hCGβ-CTP多聚体-3C3d融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的表达

目的：在巴氏毕赤酵母细胞中表达hCGβ-（CTP）n（n=3，4）-3C3d融合蛋白。方法：将（CTP）n（n=3，4）基因与分子佐剂C3d基因的三聚体连接后，克隆入载体pPIC9K得到表达质粒pPIC9Khis6（CTP）n（n=3，4）3C3d,经限制性内切酶酶切鉴定及DNA测序确认后电转入酵母细胞中进行表达。结果：在酵母细胞内检测到目的基因的表达产物，Western blot结果显示它们的分子量分别为125 kD和138 kD左右。结论：运用巴氏毕赤酵母表达系统成功表达了hCGβ-（CTP）n（n=3，4）-3C3d融合蛋白，为进一步研究其免疫原性和用作抗肿瘤疫苗奠定了基础。     

hCGb-CTP多聚体-3C3d融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的表达

目的:在巴氏毕赤酵母细胞中表达hCGβ-(CTP)n(n=3,4)-3C3d融合蛋白。方法:将(CTP)n(n=3,4)基因与分子佐剂C3d基因的三聚体连接后,克隆入载体pPIC9K得到表达质粒pPIC9Khis6(CTP)n(n=3,4)3C3d,经限制性内切酶酶切鉴定及DNA测序确认后电转入酵母细胞中进行表达。结果:在酵母细胞内检测到目的基因的表达产物,Westernblot结果显示它们的分子量分别为125kD和138kD左右。结论:运用巴氏毕赤酵母表达系统成功表达了hCGβ-(CTP)n(n=3,4)-3C3d融合蛋白,为进一步研究其免疫原性和用作抗肿瘤疫苗奠定了基础。     

猪卵透明带-3β蛋白核心片断在E.coli中的表达

目的:探讨通过基因工程的方法在大肠杆菌中表达猪卵透明带蛋白pZP3b的核心片断。方法:采用PCR方法扩增原cDNA中编码第44-306个氨基酸的pZP3β核心片断的DNA序列,克隆入pET-3c载体进而在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)pLysS中表达。结果:表达的pZP3β核心蛋白占菌体总蛋白的15%,并经Western-blot鉴定为目的蛋白。结论:pZP3β核心片断在大肠杆菌中获得较高的表达,有利于产物的纯化,为后续阐明pZP3β核心区域的性质和相关抗生育研究打下了基础。     

hCGβ-C3d3融合蛋白免疫BALB/c小鼠及其抗血清对hCG诱导鼠子宫增重的抑制效应

目的:通过分子佐剂C3d3增强hCGb避孕疫苗的免疫原性。方法:采用分子生物学技术以phCMV1为载体分别构建分泌型、带有6个组氨酸纯化标签的真核表达质粒phCMV1-6His-hCGb-C3d3和phCMV1-6His-hCGb,在CHO细胞中获得稳定、高效表达的重组蛋白,并用镍柱和凝胶过滤层析对其进行分离、纯化。分别用hCGb-C3d3融合蛋白和单用hCGb间隔4周两次免疫生育期雌性BALB/c小鼠,ELISA测定血清中抗hCGb抗体滴度,并对各组小鼠产生的抗血清拮抗hCG诱导的小鼠子宫增重效应进行比较。结果:C3d3使hCGb蛋白疫苗的免疫原性增强1 995倍,hCGb-C3d3融合蛋白免疫小鼠产生的抗血清具有很强的抑制小鼠子宫增重作用。结论:通过分子佐剂C3d3可以大幅提高机体对hCGb的体液免疫应答能力,hCGb-C3d3融合蛋白免疫小鼠产生的抗血清对hCG的生物学作用具有更强的抑制效应。     

非融合膜外型猪卵透明带-3β蛋白在原核系统中的表达

目的:通过基因工程的方法在原核表达系统中表达去除了信号肽和跨膜区的膜外型猪卵透明带蛋白pZP3β。方法:设计适宜引物,采用PCR方法,在基因水平对膜外型pZP3β的翻译起始序列进行适当调整,获得的基因克隆入pET-3c载体,并进一步在大肠杆菌E.coli BL21(DE3) pLysS中表达。结果:得到表达率约10%的非融合膜外型pZP3β蛋白的表达,并经Western-blot鉴定为目的蛋白。结论:外源蛋白在不改变氨基酸序列条件下,在基因水平的适当调整可以有效提高其表达率。     

