选结肠癌诊断的分子标志物。方法: 运用蛋白质组学技术,对8例结肠腺癌组织和8例正常结肠黏膜组织进行胶内差异双向电泳（2-D）,选择差异表达超过2倍的蛋白质进行MALDI-TOF/TOF质谱分析和生物信息学分析,并对结肠癌组织中表达下调的蛋白β-原肌球蛋白(TM β)进行Western blotting验证。结果: 成功建立结肠腺癌和正常结肠黏膜的双向凝胶电泳图谱,结肠腺癌和正常黏膜组织凝胶电泳图谱中平均蛋白质斑点数分别为3 289和3 066,其中表达差异超过2倍的斑点共有31个,质谱分析和数据库检索共鉴定出18种蛋白质,包括cytokeratin 8、cytokeratin 10、S100A6、TM β、protein disulfide isomerase 等。从功能分析,这些差异蛋白与癌细胞的发生、增殖、分化、转移等相关;TM β在结肠癌组织中的表达水平Western blotting结果与电泳结果一致。结论: 蛋白质组学能有效地分离和鉴定结肠腺癌组织与正常结肠组织间的差异表达蛋白质,结肠癌组织中表达下降的TMβ,可能成为结肠癌诊断的分子标记物。     

人膝骨关节炎血清生物学标志物的筛选

目的: 比较膝骨关节炎患者与正常人血清蛋白质组的差异,筛选其能用于骨关节炎诊断、治疗或发病机制研究的血清生物学标志物。方法: 利用双向荧光差异凝胶电泳技术比较膝骨关节炎患者血清(4例)与健康志愿者血清(4例)蛋白图谱的差异,使用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱及生物信息学相关技术对获得的差异蛋白进行鉴定和初步分析,并用Western blotting进一步验证所鉴定的蛋白。结果: 成功建立了骨关节炎血清差异蛋白质组学的研究方法;通过质谱分析初步鉴定出8个差异蛋白,其中5个蛋白在膝骨关节炎组表达上调,3个蛋白在膝骨关节炎组表达下调。Western blotting进一步验证得到α₂-巨球蛋白在膝骨关节炎组表达上调,与双向荧光胶内差异凝胶电泳技术联合质谱分析的结果一致。结论: 膝骨关节炎患者血清与正常人血清蛋白表达存在明显差异,其中α₂-巨球蛋白可作为骨关节炎潜在的疾病相关生物学标志物进一步研究,为骨关节炎的诊断、治疗和发病机制的研究提供新的线索和实验基础。     

结肠癌的蛋白质组学研究

目的： 通过比较结肠癌组织与正常结肠组织的蛋白质组表达差异，寻找结肠癌相关的蛋白质，选择敏感的分子标志物。方法： 运用蛋白质组学技术，对8例结肠癌患者的结肠癌组织和正常结肠组织进行胶内差异双向电泳（2-D），选择差异表达超过2倍的蛋白质进行MALDI-TOF质谱分析和生物学信息分析。结果： 成功建立结肠癌和正常结肠组织的双向凝胶电泳图谱，结肠癌组织和正常组织凝胶电泳图谱中平均蛋白质斑点数分别为3289和3066，其中表达差异超过2倍的斑点共有31个，质谱分析和数据库检索共鉴定出18种蛋白质，包括keratin 8、S100A6、protein disulfide isomerase等。从功能分析，这些差异蛋白质与癌细胞的发生、增殖、分化、转移等相关。结论： 蛋白质组学能很好地显示结肠癌组织与正常结肠组织间的蛋白质表达差异，本研究鉴定的18种差异蛋白质有可能为研究结肠癌的生物学行为提供新的分子标记物。     

克罗恩病患者与健康人血清蛋白质组学比较初步研究

目的：应用蛋白质组学方法在患者血清中寻找与克罗恩病相关的蛋白质。方法: 采取克罗恩病患者以及正常成人血清蛋白样本各4例，用不同的CyDye荧光染料标记后进行胶内差异双向凝胶电泳(2-D DIGE)，并对获得的图谱进行分析及对差异蛋白质进行基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS) 鉴定和生物学信息分析。结果: 通过2-D DIGE分析，发现了克罗恩病患者中存在29个表达异常蛋白质点，质谱分析和数据库检索共鉴定出22种蛋白质，包括SER/THR，CD45，APC等。结论: 蛋白质组学能很好显示克罗恩病患者与正常人血清蛋白质表达差异，本研究鉴定的蛋白质可能为研究克罗恩病的生物学行为提供新的分子标记物。     

