蛋白激酶CK2α亚基cDNA的克隆与序列分析

目的构建人蛋白激酶CK2α重组质粒,研究CK2结构和功能.方法采用RT-PCR、定向克隆和DNA测序方法进行实验.结果通过BT-PCR从Hep-3B肝癌细胞中获得人蛋白激酶CK2α(Protein Kinase 2α)亚基编码区1136bp的cDNA片段,将扩增基因通过粘端连接克隆到pUCm-T载体中,用PCR和限制性内切酶分析鉴定,表明获得重组质粒pUCm-T-CK2α.通过对CK2α编码区cDNA序列测序证实其与GeneBank中登记号为NM-01895的序列一致.结论成功构建了重组质粒pUCm-T-CK2α,为利用CK2αcDNA作为探针进行深入研究奠定了基础.     

人bit1 cDNA基因的克隆、测序及表达

目的: 克隆并在大肠杆菌中表达人bit1 cDNA基因. 方法: 从新鲜的胎盘组织中提取总RNA,经反转录成单链cDNA, 以此为模板扩增出人bit1 cDNA基因,将该基因克隆入载体pUC19中,测序正确后亚克隆入表达载体pGEX-4T3中进行表达. 结果: 利用所设计的引物扩增出完整的人bit1 cDNA基因.以大肠杆菌为宿主在IPTG的诱导下获得表达,激光薄层扫描显示表达蛋白占总蛋白的40.6%. 结论: 获得了人bit1 cDNA基因及其原核表达产物,对研究人Bit1蛋白的功能具有重要的意义.     

人肌肉组织中GLUT4 cDNA的克隆及测序

目的：通过RT-PCR，以特异引物，从人新鲜手术肌肉组织获得人葡萄糖转运子4(GLUT4)cDNA基因，并体外克隆入测序载体，获得具有正确序列的目的基因．方法：经GeneBank在线检索，确定人GLUT4 cDNA基因特异引物，采用反转录聚合酶链方法从1例人手术新鲜腹部肌肉组织RNA模板中，获得人GLUT4表达片段cDNA的基因，经克隆入测序载体pGEM-3zf(-)，自动测序，验证cDNA大小及序列．结果：以我们设计的特异引物，从人肌肉组织模板中能得到预期大小的人GLUT4 cDNA基因RT-PCR产物，并能插入预定的克隆载体中测序，所得基因的序列符合目的基因的序列．结论：从人肌肉组织中能获得具有正确序列、含完整起始及终止密码的人GLUT4 cDNA基因。     

一种与人蛋白激酶CK2α'亚基相互作用蛋白的cDNA序列测定

目的：测定一种与人蛋白激酶CK2α’亚基相互作用蛋白的cDNA序列。方法：选择一个与人蛋白激酶CK2α’亚基相互作用蛋白的重组质粒pCADT7-Library cDNA，使用BigDyeTM荧光标记终止底物循环测序试剂盒，用载体pGADT7的T7-启动子为测序引物，在ABI PRISM310型基因分析仪上进行DNA测序。结果：该重组质粒的插入片段与泛素一核糖体蛋白S27a cDNA序列只有一个碱基的差别。结论：通过DNA测序，该种与人蛋白激酶CK2α’亚基相互作用蛋白为泛素一核糖体蛋白S27a的变体。     

人绒毛膜促性腺激素β亚基cDNA的克隆

用新鲜的人绒毛膜组织提取总RNA,并通过逆转录反应合成cDNA第一链,利用人工合成的一对寡核苷酸引物,采用PCR技术特异性地扩增人绒毛膜促性腺激素β亚基(hCG—β)cDNA,琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增片段大小为500bp,与预计的片段长度相符,将此片段刊用T—A载体克隆至PCRⅡ质粒上并进行全序列分析,结果显示克隆片段包含hCG—βcDNA5’端和3’端的非编码区及完整的编码区。     

