P物质受体在大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的表达

目的 比较大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化过程中P物质(SP)受体的表达变化.方法 采用全骨髓法体外分离、培养SD大鼠BMSCs,分为诱导成骨组与未诱导组,在传代培养的不同时期(1、2、3周),采用免疫细胞化学、Western blot对BMSCs的成骨细胞诱导进行鉴定,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测各组细胞SP受体mRNA、蛋白的表达,观察时间-效应关系.结果 (1)rBMSCs及其诱导的成骨细胞有SP受体表达.(2)SP受体mRNA在诱导1周时下降(P<0.05),在诱导至3周时显著增高(P<0.05).(3)同一时间点诱导组SP受体的蛋白水平高于未诱导组(P<0.05),诱导组SP受体蛋白水平在第3周时显著增高(P<0.05),呈明显的时间依赖性.结论 大鼠BMSCs及其诱导的成骨细胞表达SP受体,随着成骨诱导的不断进行,SP受体在成骨分化的末期大量表达.     

5-氮杂胞苷和地塞米松对大鼠骨髓间充质干细胞分化作用的实验研究

[目的]探究5-氮杂胞苷和地塞米松对大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化能力的影响。[方法]SD大鼠骨髓间充质干细胞体外扩增和传代培养,流式细胞术鉴定细胞表面标志,取3代细胞随机分为空白组、激素组、激素+5-氮杂胞苷组,相应药物干预3 d后成骨诱导分化14 d,RT-PCR和Western blot检测Runx2和PPARγ的表达。[结果]所取得骨髓间充质干细胞纯度和均一性好,细胞表面标记CD90高表达,CD34、CD45低表达。第3代细胞经药物干预和成骨诱导后,与空白组相比,激素组Runx2基因表达降低,PPARγ基因升高,5-氮杂胞苷+激素组结果与激素组相反(P<0.05)。[结论]激素能抑制骨髓间充质干细胞成骨分化,促进成脂分化,5-氮杂胞苷能干预激素的这种作用,提高骨髓间充质干细胞分化潜能。     

人骨髓间充质干细胞的生物学特性及成骨诱导分化的研究

[目的]探讨成人骨髓间充质干细胞分离、纯化、培养及鉴定的方法,观察其成骨分化过程中Runx2基因的动态表达以及生物学特性。[方法]取自人股骨近端骨髓标本,利用联合密度梯度离心和差异贴壁法分离骨髓间充质干细胞,体外扩增和传代培养,流式细胞仪检测细胞表面标记,诱导向成骨细胞分化,并采用RT-PCR和Western blot方法检测Runx2的动态表达。[结果]原代和传代细胞呈纺锤状外观,生长增殖能力良好,骨髓间充质干细胞的生长曲呈成"S"形,细胞表面标记物CD90阳性表达,CD34和CD45阴性表达。经定向诱导分化后,细胞分别呈现成骨细胞的表型特征,随着诱导时间的增加,Runx2的表达也明显增加,与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。[结论]该方法能从人骨髓中高效分离和扩增MSCs,生物学性状稳定,具有成骨分化潜能,为骨组织工程提供理想的种子细胞,同时证实Runx2在成骨分化中起到重要的调控作用。     

神经肽对大鼠骨髓间质干细胞增殖影响的研究

目的 观察外源性降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)、P物质(substance P,SP)对大鼠骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖的影响,并探讨其机制.方法 使用全骨髓法分离、培养大鼠BMSCs,采用RT-PCR、Western Blot在传代培养的不同时间(1、2、3周)检测BMSCs神经肽受体mRNA、蛋白的表达情况.在不同时间点(1、3、5、7、9 d)使用浓度为1×10-8 mol/L的CGRP、SP分别作用于BMSCs,使用MTT比色法检测BMSCs增殖能力,Western Blot法检测BMSCs细胞周期相关调控基因cyclin D1、cyclin E、p53的蛋白表达变化.结果 RT-PCR、Western Blot结果显示BMSCs稳定表达CGRP受体、SP受体,同一时间点的CGRP受体表达高于SP受体表达.MTT结果显示,与对照组相比,CGRP在9d时促进BMSCs增殖,SP在7、9 d时促进BMSCs增殖.Western Blot结果显示,与对照组相比,CGRP促进BMSCs内cyclin D1、cyclin E蛋白表达,在5 d时达到高峰;SP促进BMSCs内cyclin E蛋白表达,在5 d时达到高峰;两种神经肽均降低BMSCs内p53蛋白表达.结论 CGRP、SP对BMSCs的增殖有直接促进作用,影响细胞周期相关调控基因蛋白的表达是其作用机制之一.     

