MMP-2反义寡脱氧核苷酸对人膀胱癌 BIU-87细胞株侵袭能力影响的初步研究

目的应用反义核酸技术,探讨阳离子脂质体介导的MMP-2反义寡脱氧核苷酸对膀胱癌细胞侵袭能力的影响。方法人工设计合成一段硫代修饰型互补于MMP-2的反义寡脱氧核苷酸序列(antisenes oligodeoxynucleotide,ASODN),并设计与其碱基组成相同,但碱基顺序随机排列的无义寡脱氧核苷酸序列(nonsense oligodeoxynucleotide,NS-ODN)作为对照。以阳离子脂质体介导将不同浓度的ASODN及NS-ODN转染至膀胱癌细胞系BIU-87细胞中,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测转染前后BI-U-87细胞中MMP-2mRNA表达;以四甲基偶氮唑蓝(MTT)试验检测细胞的增殖能力;采用MTT比色法与transwell小室侵袭试验相结合的方法测定肿瘤细胞的体外侵袭力。结果转染MMP-2ASODN可以显著降低BIU-87细胞中的MMP-2mRNA表达。MMP-2ASODN处理细胞24h,于1.0μmol/L的MMP-2ASODN浓度条件下即可显著抑制BIU-87细胞的体外侵袭,而且这种抑制作用随ASODN浓度的增加而增强。结论以MMP-2反义寡脱氧核苷酸阻遏MMP-2在膀胱癌BIU-87细胞株中表达可以成功地抑制BI-U-87细胞侵袭能力,提示应用反义核酸技术等方法抑制MMP-2活性可能可以应用于临床治疗膀胱癌。     

阳离子脂质体介导提高反义寡聚脱氧核苷酸转染卵巢癌细胞株SKOV3／mdr1的效率

多药耐药基因（MDRI）编码的P－糖蛋白（Pgp,P-170)是导致卵巢癌化疗失败的重要原因之一。本研究将针对MDR1基因的硫代反义寡聚脱氧核苷酸导入卵巢癌耐药细胞株SKOV3．mdr1,观察其对该细胞株P170表达的影响。反义寡聚脱氧核苷酸（MDR1－AS）通过阳离子脂质体介导或单纯转染的方式导入SKOV3／mdr1细胞,将正义寡聚脱氧核苷酸（MDR1－S）同样导入细胞为对照。经以旨质体介导的1．6μmol/LMDR1-AS转染后,Pgp阳性的细胞百分数从100％降至48．7％,经过16μmol/L和10μmol/L两个浓度的单纯MDR1－AS转当柏,Pgp阳性细胞的百分数也从100％分别降至52．6％和86．7％,因此,通过阳离子脂质体介导可大大提高反义寡核苷酸转染的效率。     

原位杂交技术检测增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸对BIU—87细胞体外增殖的影响

运用原位杂交技术检测脂质体介导增殖细胞核抗原（PCNA）反义寡脱氧苷酸抑制人膀胱癌细胞BIU－87 PCNA mRNA的表达水平。结果表明脂质体介导PCNA反义寡脱氧核苷酸处理组中BIU－87细胞PCNA mRNA的表达水平明显低于对照组。结果提示脂质体介导PCNA反义寡脱氧核苷酸可抑制人膀胱癌细胞BIU－87体外增殖活性,其抑制作用可通过阻断PCNA蛋白表达来实现。     

反义寡核苷酸对鼻咽癌细胞端粒酶活性的抑制

目的：检测针对端粒酶的反义寡核苷酸（AS－ODN）对鼻咽癌HNE－1细胞株端粒酶活性的影响。方法：用PCR－ELISA法检测细胞内端粒酶活性。结果：鼻咽癌细胞株HNE－1与5μmol/L，20μmol/L反义寡核苷酸共同孵育1d，对其端粒酶活性抑制率分别为32．9％，61．6％。而同浓度正义寡核苷酸（S－ODNA）对细胞端粒酶活性无抑制作用。结论：该反义寡核苷酸可抑制鼻咽癌细胞端粒酶活性，此作用有序列特异性和浓度依赖性。     

原位杂交技术检测增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸对BIU-87细胞体外增殖的影响

运用原位杂交技术检测脂质体介导增殖细胞核抗原(PCNA)反义寡脱氧核苷酸抑制人膀胱癌细胞BIU-87PCNA mRNA的表达水平.结果表明脂质体介导PCNA反义寡脱氧核苷酸处理组中BIU-87细胞PCNA mRNA的表达水平明显低于对照组.结果提示脂质体介导PCNA反义寡脱氧核苷酸可抑制人膀胱癌细胞BIU-87体外增殖活性,其抑制作用可通过阻断PCNA蛋白表达来实现.     

硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸对乙型肝炎病毒细胞的影响

目的探讨硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸对乙型肝炎病毒细胞的影响。方法设计合成HBV5个硫代反义寡聚核苷酸(S-as ODN)靶序列。应用ELISA方法、MTT比色法、观察S-as ODN对HBsAg、HBeAg抗原表达及Hep G22215细胞毒性的影响。结果不同靶位点的S-as ODN对HBsAg、HBeAg表达都有显著的抑制作用,在浓度为20μmol／L时,对细胞无明显杀伤作用。结论S-as ODN对Hep G22215的HBsAg、HBeAg的抑制作用为抗HBV治疗提供了新的途径。     

阳离子脂质体介导提高反义寡聚脱氧核苷酸转染卵巢癌细胞株SKOV3/mdr1的效率

多药耐药基因(MDR1)编码的P-糖蛋白(Pgp,P-170)是导致卵巢癌化疗失败的重要原因之一.本研究将针对MDR1基因的硫代反义寡聚脱氧核苷酸导入卵巢癌耐药细胞株SKOV3/mdr1,观察其对该细胞株P170表达的影响.反义寡聚脱氧核苷酸(MDR1-AS)通过阳离子脂质体介导或单纯转染的方式导入SKOV3/mdr1细胞,将正义寡聚脱氧核苷酸(MDR1-S)同样导入细胞为对照.经以脂质体介导的1.6μmol/LMDR1-AS转染后,PgP阳性的细胞百分数从100%降至48.7%,经过16μmol/L和10μmol/L两个浓度的单纯MDR1-AS转染后,Pgp阳性细胞的百分数也从100%分别降至52.6%和86.7%.因此,通过阳离子脂质体介导可大大提高反义寡核苷酸转染的效率.     

NF-κB圈套寡脱氧核苷酸联合紫杉醇对肺癌血管生成的影响

目的 探讨NF-κB圈套寡脱氧核苷酸技术（NF-κB decoy ODN ）联合紫杉醇对肺癌血管生成的影响。 方法 培养人肺癌细胞A549:⑴用脂质体瞬时转染法介导NF-κB全硫代圈套寡核苷酸(decoy ODN)和全硫代错义圈套寡核苷酸(scramble decoy ODN)处理A549 细胞;⑵分为对照组、NF-κB decoy ODN组、紫杉醇组(1 000 ng/mL)和NF-κBdecoy ODN +紫杉醇组,RT-PCR法测COX-2mRNA水平表达;⑶免疫组织化学法测VEGF蛋白表达。 结果 ⑴NF-κB decoy ODN、紫杉醇干预后A549细胞的COX-2 mRNA水平表达下降,各组浓度分别是：0.71、0.44、2.51、0.34μg/μL（F＝7.8,P＜0.05）。⑵NF-κB decoy ODN、紫杉醇干预后A549细胞的VEGF蛋白表达下降,各组细胞阳性率分别是：85%、63%、57%、21%（F＝21,P＜0.05）, 结论 NF-κB decoy ODN 联合紫杉醇可明显抑制肺癌细胞血管生成,该作用可能与COX-2、VEGF 表达相关。     

PKC-α反义核酸对宫颈癌HeLa细胞增殖及细胞周期的影响

目的 :探讨 PKC-α反义核酸对 He L a细胞增殖及细胞周期的影响。方法 :采用脂质体 (L P)介导法 ,用 0 .0 1～1.0 0μmol/L各浓度 PKC-α反义核酸 (as ODN)转染 He L a细胞 ;MTT法及软琼脂克隆形成法分别检测 He L a细胞生长指数 (growth index,GI)及其体外增殖能力 ;流式细胞术分析细胞周期。结果 :PKC- α as ODN0 .0 5～ 1.0 0 μmol/L 各浓度组 He L a细胞 GI显著降低 (P<0 .0 5 ) ,且呈量效依赖关系 ;其中 1.0 0μmol/L和 0 .5 0μm ol/L PKC-α as ODN对He L a细胞生长有非常显著抑制作用 (P<0 .0 1) ;0 .5 0 μmol/L PKC- α as ODN组 He L a细胞软琼脂克隆形成率均低于对照组 (P<0 .0 5 ) ;反义 PKC- α使细胞 G2 期百分比增高 (P<0 .0 1)。结论 :反义 PKC- α可通过阻滞细胞于 G2 期从而抑制 He L a细胞的生长。     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人胃癌细胞株SGC7901凋亡的影响