Biomarkers of metastatic potential in cultured adenocarcinoma clones

Two-dimensional isoelectric focusing and gel electrophoresis followed by mass spectrometry were used to detect, measure, and identify changes in protein expression correlated with differences in the metastatic potential of cultured rat mammary adenocarcinoma cells. MTC is a non-metastatic cell clone derived from a primary tumor. MTLn2 and MTLn3 are low and high metastatic potential cell clones derived from lung metastases of the primary tumor. A total of 1,500 proteins was detected. The patterns of protein expression of MTLn2 and MTLn3 cells were similar. Only five spots had a threefold or greater statistically significant difference in staining intensity between MTLn2 and MTLn3 cells, whereas 70 spots differed between MTC and MTLn3 cells. Twenty spots were selected for further study, ten that had a positive correlation of staining intensity with metastatic potential and ten that had a negative (inverse) correlation. Of the 17 unique proteins that were identified, five have often been cited as tumor biomarkers. These included the positive biomarkers nucleophosmin (NPM) and 14-3-3 protein sigma and the negative biomarkers raf kinase inhibitor protein (RKIP), peroxiredoxin-2, and galectin-1. The only identified protein that was markedly higher in MTLn3 cells than in the less-metastatic MTLn2 cells was 14-3-3 protein sigma. The results indicate that increased metastatic potential is associated with positive and negative changes in expression of particular proteins. Proteins that are positively correlated with metastatic potential may prove more useful as clinical biomarkers, but those with negative correlations may still provide useful information about underlying mechanisms of metastatic spread.     

Alteration of the proteome profile of the pancreas in diabetic rats induced by streptozotocin

Type 1 diabetes mellitus (T1DM) is receiving increased attention. To obtain a better understanding of the mechanism underlying T1DM, we performed a proteomic study on a rat model induced by streptozotocin. Pancreatic proteins were separated by two-dimensional gel electrophoresis. Eighteen protein spots were differentially expressed (P<0.05) with 2-fold or more increased or decreased intensity in the diabetic rats as compared with controls, of which 11 protein spots were up-regulated and 7 protein spots were down-regulated. These protein spots were successfully identified by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. The 60 kDa heat shock protein, the carbonyl reductase 1 (Cbr1), the hydroxyacyl-CoA dehydrogenase, Δ(3,5),Δ(2,4)-dienoyl-CoA isomerase, the elongation factor 1-δ, the 26S protease regulatory subunit 7 and the transitional endoplasmic reticulum ATPase were up-regulated, while the 78 kDa glucose-regulated protein, peroxiredoxin 4 and plakoglobin were down-regulated. The expression change of Cbr1 which is closely related to diabetic complications was further validated by western blotting. Our results and those of the bioinformatics analysis suggest that oxidative stress, the Wnt pathway, fatty acid degradation and glucose transport may be closely related to T1DM.     

Comparative analysis of whole saliva proteomes for the screening of biomarkers for oral lichen planus

Objective To screen possible biomarkers in whole saliva from oral lichen planus (OLP) patients by proteomic techniques. Methods Two-dimensional electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry were applied to whole saliva of OLP patients and controls, and the differential protein components were analyzed with peptide mass fingerprinting and database searching. Results A total of 31 protein spots representing 14 proteins with at least two-fold difference in abundance between OLP and controls were identified. Among these, the expression of urinary prokallikrein was increased while short palate, lung and nasal epithelium carcinoma associated protein (PLUNC) was decreased in all samples of OLP. Conclusions Urinary prokallikrein and PLUNC may be the new biomarkers which play a role in inflammation and immune response of OLP. Received 22 September 2005; returned for revision 16 January 2006; accepted by A. Falus 19 April 2006     

系统性红斑狼疮患者血清蛋白质组学研究

目的 运用蛋白质组学的方法,分析正常人及SLE患者血清蛋白质的差异表达,寻找与SLE疾病发病机制相关的蛋白质.方法 分别收集健康人及SLE患者血清各9例,同组血清等量混合,用试剂盒除去血清中的白蛋白和免疫球蛋白,再经除盐浓缩后,将血清样品采用固相pH梯度（IPG）双向凝胶电泳（2-DE）分离正常人及SLE患者血清的总蛋白质.凝胶经考马斯亮蓝染色显色后,利用Analysis2d软件对获得的蛋白图谱进行分析,寻找差异表达的蛋白质,利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）进行鉴定,分析差异蛋白点.结果 对照组凝胶共检出蛋白点648个,患者组检出639个.对照组凝胶蛋白点匹配率84.5％,患者组凝胶蛋白点匹配率82.5％.通过比较分析,差异表达蛋白质点数为92个,有52个蛋白点在SLE患者组表达上调,40个表达下调,有14个点的表达水平在组间差异有统计学意义,质谱鉴定共鉴定5个蛋白质.通过文献研究显示,我们鉴定的部分蛋白在SLE的发病机制中起潜在的作用.结论 在SLE患者血清中存在着差异血清蛋白质,这些蛋白质可能是SLE发病的内在因素,并且在SLE的疾病发展过程中发挥重要作用,可能作为新的血清标志物和潜在的自身抗原.