犬化学去细胞神经同种异体移植的早期观察

目的：以化学去细胞同种异体神经，移植修复犬粗大神经的长段缺损，观察早期功能恢复及神经再生。方法：去细胞神经移植组和自体神经移植组各3犬，分别桥接坐骨神经5.0cm缺损。术后3个月观察其运动功能及神经再生。结果：实验组和对照组在术后功能恢复；移植段内新生神经纤维、新生血管及许旺细胞；吻合口远端有髓神经纤维等方面非常相似。结论：化学去细胞神经作为同种异体神经移植物，在修复粗大和长段神经缺损时不会被宿主排斥和吸收，其早期功能恢复及神经再生与自体神经移植无明显差别。     

去细胞同种异体神经移植修复周围神经缺损临床安全性研究

目的 探讨化学去细胞同种异体神经移植修复人体周围神经缺损的临床安全性.方法 从2002年3月至2011年1月,取成年遗体捐献者的周围神经,使用化学萃取法制备去细胞同种异体神经,将其消毒、储存,并用于临床治疗41例周围神经缺损患者.男性38例,女性3例,年龄10～55岁.受伤至神经修复时间10 h至9个月,平均4.1个月.受损神经包括臂丛神经10例,上臂桡神经3例,前臂尺神经4例,指(趾)神经12例,坐骨神经2例,胫神经3例,腓总神经5例,股神经2例.合并骨折12例,合并软组织损伤或缺损20例.神经桥接长度2～10 cm,平均6.1 cm.术后不使用免疫抑制药物.术后随访9～5l个月,平均20.2个月.通过手术部位物理检查及血生化和免疫检测以评价移植的安全性.结果 术后患者全部得到随访,39例伤口一期愈合,2例发生表浅感染,经换药后延迟愈合.所有患者均未发生免疫排斥反应、过敏性反应、深部感染、肝肾毒副作用等不良反应.术后1、12周血生化检测均正常,特种蛋白、淋巴细胞亚群等免疫检测指标术前、术后差异无统计学意义.结论 临床上采用去细胞同种异体神经移植修复人体周围神经缺损是安全的.     

化学去细胞异体神经修复神经缺损长度的实验研究

[目的]研究神经长度是否影响化学去细胞神经的质量及化学去细胞异体神经修复犬神经缺损的适当长度范围。[方法]切取犬的坐骨神经全长，截取直径近似段长度12cm，去除神经外膜的脂肪组织及血管，在5．0％Triton X-100和5．0％脱氧胆酸钠中重复消化得到化学去细胞神经；部分神经用于组织学评价，将12cm神经按顺序切割为6段，石蜡包埋制备切片，厚度5μm。HE染色和Fastblue染色，观察去细胞程度、神经细胞外基质结构完整性、髓鞘染色强度，观察每段神经的差异。在体内实验中，用化学去细胞异体神经桥接犬的坐骨神经缺损，缺损长度分别为8、10cm组，每组各有6条成年犬，随访时间12个月。观察动物肢体功能恢复、肌电图变化及再生神经组织学表现，包括HE染色、S-100免疫组织化学染色、乙酰胆碱酯酶染色。[结果]去细胞神经全长各段在去细胞程度、结构完整性及残余髓鞘染色综合评价中无差异。体内移植实验结果显示8cm去细胞异体神经移植组的犬在术后12个月踝关节可直立行走，而10cm去细胞异体神经移植组犬12个月时踝关节不能直立行走。肌电图检查结果显示，两组动物的手术肢体均可记录到诱发的运动和感觉电位。肌电图波幅、时限及运动神经传导速度结果显示，8cm移植组明显高于10cm移植组（P〈0．05）。组织学检查显示8cm移植组再生的神经轴突通过移植段神经到达远侧的神经中，并与所支配的肌肉建立新的运动终板联系，坐骨神经支配的小腿三头肌中有大量新生的运动终板形成。在10cm移植组有部分再生的神经纤维通过移植段神经进入远端的神经，小腿三头肌中新生的运动终板数量和大小明显低于8cm移植组（P〈0．05）。[结论]在化学去细胞神经的制备中，神经的长度对去细胞的质量无影响；化学去细胞异体神经修复神经缺损的长度若不超过8cm可取得较满意的功能康复结果。     