目的：探讨乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人胃癌细胞株SGC7901凋亡的影响．．方法：采用脂质体介导乙酰肝素酶反义寡核苷酸转染人胃癌细胞株SGC7901细胞,以逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后乙酰肝素酶mRNA、Fas mRNA和Bcl-2 mRNA表达的变化,采用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果：脂质体介导转染乙酰肝素酶反义寡核苷酸后,SGC7901胃癌细胞内乙酰肝素酶mRNA和Bcl-2 mRNA表达下降,FasmRNA表达上升,凋亡细胞比率由转染前的4．04％增加至转染后的16．00％。结论：转染后的乙酰肝素酶反义寡核苷酸可有效地诱导胃癌细胞发生凋亡。     

Heparanase antisense oligodeoxynucleotide inhibits angiogenesis and metastasis of human mammary carcinoma cell xenografts in nude mice

Objective： To evaluate the inhibitory effect of heparanase antisense oligodeoxynucleotide （AS-ODN） on the angiogenesis and metastasis of human mammary carcinoma cell xenografts in nude mice. Methods： The AS-ODN complementary to the start codon region of heparanase mRNA and its control, scrambled nonsense oligodeoxynucleotide （NS-ODN） were designed and synthesized. A subcutaneous growth model and an acute hematogenous metastasis model of human mammary carcinoma were established in nude mice and were treated with ODNs. The heparanase expression in tumor was evaluated by RT-PCR and Western blot. The microvessel density （MVD） was measured by immunohistochemistry for factor VS. The tumor volume was calculated and lung metastatic nodules were counted. Results ： The heparanase expression, MVD, tumor volume and lung metastatic nodules in AS-ODN treated group were significantly decreased compared with that in NS-ODN treated group and that in PBS group （P〈0.01）. Conclusion ： Heparanase AS-ODN has significant inhibitory effect on the angiogenesis and metastasis of human mammary carcinoma cell xenografts in nude mice.     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对SGC-7901细胞MMP-2和TIMP-2表达的影响 Ⅰ.乙酰肝素酶反义寡核苷酸对SGC-7901细胞MMP-2和TMP-2表达的影响

目的:探讨乙酰肝素酶(HPA)反义寡脱氧核苷酸(AS-OND)对人胃癌细胞株SGC-7901细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及组织金属蛋白酶抑制剂-2(TIMP-2)表达的影响。方法:采用脂质体介导法将HPAAS-ODN转染SGC-7901细胞G用RT-PCR检测HPA-mRNA表达,用免疫细胞化学的方法检测细胞内MMP-2和TIMP-2的变化。结果:AS-ODN转染48h后GSGC-7901细胞内HPA-mRNA表达下降(P<0.01),MMP-2的表达量亦减少(P<0.01)。结论:HPAAS-ODN可以有效地抑制胃癌细胞MMP-2的表达。     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡的实验研究

目的：探讨乙酰肝素酶(HPA)反义寡脱氧核苷酸(AS-ODN)对人胃癌细胞株SGC-7901细胞凋亡的影响及其作用机制。方法：设计合成HPAAS-ODN．用脂质体介导法转染SGC-7901细胞,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染前后细胞HPA-mRNA及p53、bcl-2基因的表达;用倒置相差显微镜及扫描电镜观察转染前后细胞的形态学变化;用DNA末端原位标记染色法(TUNEL)检测转染前后细胞的凋亡指数;用流式细胞仪检测转染前后细胞凋亡率的变化。结果：HPAAS-ODN转染后,SGC-7901细胞内HPA-mRNA表达下降,p53的表达量升高,bcl-2的表达量降低;细胞凋亡指数和凋亡率升高;出现了典型的凋亡细胞的形态学变化。结论：HPAAS-ODN可有效地抑制胃癌细胞HPA mRNA的表达：并通过下调bcl-2,上调p53的表达,诱导胃癌细胞凋亡。     