重组小鼠CK2α′亚基的GST融合表达、纯化及活性测定

目的:研究重组小鼠CK2α'亚基在大肠杆菌中的谷胱甘肽S转移酶(GST)融合表达和纯化后活性的测定.方法:将含有小鼠CK2α'cDNA的pGEXGST-MCK2α'重组质粒转化大肠杆菌B121,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用谷胱甘肽-琼脂糖珠4B柱纯化,SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳银染鉴定.将纯化的CK2α'与CK2β以不同的摩尔比混合,找到构成有完全活性的CK2全酶的最佳摩尔比.用各种已知CK2底物鉴定莆组小鼠CK2全酶的性质.对纯化的CK2α'和重组CK2全酶进行动力学分析.结果:重组质粒转化表达菌经诱导后出现M,约为38 ku过度表达蛋白,约占菌体总蛋白的31.1%.SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳银染显示纯化的蛋白为单一蛋白带.纯化的CK2α'和β亚基等摩尔比混合可组成有完全活性的仝酶.重组CK2全酶的性质与天然CK2一致.重组CK2全酶对ATP或GTP的米氏常数(Km)值均小于单独CK2α',而最大反应速度(Vmax)值均大于单独CK2α'.结论:重组蛋白是小鼠蛋白激酶CK2α'亚基.     

人绒毛膜促性腺激素β亚基cDNA的克隆初步报告

用新鲜的人绒毛膜组织，抽提组织总ＲＮＡ并通过逆转录反应合成ｃＤＮＡ第一链。利用人工合成的一对寡核苷酸引物，采用ＰＣＲ技术特异性地扩增ｈＣＧ－β ｃＤＮＡ。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增片段大小为５００ｂｐ，同预计的片段长度相符。将此片段利用Ｔ－Ａ载体克隆至ＰＣＲⅡ质粒上并进行全序列分析，结果显示克隆片段包含ｈＣＧ－β ｃＤＮＡ５＇端和３＇端非编码区及完整的编码区。     

人地中海贫血基因β654的克隆与序列分析

【目的】克隆人地中海贫血基因β654,并进行序列分析,为下游转基因小鼠模型的建立奠定工作基础。【方法】以PCR法扩增获得人β654基因,将其克隆入卸除了人β基因的质粒pBGT51中,酶切、反向点杂交及测序法鉴定重组质粒。【结果】所构建的重组质粒中含人β654基因,其引入方向正确,序列分析结果正确。【结论】构建所得的重组质粒可用于下游的转基因工作。     

重组人白血病抑制因子受体α亚基细胞外区的分子克隆

纯化可溶性白血病抑制因子受体，获得特异性免疫原并利用衰变加速因子的附膜特性探讨ＬＩＦ受体的生物特性和功能。采用基因重组技术，将ＬＩＦ受体α亚基细胞外区的Ｃ－端与ＤＡＦＣ－端３７个氨基酸连接，再将该重组基因主ｐＧＥＸ－５Ｔ表达系统。结果：在Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１中可高度表达一种Ｎ－端为谷胱甘肽－Ｓ－转移酶和Ｃ－端为１９０ｓｏｌＤＡＦ的融合重组蛋白。     

人绒毛膜促性腺激素β亚基cDNA的克隆初步报告

用新鲜的人绒毛膜组织，抽提组织总ＲＮＡ并通过逆转录反应合成ｃＤＮＡ第一链。利用人工合成的一对寡核苷酸引物，采用ＰＣＲ技术特异性地扩增ｈＣＧ－β－ｃＤＮＡ。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增片段大小为５００ｂｐ，同预计的片段长度相符。将此片段利用Ｔ－Ａ载体克隆至ＰＣＲⅡ质粒上并进行全序列分析，结果显示克隆片段包含ｈＣＧ－βｃＤＮＡ５’端和３’端非编码区及完整的编码区。     

大鼠全长OBRb cDNA克隆及真核表达重组体的构建

目的克隆SD大鼠全长长胞内段瘦素受体基因cDNA(OBRb cDNA)及构建其真核表达重组体,为进一步研究该基因打下基础.方法应用RT-PCR方法分段扩增全长OBRb cDNA,再将它们连接起来,并获得载有全长OBRb cDNA的阳性克隆质粒.将上述质粒中全长OBRb cDNA定向插入真核表达质粒pcDNA3中,筛选出阳性克隆.通过限制性内切酶酶切和核苷酸序列测定进行鉴定.结果重组的克隆质粒和真核表达质粒经限制性内切酶酶切后获得的片段大小均与理论值一致.结论成功地克隆了SD大鼠全长OBRb cDNA,并构建了真核表达重组体.     