神经肽对大鼠骨髓间质干细胞增殖影响的研究

目的 观察外源性降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)、P物质(substance P,SP)对大鼠骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖的影响,并探讨其机制.方法 使用全骨髓法分离、培养大鼠BMSCs,采用RT-PCR、Western Blot在传代培养的不同时间(1、2、3周)检测BMSCs神经肽受体mRNA、蛋白的表达情况.在不同时间点(1、3、5、7、9 d)使用浓度为1×10-8 mol/L的CGRP、SP分别作用于BMSCs,使用MTT比色法检测BMSCs增殖能力,Western Blot法检测BMSCs细胞周期相关调控基因cyclin D1、cyclin E、p53的蛋白表达变化.结果 RT-PCR、Western Blot结果显示BMSCs稳定表达CGRP受体、SP受体,同一时间点的CGRP受体表达高于SP受体表达.MTT结果显示,与对照组相比,CGRP在9d时促进BMSCs增殖,SP在7、9 d时促进BMSCs增殖.Western Blot结果显示,与对照组相比,CGRP促进BMSCs内cyclin D1、cyclin E蛋白表达,在5 d时达到高峰;SP促进BMSCs内cyclin E蛋白表达,在5 d时达到高峰;两种神经肽均降低BMSCs内p53蛋白表达.结论 CGRP、SP对BMSCs的增殖有直接促进作用,影响细胞周期相关调控基因蛋白的表达是其作用机制之一.     

大鼠牙髓干细胞与骨髓间充质干细胞分化成骨样细胞能力对比研究

目的：以骨髓间充质干细胞作为参考,讨论牙髓干细胞作为骨组织修复种子细胞的可行性。方法：通过酶消化法获得大鼠牙髓干细胞,离心法获得骨髓间充质干细胞,贴壁培养,通过倒置光学显微镜观察二者形态差异;流式细胞技术鉴定骨髓间充质干细胞的间质细胞表面标志物表达;MMT法检测细胞生长曲线;特定的成骨诱导液诱导干细胞成骨分化,免疫荧光法检测成骨细胞表面标志物表达。结果：分离的大鼠骨髓间充质干细胞与牙髓干细胞形态学以及生长特性具有相似性,且符合间充质干细胞特性,牙髓干细胞第4天进入对数生长期,第7天进入平台期,骨髓间充质干细胞第4天进入对数生长期,第8天进入平台期;经过成骨诱导后二者都具备成骨样细胞分化能力,牙髓干细胞在成骨诱导后的骨钙素表达上与骨髓间充质细胞有着相似的能力;牙本质泌涎蛋白表达阳性。结论：牙髓干细胞具有与骨髓间充质干细胞都具有成骨分化能力,但牙髓干细胞细胞成分相对复杂,增殖能力较强。     

骨碎补促进骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化

[目的]研究骨碎补对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖与成骨分化的影响。[方法]40只SD大鼠随机分为4组,包括空白对照组和3个处理组,空白对照组给予生理盐水,而3个处理组分别给予高、中、低浓度骨碎补水煎液连续灌胃3个月。给药期满后,取各组动物骨髓体外培养,全骨髓贴壁法纯化培养BMSCs,第三代BMSCs作为检测细胞。CCK-8法分析不同浓度的骨碎补水煎液对BMSCs增殖的作用。采用ALP试剂盒测定BMSCs成骨诱导后ALP活性,茜素红染色观察钙化结节情况,并测定成骨细胞相关RUNX2和Osterix及OCN mRNA的表达情况,以评估骨碎补对BMSCs成骨分化的影响。[结果]CD90和CD45细胞免疫荧光显色证实所培养细胞为BMSCs。CCK-8法检测显示骨碎补能够促进BMSCs增殖,并呈剂量依赖性,3个处理组与空白对照组间的差异具有统计学意义(P0.05)。在成骨诱导培养基中培养后,3个处理组间培养液上清ALP活性呈剂量依赖性增高,并伴有培养皿茜素红染色观察钙化结节的相应增多,与空白对照组间的差异具有统计学意义(P0.05)。此外,相应的RUNX2和Osterix及OCN的表达也呈骨碎补剂量依赖性增加,3个处理组与空白对照组间的差异具有统计学意义(P0.05)。[结论]骨碎补能够促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化。     