低氧时反义寡核苷酸对胰腺癌乙酰肝素酶表达及侵袭力的影响

目的 研究低氧对胰腺癌乙酰肝素酶（Hpa）表达的影响及与肿瘤细胞侵袭力的关系.方法 体外低氧培养细胞,观察低氧在不同时间胰腺导管癌细胞株BxPC-3细胞Hpa mRNA和蛋白表达的变化;以Tranwell侵袭小室实验观察低氧及应用反义寡核苷酸（AS-ODN）阻断Hpa表达后肿瘤细胞侵袭力的变化,明确低氧促进肿瘤细胞侵袭力增加是否与Hpa有关.结果 在常氧条件下,BxPC-3细胞Hpa mRNA和蛋白即有低量表达.在低氧条件下,Hpa mRNA和蛋白表达在3 h受到轻度抑制,在6 h、12 h、24 h和48 h表达明显升高,且mRNA和蛋白的表达水平一致.预先以Hpa AS-ODN序列阻断Hpa的表达,则低氧不能诱导Hpa mRNA和蛋白表达上调.低氧使穿过Transwell小室的BxPC-3细胞数量增加了96.2%（P〈0.01）,Hpa AS-ODN（400 nmol/L）对低氧诱导的侵袭细胞的抑制率为37.2%,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 低氧可通过上调胰腺癌BxPC-3细胞Hpa mRNA和蛋白的表达,提高肿瘤细胞侵袭力.     

环氧合酶2反义寡核苷酸对胰腺癌新生血管生成的抑制作用

目的 研究环氧合酶-2反义寡核苷酸（COX-2 AS-ODN）对胰腺癌新生血管生成的抑制作用,探讨前列腺素E2（PGE2）在胰腺癌新生血管生成中的调节作用。方法 设计、合成特异性靶向COX-2 AS-ODN。人胰腺癌PC-3细胞进行体外培养,转染COX-2 AS-ODN后0、12、24、40和72h以荧光显微镜观察细胞情况。第二批PC-3细胞用于研究量-效关系,分为5组：对照组、Lipo组（接种Lopofectin脂质体）、C1组（1μg COX-2 AS-ODN Lipo/孔）。第三批PC-3细胞用于研究时-效关系,接种3μg COX-2 AS-ODN Lipo/孔后观察0、12、24、48和72h。用RT-PCR观察COX-2 mRNA的表达。以Western印迹观察分别加入3μg和9μg COX-2 AS-ODN/瓶后PC-3细胞COX-2蛋白质的表达。18只鸡胚分3组,其绒毛尿囊（CAM）分别接种PC-3细胞以及Lipo、Lipo COX-2 AS-ODN、Lipo COX-2 AS-ODN 前列腺素E2（PGE2）,另6只鸡胚仅接种PC3细胞用作对照。用Leica体视显微镜观察新生血管生成情况。结果 RT-PCR示随转染COX-2 AS-ODN浓度的增加,PC3细胞的COX-2 mRNA表达逐渐下调（直到COX-2 AS-ODN浓度为0.2μmol/L时）。COX-2 AS-ODN的作用于12h后最强,以后渐弱,48h后基本消失。Western印迹表明COX-2 AS-ODN转染组的COX-2蛋白质表达受抑制,9μg COX-2 AS-ODN/瓶组的抑制强于3μg COX-2 AS-ODN/瓶组。Lipo COX-2 AS-ODN组鸡胚CAM移植肿瘤中的新生血管生成密度明显低于Lipo组;Lipo COX-2 AS-ODN PGE2组的新生血管密度介于以上两组之间。结论 COX-2 AS-ODN显著抑制胰腺癌新生血管的生成。内源性COX-2参与对胰腺癌新生血管生成的调节,PGE2在该过程中起重要的介导作用。     

Transfection of Antisense Oligodeoxynucleotide Inhibits Heparanase Gene Expression and Invasive Ability of Human Pancreatic Cancer Cell in vitro

Cancer cell invasion and metastasis are criticalsteps in pancreatic cancer progression that worsenthe prognosis.They are facilitated via disassemblyof the main structural elements of basement mem-branes(BM)and extracellular matrix(ECM)byenzymes produced by the cancer cells[1].Hepara-nase(HPSE)is an endoglycosidase responsible forthe degradation of the heparan sulfate proteoglycan(HSPG),a major component of ECM and BM.HPSE mediates tumor invasion pri marily throughthe direct cleavage of…     

Targeted silencing of heparanase gene by small interfering RNA inhibits invasiveness and metastasis of osteosarcoma cells