粗大异体神经两种化学萃取方法的比较

[目的]采用两种不同的化学法萃取粗大的异体神经,对比观察这两种方法在萃取效果方面的差别。[方法]取新鲜猪坐骨神经,每段长60mm,分别在Triton-100、脱氧胆酸钠及SB-10、SB-16、Triton-200中去细胞处理。实验分两组:Ⅰ组,Triton-100、脱氧胆酸钠去细胞2遍;Ⅱ组SB-10、SB-16、Triton-200去细胞处理2遍。另设对照组:新鲜未处理的猪坐骨神经。从去细胞程度、基底膜板层素活性、脱髓鞘程度及神经纤维管道完整性4个方面进行评价。[结果]所有实验组神经段神经纤维管道尚可,Ⅰ组较Ⅱ组去细胞完全,laminin成分保存;Ⅰ组脱髓鞘完全,Ⅱ组髓鞘成分有残留;Ⅰ组和Ⅱ组神经管道完整性比正常神经管道结构完整性差,在去细胞神经的制备过程中,应考虑基底膜的活性、去细胞、脱髓鞘及结构完整性的程度。[结论]对于粗大神经的处理,Triton-100、脱氧胆酸钠法作去细胞神经处理可能是一种较好的方法。     

用去细胞同种异体神经构建猕猴组织工程化神经的实验研究

目的评价用自体源骨髓间充质干细胞(MSCs)或许旺细胞(SCs)作种子细胞,与去细胞同种异体神经构建的组织工程化外周神经修复猕猴尺神经4cm缺损的实验效果,为临床研究提供资料。方法分别用4种移植物桥接猕猴4cm尺神经缺损。A组:种植自体MSCs的去细胞同种异体神经;B组:种植自体SCs的去细胞同种异体神经;C组:去细胞同种异体神经;D组:自体神经移植。通过功能学、神经电生理学及组织学指标评价各组修复神经缺损的效果。结果A、B组术后6个月能引起小鱼际肌群产生复合动作电位的潜伏期、复合动作电位的最大振幅、神经传导速度和再生的神经纤维数目与自体神经移植组相比无统计学意义(P>0.05);但A、B、C、D组分别与C组相比,差异有统计学意义(P>0.05)。结论用自体源SCs或MSCs作种子细胞,与去细胞同种异体神经构建的组织工程化外周神经修复猕猴4cm尺神经缺损,均能取得与自体神经移植相近的效果。     

异种化学去细胞神经移植修复大鼠坐骨神经缺损的功能评价

[目的]评价异种化学去细胞神经移植修复大鼠坐骨神经缺损后神经功能恢复,从而为临床应用去细胞异种神经移植修复神经缺损提供更为充分的理论依据.[方法]雄性Wistar大鼠15只,致左侧坐骨神经1 cm缺损,以等粗兔化学去细胞神经移植修复.每2周测定坐骨神经指数,移植后4个月动物麻醉后暴露移植段神经,刺激近侧神经干、于同侧胫后肌群记录运动诱发电位,之后取移植段神经切片后行HE组织化学及NF-160免疫组织化学染色. [结果]去细胞异种神经移植物未被宿主排斥,大量神经纤维长入移植物,神经电生理及坐骨神经指数显示宿主坐骨神经功能有部分恢复.[结论]去细胞异种神经移植可以作为修复周围神经缺损的一种有效方法.     

优化法去细胞大鼠神经同种异体移植修复坐骨神经缺损

[目的]以优化法去细胞大鼠神经移植,修复同种异体坐骨神经缺损,观察术后动物的免疫排斥、早期功能恢复及神经再生情况。[方法]以优化去细胞方法处理新鲜取材的成年SD大鼠坐骨神经,移植修复同种异体1.0cm坐骨神经缺损,以自体神经和新鲜异体神经移植为对照,术后1个月行坐骨神经功能指数评价、神经电生理和组织学检查,观察动物在功能恢复、免疫排斥及神经再生方面的情况。[结果]自体神经和去细胞异体神经移植组动物的坐骨神经功能指数无显著差异(P>0.05),大体观察均可见神经连续性良好。电生理检测表明2组动物移植神经均已恢复电传导能力,在传导速度(CV)上无显著差异(P>0.05),但均未达到正常神经水平(P<0.05)。组织学观察则显示2组再生神经纤维均已长入移植段远端。S-100免疫组化显示两者在雪旺氏细胞数、形态和排列等方面无明显差异。2组在CD8 T细胞和巨噬细胞免疫组化染色阳性面积百分比上差异无统计学意义(P>0.05)。计算移植神经中段轴突密度后表明两者无显著差异(P>0.05),但都比正常神经小(P<0.05),比新鲜异体神经移植组大(P<0.05)。[结论]优化去细胞神经移植组与自体神经移植组在免疫排斥、功能恢复及神经再生方面无显著差异。优化法去细胞神经在移植修复同种异体神经缺损时,可以达到免疫耐受,其早期功能恢复和神经再生情况良好,在修复周围神经缺损时可以作为自体神经移植的一种替代疗法。     