翻译起始区突变对猪卵透明带-3β蛋白在E.coli表达的影响

目的:探讨翻译起始区(translation initiation region,TIR)突变对两种氨基酸序列长度不同的猪卵透明带蛋白pZP3β161和pZP3β263在大肠杆菌中表达的影响。方法:应用DNASIS软件辅助分析,分别设计5条不同的上游引物对两种pZP3β基因的TIR区的G+C含量和自由能进行合理调整,PCR扩增后将获得的基因片段克隆入pET-3c载体,于大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达。结果:TIR对pZP3β表达有明显的影响,其表达的pZP3β161蛋白和pZP3β263蛋白分别占菌总蛋白的25％和15％。结论:在不改变氨基酸的条件下,通过对目的基因TIR进行适当改造,能够有效提高目的蛋白的表达效率。     

猪卵透明带-3β截短型蛋白在原核系统中的表达研究

目的:制备具有猪卵透明带-3β抗原活性的截短型pZP3β蛋白(tunc-pZP3β),以便对该蛋白的抗原表位区域作深入研究。方法:采用PCR方法扩增原cDNA中编码第130个氨基酸到第290个氨基酸的DNA序列。获得的tunc-pZP3β基因片段通过引入其两端的NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点被定向插入pET-3c质粒T7强启动子下游的多克隆区,筛选出重组子,经DNA测序验证正确后,转化表达菌株BL21(DE3)pLysS,再用IPTG对重组菌体进行诱导。结果:SDS-PAGE分析表明tunc-pZP3β在大肠杆菌系统中高水平表达,且在WesternBlot免疫印迹中能被特异性抗体识别。结论:对适当的抗原表位序列进行保留而截去两端一定的氨基酸序列,所获得的截短型蛋白能够实现在大肠杆菌中高效表达,这有利于深入研究该蛋白核心区域的功能。     

溶脲脲原体蛋白UreG抗体对小鼠体外受精的影响

目的:探索与人精子膜存在交叉反应的溶脲脲原体蛋白UreG抗体对小鼠体外受精的影响。方法:提取溶脲脲原体总DNA,用自行设计的引物扩增UreG全序列,PCR产物经TA克隆后,用BamHⅠ和HindⅢ双酶切,克隆到表达载体pET-28a(+)中。在E.coliBL21中,异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达His融合蛋白。用亲和层析纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,获取多克隆抗体。观察该抗体对小鼠体外受精的影响。结果:对表达重组蛋白的质粒进行DNA测序以及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,证实获取了目的蛋白。ELISA检测证实,免疫小鼠产生了高效价的抗体。该抗体能够抑制小鼠精卵的融合。结论:与人精子膜存在交叉反应的溶脲脲原体蛋白UreG抗体,可导致小鼠精卵结合率降低。     

翻译起始区突变对猪卯透明带-3β蛋白在E．coli表达的影响

目的：探讨翻译起始区（translation initiation region，TIR）突变对两种氨基酸序列长度不同的猪卵透明带蛋白pZP3β161和pZP3β263在大肠杆菌中表达的影响。方法：应用DNASIS软件辅助分析，分别设计5条不同的上游引物对两种pZP3β基因的TIR区的G＋C含量和自由能进行合理调整，PCR扩增后将获得的基因片段克隆pET-3c载体，于大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中诱导表达。结果：TIR对pZP3β表达有明显的影响，其表达的pZP3β161蛋白和pZP3β263蛋白分别占菌总蛋白的25％和15％。结论：在不改变氨基酸的条件下，通过对目的基因TIR进行适当改造，能够有效提高目的蛋白的表达效率。     

HPV58型E1^E4蛋白的表达纯化和多克隆抗体的制备

目的:构建pRSET-A\E1^E4原核表达载体,获得E1^E4蛋白的多克隆抗体。方法:在BL21(DE3)细胞中诱导E1^E4融合蛋白表达,收集包涵体经过镍柱纯化后免疫新西兰白兔,获得的抗血清经硫酸铵沉淀法纯化得到抗体。结果:经Western blotting检测表明制备的E1^E4蛋白多克隆抗体特异性较好。结论:成功获得了纯化的E1^E4蛋白抗体,有助于后续HPV58型E1^E4蛋白功能和B细胞抗原表位的研究。     