水蛭素通过上调VEGF/Notch1信号通路促进人骨髓间充质干细胞成骨分化

摘要：目的 观察水蛭素对人骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）成骨分化的影响。方法 BMSCs细胞分为正常培养的对照组、成骨诱导的诱导组以及加入不同浓度（1、10、20 ATU/mL）处理的水蛭素组。MTT检测细胞增值并筛选水蛭素最适作用浓度。流式细胞仪检测细胞凋亡。RT-PCR和Western blot分别检测成骨基因Runx2、Osterix、COL1A1的mRNA和蛋白表达。BCIP/NBT染色法检测细胞中的碱性磷酸酶水平。茜素红染色检测矿化结节。检测VEGF、Notch1、Jagged1和CBF1的mRNA和蛋白表达。结果 骨髓间充质干细胞经成骨诱导细胞增殖显著增加,中高浓度的水蛭素可以不同程度促进成骨诱导的BMSCs细胞增殖（P＜0.05）,并筛选出20 ATU/mL作为水蛭素的使用浓度。水蛭素抑制成骨诱导的BMSCs细胞凋亡,上调Runx2、Osterix、COL1A1的mRNA和蛋白表达,增加碱性磷酸酶水平,促进细胞中矿化结节的生成,并提升BMSCs细胞中VEGF、Notch1、Jagged1和CBF1的表达（P＜0.05）。结论 水蛭素可能通过上调VEGF/Notch1信号通路促进人骨髓间充质干细胞成骨分化。     

DKK1在大鼠骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化早期的差异性表达

目的：分析DKK1在大鼠骨髓间充质干细胞成脂、成骨分化早期的表达,探讨其调节机制。方法 Real－time PCR检测骨髓间充质干细胞在成脂、成骨诱导培养早期DKK1基因表达的水平;检测激素处理骨髓间充质干细胞DKK1基因的表达水平。结果成脂组与正常对照组,在成脂诱导6、12、24、48时DKK1基因表达水平较对照组增高,差异有统计学意义, P＜0．01。成骨组与正常对照组,0．5、6两个时间点DKK1基因表达量较对照组明显降低,差异有统计学意义,P＜0．05。骨髓间充质干细胞激素处理3、6、12、24时检测,结果显示激素作用下,骨髓间充质干细胞DKK1表达明显增加,差异有统计学意义,P＜0．05。结论 DKK1在骨髓间充质干细胞成脂、成骨分化早期可能起重要的调节作用,激素可能通过调节DKK1的表达而发挥调节成脂、成骨分化的作用。     

补肾健骨方含药血清对ROBs和rBMSCs增殖、分化和矿化的影响

目的 观察补肾健骨方含药血清对大鼠颅骨成骨细胞(rat calvarial osteoblasts,ROBs)和大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs)细胞活性及分化、矿化的影响.方法 制备补肾健骨方含药血清,将ROBs和rBMSCs分为5％、1...     

基于细胞膜片技术构建三维真皮样组织的体外研究

目的探讨应用细胞膜片技术构建三维真皮样组织的新策略。方法取2~3周龄新西兰大白兔骨髓,采用全骨髓贴壁法分离培养兔BMSCs(rabbit BMSCs,rBMSCs)并传代,取人皮肤成纤维细胞(human dermal fibroblasts,HDFs)传代培养。取第2代rBMSCs、第3代HDFs分别于培养皿采用膜片条件培养基连续培养2周,获得单层细胞膜片。取人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)接种于rBMSCs膜片上,构建预血管化膜片。培养期间于倒置相差显微镜下观察膜片上细胞形态变化;共培养1、3、7、14 d后取材行HE染色、CD31免疫荧光染色,观察细胞分布及微血管网络生成情况,以rBMSCs膜片作为对照。分别将培养7 d的预血管化膜片(实验组)及rBMSCs膜片(对照组)放于2层HDFs膜片中间,制备三维真皮样组织,培养24 h后行CD31免疫荧光染色及Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组织化学染色,评估细胞分布及胶原表达情况。结果细胞连续培养2周后成功制备HDFs膜片及rBMSCs膜片。HUVECs接种于rBMSCs膜片3 d后重新排列,7 d后形成网状结构,14 d后网状结构更明显;HE染色见膜片间有空泡形成,且随时间延长空泡日趋明显、膜片厚度显著增加;CD31免疫荧光染色可见微血管管腔形成。而rBMSCs膜片仅见细胞膜片增厚,未见细胞形态改变、空泡结构形成。三维真皮样组织观测显示,实验组内皮细胞CD31免疫荧光染色呈阳性,rBMSCs、HDFs及HUVECs细胞排列整齐;而对照组染色呈阴性,细胞随机排列。实验组和对照组Ⅰ、Ⅲ型胶原均呈阳性表达,与对照组比较,实验组细胞排列紧密,细胞基质分布规律,呈"蜂巢状"结构;两组Ⅰ、Ⅲ型胶原表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论应用细胞膜片技术可以构建三维真皮样组织,其中采用HUVECs联合rBMSCs膜片构建预血管化膜片后细胞基质分布较规律,具有形成组织工程真皮的潜力。     