大鼠化学去细胞异体神经再血管化的实验研究

目的 观察化学去细胞异体神经移植修复大鼠坐骨神经缺损后再血管化的过程. 方法 成年雄性SD大鼠80只.取16只SD大鼠坐骨结节至胫、腓神经分叉处的坐骨神经干,制备去细胞神经移植物.取64只SD大鼠随机分为实验组及对照组,每组32只.制备大鼠有侧1.0cm坐骨神经缺损模型后,实验组采用去细胞神经移植物进行桥接修复;对照组采用自体神经原位桥接修复.观察大鼠术后一般情况,并于术后5、7、10、14、21、28d及2、3个月,取材行大体观察及ALP染色观察. 结果 两组大鼠切口均Ⅰ期愈合,术后两组大鼠出现右足拖行,足趾不能伸展,术后6周改善.大体观察见两组移植物均与两端神经连接良好,移植物外观与正常神经相似.术后5 d ALP染色观察,实验组移植物内无微血管长入,对照组移植物内可见微血管长入;7 d实验组移植物内可见微血管长入,但两组移植物中部均未见微血管;10 d、14 d及21d分别见少量纵行微血管贯穿两组移植物;28 d,两组移植物内微血管网未见明显差别;2个月和3个月两组移植物内微血管构筑与正常神经相似. 结论 化学去细胞同种异体神经移植修复周围神经缺损后,新生微血管能及时长入移植物内.     

灵长类去细胞神经的萃取制备及异体移植后早期神经再生观察

目的发展新的化学处理方法，清除灵长类周围神经中的细胞和髓鞘，降低其抗原性，萃取粗大和长段的去细胞神经移植物，并观察其同种异体移植的早期神经再生。方法以Triton X-100和脱氧胆酸钠溶液化学处理猴长段正中神经和坐骨神经。萃取的去细胞神经行普通组织学染色、免疫组化染色及透射电镜检查，观察其组织结构。以去细胞神经同种异体移植修复猴正中神经3．0cm和胫神经5、0cm缺损，术后3周和8周，通过大体观察、HE染色及免疫组化染色观察早期神经再生一结果细胞和髓鞘已被彻底清除，神经基底膜和雪旺细胞基底板层保留完好，去细胞神经成为空的神经基质管。移植术后8周轴突再生已通过远端吻合口，移植段再血管化及雪旺细胞增殖良好。结论该化学处理可萃取灵长类粗大和长段的去细胞神经，作为同种神经移植物不会被排斥吸收。     

改良化学去细胞同种异体神经制备方法的实验研究

[目的]改进去细胞异体神经化学萃取制备方法，制备出细胞及髓鞘去除完全、神经机构保存完好的去细胞异体神经移植物。[方法]SD大鼠14只，取双侧坐骨神经（共28根），分3组进行化学萃取去细胞处理：Son．dell法组（10根）、改良法组（10根）和对照组（8根）。Sondell法组所用萃取剂为TritonX-100和脱氧胆酸钠；改良法组所用萃取剂为TritonX-200、SB-10和SB-16；对照组未进行化学处理。处理后神经行HE染色、快蓝染色、基底膜素免疫组化染色及环境扫描电镜观察，并从去细胞程度、髓鞘染色分级和结构完整性三方面综合评价。[结果]在去细胞异体神经物理性状方面，改良法制备的去细胞异体神经韧性弹性略好于Sondell法；HE染色表明，2种方法的去细胞效果均较好，但改良法对神经结构的破坏较小；快蓝染色、基底膜素免疫组化染色、环境扫描电镜结果均表明，改良法在对髓鞘的去除、基底膜素的保留及神经结构的保存方面均优于Sondell法；综合质量评分结果表明，2种方法在去细胞效果方面相似（P1〉0．05），髓鞘去除及神经结构的保存方面改良法优于Sondell法（P2、P3〈0．05），综合去细胞程度、髓鞘染色分级和结构完整性3方面，改良法制备的去细胞异体神经质量优于Sondell法（p4〈0．05）。[结论]综合运用萃取剂TritonX-200、SB-10和sB-16的化学萃取方法，是一种较为理想的去细胞异体神经制备方法，能够制备出免疫物质清除完全、神经结构较好保存的去细胞异体神经移植物，为自体神经移植找到了较好的替代解决方法。     