RNA干扰抑制ABCG2表达对子痫前期滋养细胞分泌hCG的影响

目的:应用RNA干扰技术,使胎盘滋养细胞ATP结合匣式转运子G2(ABCG2)基因表达沉默,检测干扰前后ABCG2的表达及人绒毛膜促性腺激素β亚单位(β-hCG)水平变化,研究ABCG2的表达对子痫前期滋养细胞分泌β-hCG功能的影响。方法:通过小干扰RNA(siRNA)预测工具确定3个ABCG2基因的siRNA靶位点,合成3对互补的短发夹RNA(shRNA)序列转化质粒,选取干扰有效的质粒包装慢病毒后感染原代培养正常及子痫前期胎盘滋养细胞,应用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)及蛋白质印迹(Western blotting)检测干扰前、后滋养细胞ABCG2 mRNA及蛋白的表达水平,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测干扰前、后不同分化状态细胞上清液中的β-hCG水平。结果:有效的RNA干扰后滋养细胞ABCG2 mRNA及蛋白的表达明显降低,无论干扰前、后子痫前期滋养细胞hCG分泌都高于正常,干扰后滋养细胞分泌hCG水平降低。结论:siRNA可有效干扰滋养细胞ABCG2基因的表达,ABCG2基因表达沉默后胎盘滋养细胞hCG分泌下降,推测子痫前期ABCG2表达升高可通过促进滋养细胞分泌hCG抑制子痫前期的发展。     

人睾丸发生过程中转化生长因子β_1受体(TGF-β_1R)表达的研究

目的:研究转化生长因子β_1受体(TGF-β_1R)在人胚胎睾丸发生过程中的表达。方法:收集25例12～28周龄胎儿睾丸标本,免疫组织化学ABC法染色,以正常羊血清代替一抗为阴性对照,TGF-β_1受体抗血清的工作浓度为1:100,光镜观察。结果:TGF-β_1受体在人胚胎睾丸间质细胞呈阳性表达,曲细精管内精原细胞、支持细胞、管用细胞未见阳性表达。TGF-β_1也受体在12周龄睾丸组织未见阳性表达,16周时达高峰,此后呈逐渐下降趋势(P<0.05)。结论:TGF-β_1也通过与其受体结合在人睾丸发生过程中起重要作用。     

人PKM2基因克隆、表达及纯化的研究

目的:构建人PKM2(M2-type pyruvate kinase)的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达,镍离子柱亲和层析法纯化融合蛋白.方法:用PCR方法从宫颈癌Hela细胞全基因组中扩增出目的基因PKM2,通过克隆载体pET30a(+)构建质粒载体pET30a(+)-PKM2.经双酶切和DNA测序证实正确后,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化.结果:双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果和报道一致.经SDS-PAGE分析,纯化后的蛋白约在58 KDa位,条带单一,无杂带出现.结论:成功表达纯化了PKM2融合蛋白,为肿瘤疫苗研制和肿瘤标志物快速诊断的研究奠定基础.     

尿β-核心hCG:对孕早期(11～14周妊娠)非整倍体的筛选

在孕中期对Down氏综合征的生化筛选最有诊断价值的标记是人绒毛促性腺激素(hCG)或其游离β-亚单位。该激素的完整分子是含一个特殊β-亚单位与α-亚单位共价结合的二聚体。在Down氏综合征孕妇血浆中完整hCG和游离β-亚单位水平升高,在β-亚单位残基47和48或44和45之间存在切     

HPV58型E2蛋白表达纯化与多克隆抗体制备

目的:表达纯化重组人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)58型E2蛋白,制备多克隆抗体。方法:构建重组质粒p ET-28b-E2,转化至BL21(DE3)p Lys S中诱导表达,包涵体洗涤后经镍柱亲和层析分离得到纯化目的蛋白。用纯化的重组E2蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗HPV58型E2蛋白多克隆抗体,ELISA分析多克隆抗体的效价,免疫印迹检测抗体的特异性。结果:表达纯化了重组HPV58型E2蛋白,制备了高滴度和高特异性的多克隆抗体。结论:制备的多克隆抗体可用于对HPV58型E2蛋白进行精细B细胞线性表位鉴定。     

志贺毒素2A-促黄体生成素释放激素重组毒素的构建、表达及其意义

目的 构建一种对子宫颈癌HeLa细胞有特异性杀伤作用的志贺毒素2A-促黄体生成素释放激素(Stx2A-LHRH)重组毒素,以探索其成为新型靶向药物的可能性。方法 用聚合酶链反应(PCR)技术扩增Stx2A-LHRH DNA片段,克隆至pET-20b( )质粒中,酶切鉴定及测序证明成功地构建了重组毒素表达质粒pET-Stx2A-LHRH,将其转染大肠杆菌BL21(DE3)菌株后,以异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳及凝胶薄层扫描分析Stx2A-LHRH重组毒素的表达情况。倒置显微镜下观察Stx2A-LHRH对HeLa细胞的作用。结果 SDS-PAGE电泳分析显示,在实验上清液中,诱导出相对分子质量为38000的融合蛋白,说明该载体表达了Stx2A-LHRH重组毒素,且其表达量占上清液中总蛋白的10．32％。加入Stx2A-LHRH重组毒素后,宫颈癌HeLa细胞几乎全部死亡。结论 成功构建了Stx2A-LHRH重组毒素,为研制治疗子宫颈癌的新型药物提供了理论依据。     