冲击波与地塞米松对自体血清培养的骨髓间充质干细胞成骨分化的比较研究

[目的]观察冲击波(shock waves)与地塞米松对自体血清培养的人骨髓间充质干细胞(human mesenchyreal stem cells,hMSCs)体外成骨分化的影响比较.[方法]选择10名健康志愿者,每名健康志愿者抽取骨髓60 ml,抽取外周静脉血100 ml,然后分离出自体血清.把每名志愿者的骨髓分别...     

联合成骨细胞移植促进骨髓移植小鼠的造血功能重建

目的 探讨联合成骨细胞移植对骨髓移植小鼠造血功能重建的影响.方法 Balb/c小鼠60只,取其中18只制备移植用骨髓有核细胞和成骨细胞.将其余42只小鼠分为3组.单纯移植组:小鼠18只,仅进行骨髓移植(BMT);联合移植组:18只,进行BMT的同时每只小鼠输入成骨细胞2×106个;正常对照组:小鼠6只,不做任何处理,仅作为移植前的正常对照.移植组小鼠在全身照射(TBI)预处理后4 h经尾静脉注入骨髓细胞2×106个.移植后第7、14和21天,分别处死移植组小鼠6只,对小鼠的外周血细胞和骨髓单个核细胞(BMMNC)进行计数,采用流式细胞术测定BMMNC中CD34+细胞的百分比,使用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像系统测量骨髓造血组织面积,采用免疫组化染色法测定骨髓组织微血管密度(MVD).结果 移植后第7天,单纯移植组和联合移植组小鼠外周血细胞计数及BMMNC数均明显低于正常对照(P＜0.01).第21天时联合移植组小鼠白细胞、红细胞及BMMNC数明显恢复,血小板数已接近正常对照组;单纯移植组小鼠外周血细胞数和BMMNC数虽然有所恢复,但其恢复程度明显弱于联合移植组.移植后第7、14和21天,联合移植组外周血细胞计数及BMMNC数均明显高于同期单纯移植组(P＜0.01或P＜0.05).移植后第7、14、21天,单纯移植组和联合移植组小鼠骨髓造血组织面积、BMMNC中CD34+细胞百分比及骨髓组织MVD均明显低于正常对照组(P＜0.01),但联合移植组均高于同期单纯移植组(P＜0.01或P＜0.05).结论 联合成骨细胞移植能有效促进骨髓移植小鼠骨髓造血系统的重建.

Abstract：

Objective To explore the effects of cotransplantation with osteoblasts on hematopoietic reconstitution in mice after bone marrow transplantation (BMT). Methods The typical model of syngeneic BMT was established. 18 Balb/c mice were used to prepare the bone marrow nuclear cells and osteoblasts for BMT. The 42 Balb/c mice were randomly divided into 3 group:normal group (6 mice, without any treatment), the single BMT group ( 18 mice, given 2 × 106 bone marrow nuclear cells/each mouse) and the cotransplantation group of HSC with osteoblaats (18 mice,given 2 × 106 bone marrow nuclear cells and osteoblasts/each mouse). The following factors were measured on day 7, 14, 21 after BMT: peripheral blood cells, bone marrow mononuclear cells (BMMNC), the percentage of CD34+ cells in BMMNC (assayed by flow cytometry), the hematopoietic tissue changes (detected by HPIAS-1000 image analysis system) and micro vascular density (MVD) of bone marrow tissue (with immunohistochemistry). Results The levels of periphral WBC, RBC, PLT, BMMNC in the contransplantation group were higher than those in the single BMT group (P＜0. 01 or P＜0. 05). In the contransplantation group, the percentage of CD34+ cells in BMMNC, the hematopoietic tissue area and the MVD of bone marrow were also higher than the single BMT group on the 7th, 14th, 21st day after BMT(P＜0.01 or P＜0.05). Conclusion Cotransplantation with osteoblasts could significantly promote hematopoietic reconstruction in mice after BMT. Cotransplantation may represent a promising means of achieving higher engraftment rate after BMT.     