人抵抗素基因cDNA的克隆

目的克隆人抵抗素基因(hRETN)cDNA,为进一步研究RETN的结构和功能提供实验基础.方法应用RT-PCR方法从中国人网膜脂肪垫总RNA中扩增出RETN 基因cDNA,克隆入载体pMD18-T中,形成重组载体pMD18-T/hRETN.通过蓝白斑筛选出阳性克隆,限制性内切酶酶切鉴定后对其进行测序.结果从脂肪组织总RNA中扩增得到363 bp片段hRETN基因,其cDNA序列与Genbank hRETN基因序列基本相同.结论成功地克隆中国人hRETN cDNA.     

人Hrs cDNA的克隆与序列分析

以小鼠ＨｒｓｃＤＮＡ为探针从人胎盘ｃＤＮＡ文库中克隆出人ＨｒｓｃＤＮＡ，其全长为２９１０ｂｐ，所编码的蛋白质含７７７个氨基酸。人ＨｒｓｃＤＮＡ与小鼠ＨｒｓｃＤＮＡ间高度保守。推定的氨基酸序列含有锌指样结构域、脯氨酸丰富区及脯氨酸、谷氨酰胺丰富区。     

FMS样酪氨激酶3受体配基基因的克隆和序列分析

目的 获得人FLcDNA膜外序列,以构建表达人FMS样酪氨激酶3受体配基（FL）蛋白的重组本,更深入地探讨FL的生物学功能。方法 通过设计和合成引物,提取胎肝细胞总RNA进行逆转录反应,经PCR扩增目的cDNA片段,并将其重组至PUC－18T载体中,测定其DNA序列。结果 从胎肝细胞总RNA中扩增得到546bp片段,序列测定证实该片段为包括25个氨基酸残基组成的信号肽的胞外序列。结论 FL胞外区cDNA已被成功地克隆。     

从Hep-2细胞克隆hFGF-2 cDNA及序列分析

目的 从Hep-2细胞(人喉鳞癌细胞)克隆人的FGF-2cDNA,用于下一步构建携带hFGF-2cDNA的非复制型腺病毒载体。方法 设计和合成引物,提取Hep-2细胞的总mRNA,通过RT-PCR扩增出目的cDNA,然后将其重组到pGEM-T Easy载体中送测序分析。结果 经基因测序分析表明,从Hep-2细胞克隆的hFGF-2基因序列与已报告的序列,除在ATG后的第24位碱基发生无意突变外(由G-A),其他序列则完全一致。结论 从Hep-2细胞的总mRNA中成功克隆出hFGF-2的基因片段。     

人地中海贫血基因β654的克隆与序列分析

[目的]克隆人地中海贫血基因β654,并进行序列分析,为下游转基因小鼠模型的建立奠定工作基础。[方法]以PCR法扩增获得人β654基因,将其克隆入卸除了人β基因的质粒pBGT51中,酶切、反应点杂交及测 法鉴定重组质粒。[结果]所构建的重组质粒中含人β654基因,其引入方向正确,序列分析结果正确。[结论]构建所得的重组擀粒可用于下游的传基因工作。     

人α2b—干扰素的基因克隆及序列分析

健康中国人外周血白细胞，经新城鸡瘟病毒诱导表达人α2b－干扰素mRNA,用总RNA提取试剂盒取总RNA，利用逆转录－多聚酶链反应技术扩增编码人α2b-干扰素的cDNA序列，并将其克隆人PUC18载体。本DNA序列分析结果证实所克隆的cDNA是人α2b-干扰素基因。     

国人 ICA69 基因 cDNA 的克隆及序列分析

目的：克隆国人胰岛细胞自身抗原６９ｋＤ蛋白基因（ｈｉＩＣＡ６９）并经序列分析予以确证。方法：采用聚合酶链式反应技术,从中国人胰岛细胞瘤ｃＤＮＡ文库中扩增出ｈｉＩＣＡ６９编码序列ｃＤＮＡ,将基因片段插入ｐＳＰＯＲＴ１质粒,进一步亚克隆到ｐＵＣ１８载体中,经蓝白斑和限帛性酶谱分析得以初步筛选后,双脱氧末端终止法对其全部核苷酸序列予以确定。结果：证实了ｈｉＩＣＡ６９基因全长为１４４９ｂｐ、编码４８３个氨