子痫前期患者血清及胎盘组织中TGF-β_1的表达探讨

目的:探讨子痫前期(PE)患者外周血、新生儿脐血血清和胎盘组织中转化生长因子β_1(TGF-β_1)的表达及其临床意义。方法:采用病例-对照研究方法,对2015年1月1日至2015年12月31日在本院产检并分娩的正常妊娠组(对照组,n=50)和PE组(n=54,其中早发型PE组29例,晚发型PE组25例)使用酶联免疫吸附法及蛋白印迹法分别检测两组孕妇外周血、新生儿脐血血清及胎盘组织中TGF-β_1表达水平,分析与临床指标的关系。结果:①两组在入组年龄、分娩孕周、定期产检、最高收缩压、舒张压、新生儿体质量、血肌酐、尿酸、白蛋白方面差异有统计学意义(P0.01)。②PE组孕妇外周血血清中TGF-β_1水平与年龄负相关(r=-0.289,P0.05),与发病孕周、最高血压、新生儿体质量、白蛋白、血肌酐、尿酸无明显相关(P0.05)。③早发型P E组和晚发型PE组孕妇外周血血清TGF-β_1水平显著高于对照组(P0.05),但新生儿脐血血清TGF-β_1水平比较差异无统计学意义(P0.05)。④早发型PE组和晚发型PE组孕妇胎盘组织中TGF-β_1的表达水平显著高于对照组(P0.05),早发型PE组、晚发型PE组TGF-β_1蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:TGF-β_1可能参与PE的病理生理和发病机制,随着年龄的增长,其在母体外周血血清表达越低。孕晚期检测母体外周血血清TGF-β_1水平,可能有助于高危人群的筛查。     

整合素α_v、α_4、β_3、β_1在不同发育时期小鼠胚卵中的表达

目的:观察小鼠受精后1~4 d胚卵(原核期、2-细胞期、4~8-细胞期、胚泡期)整合素αv、α4、β3、β1的表达。方法:用免疫组织化学ABC法检测妊娠1~4 d小鼠胚卵整合素αv、α4、β3、β1的表达。结果:整合素αv、α4、β3、β1在小鼠妊娠1~4 d的胚卵上均有表达,表达强弱不等。整合素αv、α4、β3在受精后第2日表达最强,整合素β1在受精后第3日表达最强;整合素αv在受精后第4日和α4、β3、β1在受精后第1日表达最弱。结论:妊娠1~4 d小鼠胚卵持续表达整合素αv、α4、β3、β1,提示它们可能与小鼠胚卵在输卵管中的运输有关。     

小鼠卵巢玻璃化冻融过程中重组人卵泡刺激素干预对血管内皮生长因子(VEGF)及整合素αvβ3表达的影响

目的:观察重组人卵泡刺激素(r FSH)对小鼠卵巢血管内皮生长因子(VEGF)以及整合素αvβ3表达的影响。方法:将4周龄C57BL/6J小鼠卵巢随机分为新鲜对照组(FCG)、玻璃化冻存对照组(VCG)、300 IU/L r FSH干预玻璃化冻存组(r FSH-VG)。通过对冻融卵巢内各级卵泡计数、免疫组织化学观察VEGF和整合素αvβ3在卵巢不同细胞中的定位,Western blotting检测VEGF、整合素αv和整合素β3蛋白表达量。结果:各级卵泡计数、VEGF及整合素β3的蛋白表达均为r FSHVG组优于VCG组(P0.05),整合素αv的表达组间均无统计学差异(P0.05)。结论:玻璃化冻融过程中添加r FSH可以上调VEGF及整合素β3蛋白的表达。     

重组着床丝氨酸蛋白酶-2(ISP2)在昆虫细胞中的表达

目的:利用昆虫细胞表达着床丝氨酸蛋白酶-2(implantation serine proteinase-2,ISP2)。方法:将ISP2cDNA克隆入核型多角体病毒(AcNPV)非融合蛋白基因表达载体pVL1392,获得的重组表达载体pVL1392/ISP2,与BaculGoldTM线性杆状病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9,经多次扩增后获得高滴度的重组病毒AcNPV-ISP2。将此重组病毒感染昆虫细胞,收集转染细胞培养上清液。结果:用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色和Westernblot测得培养上清液中有表达蛋白,分子量为40kD左右。结论:用杆状病毒系统表达的ISP2能分泌到细胞外,有利于产物的分离纯化,为进一步研究ISP2在着床中的生物功能奠定了基础。