血管束、感觉神经束植入组织工程骨降钙素基因相关肽和受体的时空分布

目的 探讨单纯血管束、感觉神经束分别植入组织工程骨修复兔骨缺损对降钙素基因相关肽(CGRP)及受体(CGRPR-1)表达的影响.方法 54只新西兰兔按随机数字表法分为三组(n=18):感觉神经束植入组(A组)、血管束植入组(B组)、单纯组织工程骨对照组(C组),于术后4、8、12周分别处死18只动物,对修复骨段行Masson染色观察骨形成与改建过程,同时行免疫组化染色检测修复骨段内CGRP及CGRPR-1的表达,并提取总RNA行Real-time PCR检测CGRP及CGRPR-1的表达情况.结果 各时间点A组和B组CGRP、CGRPR-1 mRNA的表达均高于C组,且A组表达高于B组,差异均有统计学意义(P<0.05);随时间延长,组织工程骨内CGRP及CGRPR-1 mRNA呈先增高后逐渐降低趋势,8周时mRNA高于4周和12周,4周时mRNA在3个检测时间点中最低,差异均有统计学意义(P<0.05);组织工程骨内新生骨质边缘、骨膜、血管周围均有CGRP阳性表达,分布均匀;CGRPR-1于成骨细胞周围表达较多.结论 植入感觉神经柬和血管束均能促进神经肽分泌,植入血管束分泌更多.     

骨形态发生蛋白-2基因转染兔骨髓基质干细胞及复合纳米羟基磷灰石体外构建组织工程骨的研究

目的 探讨腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2表达载体(Ad-BMP-2)转染兔骨髓基质干细胞(rBMSCs)后复合到纳米羟基磷灰石(Nano-HA)体外构建仿生人工骨的可行性. 方法 采用GatewayTM技术构建腺病毒载体,溶胶-絮凝法制备Nano-HA,用Ad-BMP-2转染体外培养的rBMSCs,免疫组化、RT-PCR和蛋白印迹方法检测转染后细胞的BMP-2表达.将转染48 h的细胞均匀接种到Nano-HA支架上,第3、5天取细胞载体复合物扫描电镜观察细胞贴附、生长状况,消化收集贴附支架的细胞,蛋白印迹检测贴附支架细胞BMP-2的表达.结果 转染后BMP-2基金在mRNA水平和蛋白水平均有高表达;扫描电镜见转染细胞在支架材料分布均匀,黏附良好,转染后及复合后Western Blot检测BMP-2表达较高.结论 利用转基因技术,用含目的基因的腺病毒载体转染靶细胞复合到Nano-HA,细胞载体复合物稳定长效地分泌生长因子,体外成功地构建了仿生人工骨.     

聚乙二醇化骨形态发生蛋白-2基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达测定

目的：聚乙二醇化骨形态发生蛋白-2基因（PEG/BMP-2）纳米颗粒转染兔骨髓间充质干细胞（rBMSCs）,检测骨形态发生蛋白-2（BMP-2）在靶细胞中的表达。方法：原代分离培养rBMSCs,分别采用PEG/BMP-2、脂质体/BMP-2转染细胞,采用流式细胞仪检测转染效率,采用Western Blot和real time RT-PCR方法检测BMP-2表达。结果：成功制备出PEG/BMP-2纳米颗粒并将PEG/BMP-2转染至rBMSCs,转染细胞中BMP-2呈高表达,且与脂质体转染法相比,具有更高的转染效率。结论：PEG/BMP-2纳米颗粒转染rBMSCs可高表达BMP-2,为骨缺损治疗修复提供新的治疗方法。