采用多重标记物示踪化学去细胞异体神经修复大鼠面神经缺损

[目的]探索用荧光金、量子点、固蓝"三标"逆行示踪方法来评价化学去细胞异体神经移植修复大鼠面神经缺损后颊支、下颌缘支、颈支的再生及神经的物质运输功能。[方法]外科显微镜下解剖、分离出鼠的左侧颅外段面神经主干及各分支(颞支、颧支、颊支、下颌缘支、颈支),在出茎乳孔处离断面神经主干,分别在距该断点10 mm处离断5个分支,移植化学去细胞异体全面神经,术后2个月暴露面神经,在颊支、下颌缘支、颈支吻合口远端分别注射荧光金、量子点、固蓝,3 d后脑干取材,冰冻切片,并在荧光显微镜下观察脑干内3种示踪剂的分布情况。[结果]将发源于脑干的面神经核团进行冰冻切片,荧光显微镜下观察到被荧光金、量子点、固蓝标记的神经元分别显示出黄色、红色和蓝色。[结论]根据神经轴浆运输的原理,采用多种标记物示踪法评价异体神经移植修复面神经损伤后神经干及各分支连续性的恢复情况,操作简便,可靠易行,是一种理想的评价方法。     

脱细胞异体神经移植在周围神经缺损修复中的应用研究进展

目的介绍脱细胞异体神经移植在周围神经缺损修复中的应用研究进展。方法广泛查阅国内外相关文献,进行回顾,综合分析脱细胞方法的进展及脱细胞处理后的异体神经移植效果。结果相对于物理方法,化学脱细胞方法可有效降低移植神经的免疫原性,经过脱细胞处理后的异体神经移植后,效果良好。结论目前随着脱细胞异体神经移植长度的增加,神经再生效果逐渐降低,宿主雪旺细胞可能存在迁移极限,对长段脱细胞异体神经再细胞化或使用辅助手段提高雪旺细胞迁移能力,可望解决这一问题。     

优化法去细胞兔神经移植修复大鼠坐骨神经缺损

目的 以优化法去细胞兔臂丛神经，移植修复大鼠坐骨神经缺损，观察免疫排斥情况、早期功能恢复及神经再生情况。方法 以优化法处理新鲜取材的新西兰大白兔臂丛神经分支，移植修复成年sD大鼠坐骨神经1．0cm缺损，分别于术后1个月及3个月行功能评价、电生理和组织学检查，观察免疫排斥、功能恢复及神经再生情况。结果 实验组与自体神经移植组在免疫排斥、功能恢复及神经再生方面无显著差异，却明显优于新鲜兔神经移植组。3个月取材时的神经再生及功能恢复情况优于1个月取材时。结论 优化法去细胞神经在移植修复异种神经缺损时，可以达到免疫耐受，其早期功能恢复和神经再生情况良好，在修复周围神经缺损时有望作为自体神经移植的一种替代疗法。     

联合运用冻融法和化学法去细胞同种异体神经修复兔面神经缺损

目的：通过对去细胞同种异体神经处理方法的改进,找出一种修复兔面神经缺损的理想替代材料。方法：取24只兔子,将兔左侧面神经上颊支切断以造成面神经缺损1.0cm的模型,根据修复方法不同,随机分成2组：实验组为联合运用冻融法和化学法去细胞同种异体神经修复组,对照组为自体面神倒置修复组,每组12只。术后3个月行大体观察、神经电生理检测、有髓神经纤维计数以及电镜观察,采用SPSS17.0软件包对数据进行t检验,对面神经恢复情况进行综合评价。结果：两组兔子均存活,切口愈合良好,兔面形基本对称;实验组与对照组左侧面神经上颊支传导速度分别为（55.74±10.56）m/s及（61.34±9.72）m/s,差异无显著性（P〉0.05）;实验组与对照组移植体远端吻合口邻近4.0mm段有髓神经纤维数量分别为（18173.62±918.38）n/mm2及（18601.21±982.31）n/mm2,差异亦无显著性（P〉0.05）;电镜检查结果相似。结论：联合运用冻融法和化学法去细胞同种异体神经能满意修复一定长度的面神经缺损,可以作为自体神经的一种有效替代物。     