The effects of targeted silencing of heparanase gene by small interfering RNA(siRNA) on invasiveness and metastasis of osteosarcoma cells(MG63 cells) were investigated in the present study.Two complementary oligonucleotide strands were synthesized and inserted into pGenesil-1 vector based on the mRNA sequence of heparanase gene.The expression vector containing short hairpin RNA(pGenesil-shRNA) was constructed successfully.MG63 cells were randomly allocated into 3 groups:blank group,empty vector(pGenesil) transfected group and expression vector(pGenesil-shRNA) transfected group.Under the induction of Lipofectamine 2000,the recombinants were transfected into MG63 cells.Heparanase gene expression level was detected by RT-PCR and Western blotting.Cell prolifera-tion was measured by MTT assay.Cell invasiveness and metastasis were examined by cell adhesion and Transwell-ECM assays.HUVECs migration assay was applied for the detection of angiogenesis.As compared with negative controls,the mRNA and protein expression levels of heparanase were down-regulated by 76.1%(P<0.01) and 75.3%(P<0.01) respectively in the pGenesil-shRNA transfected group.Meanwhile,the proliferation,adhesiveness,invasiveness and angiogenesis properties of MG63 cells were all significantly inhibited.It was suggested that targeted silencing of heparanase gene by siRNA could dramatically inhibit the invasiveness and metastasis of osteosarcoma cells.     

小干扰RNA抑制胃癌细胞肝素酶表达及侵袭的实验研究

目的 利用RNA干扰（RNAi）技术封闭胃癌细胞系SGC7901肝素酶表达,观察其对肿瘤细胞侵袭能力的影响。方法 体外转录合成小干扰RNA（siRNA）,经脂质体转染胃癌细胞系;结合逆转录（RT）-PCR,Western印迹检测类肝素酶mRNA及蛋白质表达;通过体外侵袭实验评价肝素酶RNAi后胃癌细胞系的侵袭能力变化。结果 肝素酶siRNA分子可以特异性地抑制SGC7901细胞肝素酶mRNA,抑制率达（70±6）％;肝素酶RNAi后SGC7901细胞的侵袭抑制率达（61±36）％。结论 靶向肝素酶基因的siRNA分子能特异性抑制其蛋白表达水平,降低肿瘤细胞的侵袭能力。肝素酶是促进胃癌细胞侵袭转移的关键分子,并可为抑制胃癌侵袭转移提供新策略。     

Inhibition of PCNA Antisense Oligonucleotides Mediated by Liposome on mRNA Expression and Proliferation of h-RPE Cells

Pro1iferative vitreoretinopathy (PVR), as a blind- ness-causing condition, is a common complication of retina detachment and the main reason that leads to the failure of recovery operation of retina detachment. PVR is essentially an intraocular reactive course of wound healing and principally relevant to pathological prolifera- tion of retina pigment epithelia (RPE). Proliferating cell nuclear antigen (PCNA), expressed in many proliferative tissues, play an important role in the cell cycle…     

Par-4反义寡核苷酸拮抗谷氨酸对PC12细胞中ERK1/2的下调作用及其抗凋亡作用

目的研究par-4反义寡核苷酸拮抗谷氨酸对PC12细胞中ERK1/2活性的下调作用及其抗凋亡作用.方法利用脂质体将par-4反义寡核苷酸转染入PC12细胞.谷氨酸诱导PC12细胞凋亡.利用吖啶橙/溴化乙锭荧光染色观察PC12细胞形态,流式细胞分析评价凋亡百分率.Western印迹测定par-4的蛋白质表达量和磷酸化的ERK1/2的蛋白表达量. 结果 (1)谷氨酸诱导PC12细胞中par-4蛋白表达上调,Par-4反义寡核苷酸呈剂量依赖性地拮抗其上调(组间比较,P<0.01).(2)谷氨酸诱导PC12细胞中磷酸化(Thr202/Tyr204)的ERK1/2蛋白水平下调,par-4反义寡核苷酸拮抗其上调(组间比较,P<0.01).(3)Par-4反义寡核苷酸拮抗谷氨酸诱导的PC12细胞凋亡,如予ERK1/2阻断PD98059预处理,则其拮抗作用被下调(组间比较,P<0.05).结论 Par-4反义寡核苷酸拮抗谷氨酸诱导的PC12细胞凋亡,其机制可能与ERK1/2的活化有关.