环孢素A对同种异体移植神经再生的影响

[目的]探讨环孢素A对新鲜和冷冻处理的同种异体神经移植中免疫排斥反应和神经再生的影响。[方法]以新鲜的和冷冻处理的同种异体神经移植修复大鼠10mm坐骨神经缺损，术后实验组应用环孢素A，4、8周后行电生理和组织学检查。[结果]新鲜的同种异体移植神经再生最差，而应用环孢素A则神经再生最好；冷冻处理的同种异体神经移植中，应用环孢素A的神经再生效果也优于未应用者。[结论]环孢素A应用于同种异体神经移植有利于神经的再生。     

化学去细胞异体神经促神经再生的体外实验研究

[目的]对大鼠化学去细胞异体神经蛋白成分进行电泳分析,观察去细胞异体神经中的蛋白组分;制备去细胞神经薄膜,接种背根神经节,观察其结构对神经生长的影响。[方法]按Sondell法制备大鼠的去细胞异体神经,将制备好的神经进行电泳分析,观察28～30 kDa区域的髓鞘蛋白的去除程度;将制备的神经进行冰冻切片,接种鸡胚背根神经,进行神经纤维荧光染色,观察神经纤维在神经切片上的生长方向。[结果]去细胞异体神经电泳结果显示:28～30 kDa区域髓鞘蛋白完全消失,化学萃取的去细胞神经可以完全去除髓鞘蛋白;背根神经节发出大量的神经纤维沿着去细胞神经基底膜管方向生长。[结论]去细胞异体神经中无残留引起免疫反应的髓鞘蛋白,保留的基底膜管结构对促神经纤维再生具有引导性作用。     

化学去细胞异体神经添加不同组织来源雪旺细胞对周围神经损伤修复的功能评价

目的构建不同组织来源雪旺细胞(Schwann cells,SCs)及化学去细胞异体神经(chemically extracted acellular nerve allograft,CEANA)移植物,比较其修复周围神经缺损的效果。方法 4周龄SD大鼠3只,体重80～120g,体外培养、扩增和鉴定BMSCs及脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)。体外诱导BMSCs和ADSCs分化为类雪旺细胞(dMSC,dADSC),并采用胶质细胞标记物p75和抗胶原纤维酸性蛋白(glial fi brillary acidic protein,GFAP)进行鉴定。取出生3d SD大鼠10只,体重6～8g,分离培养SCs。20只成年Wistar大鼠,体重200～250g,取双侧约20mm坐骨神经制备CEANA。40只成年雄性SD大鼠,制备左侧15mm坐骨神经缺损模型,根据神经缺损修复方法不同随机分为5组(n=8):A组,取自体坐骨神经翻转后吻合;B组,取15mm CEANA吻合后补充5×105个SCs;C组,取15mm CEANA吻合后补充5×105个dMSC;D组,取15mm CEANA吻合后补充5×105个dADSC;E组,取15mm CEANA吻合。术后12周行感觉和运动功能恢复评价及组织学评价。结果 BMSCs和ADSCs表面抗原标志为CD34-、CD45-、CD90+。经诱导后BMSCs和ADSCs形态变化与SCs相似,呈双极、星形结构,SCs标记物p75和GFAP均表达阳性。术后12周,A、B、C、D、E组肢体50%回缩阈值分别为(13.8±2.3)、(15.4±6.5)、(16.9±5.3)、(16.3±3.5)和(20.0±5.3)g,A组与E组比较差异有统计学意义(P0.01),B、C、D组间比较差异无统计学意义(P0.05)。A、B、C、D、E组小腿三头肌收缩力恢复率分别为87.0%±9.7%、70.0%±6.6%、69.0%±6.7%、65.0%±9.8%和45.0%±12.1%,A、B、C、D组与E组比较差异有统计学意义(P0.05)。各组远端吻合口神经坚牢蓝染色显示神经纤维排列整齐,无炎性反应。甲苯胺蓝染色和透射电镜观察显示,B、C、D组有髓神经纤维计数及有髓神经纤维髓鞘厚度均大于E组,差异均有统计学意义(P0.01);B组轴突直径大于C、D组,差异有统计学意义(P0.05)。结论 CEANA补充dADSC修复周围神经缺损与补充dMSC和SCs具有类似的修复效果。dADSC来源广泛,可作为组织工程神经理想的种子细胞,在复合CEANA修复周围神经缺损发挥重要作用。