腺病毒介导RNA干扰抑制人结肠癌VEGF受体表达及肿瘤生长

目的:观察腺病毒介导的RNA干扰抑制人结肠癌中血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)表达及肿瘤生长的作用.方法:将RNA干扰pAd-Easy/VEGFR腺病毒载体用Lipofectamine 2000转染293细胞,制备携带人VEGFR的腺病毒,转染CW2细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察转染效率,通过RT-PCR和蛋白质印迹法检测VEGFR mRNA的表达;以MTT比色法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线.同时,制备裸鼠CW2细胞移植瘤模型,注射腺病毒后,每天观察肿瘤生长情况.应用免疫组化法检测微血管密度(MVD).结果:pAd-Easy/VEGFR重组腺病毒成功构建,转染效率为99.7%.RT-PCR、 Western印迹实验结果显示转染pAd-Easy/VEGFR后,VEGFR的表达明显被抑制.细胞生长曲线表明,重组载体转染后细胞生长明显减缓.体内实验表明,pAd-Easy/VEGFR治疗后肿瘤生长慢并伴有较低的MVD.结论:pAd-Easy/VEGFR介导的VEGFR shRNA能有效抑制CW2细胞中VEGFR的表达,并能抑制肿瘤生长.     

RNA干扰血管内皮生长因子受体表达对人肺腺癌细胞的抑制作用

目的:观察人血管内皮生长因子受体(VEGFR)RNA干扰重组腺病毒(Ad-VEGFRshRNA)对人肺腺癌细胞株A549生长的抑制作用.方法:制备携带人VEGFR的RNA干扰重组腺病毒,转染A549细胞,通过荧光显微镜观察转染效率.应用Western印迹法检测A549细胞VEGFR蛋白的表达,MTT比色法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线,细胞周期及集落形成试验测定细胞生长抑制情况.同时,制备裸鼠A549细胞移植瘤模型,观察肿瘤生长情况.结果:Western印迹法显示RNA干扰组VEGFR表达水平明显降低;细胞生长曲线表明,RNA干扰后细胞生长明显减缓;细胞周期及集落形成试验提示RNA干扰后肿瘤细胞生长受到明显抑制.裸鼠皮下移植瘤生长情况提示RNA干扰可以显著抑制肿瘤生长.结论:RNA干扰重组腺病毒Ad-VEGFRshRNA能有效抑制A549细胞中VEGFR的表达,并能抑制肿瘤生长.     

人alpha防御素1真核表达载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的:观察重组人alpha防御素1(HNP1)真核表达质粒对体外培养人肺腺癌细胞A549增殖的影响.方法:从人外周血白细胞中提取总RNA,通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)得到人HNP1成熟肽基因片断.构建pSecTag-HNP1重组质粒,转染A549细胞,并设pSecTag转染组、脂质体转染组和未转染组作为对照.RT-PCR验证HNP1的表达,MTT法检测肿瘤细胞的生长情况,流式细胞仪及PI染色检测细胞凋亡情况.结果:构建了重组质粒pSecTag-HNP1,测序正确.转染A549细胞后,RT-PCR成功扩增出HNP1片断.与其他3组相比,HNP1转染A549细胞48 h后细胞的生存率降低,差异有统计学意义(P均<0.05).流式细胞仪及PI染色结果显示pSecTag-HNP1转染后的细胞凋亡增多(P<0.05).结论:转染pSecTag-HNP1后,重组HNP1能够在A549细胞中表达并有效地抑制A549细胞的增殖,促进细胞凋亡.     

肺腺癌细胞A549 hnRNP B1基因RNA干扰的体外研究

目的 体外研究特异的小干扰RNA(siRNA)对肺腺癌细胞A549 hnRNP B1 基因表达及生长的抑制作用. 方法设计和构建由H1启动子驱动产生的特异的hnRNP B1 siRNA 表达质粒,转染至A549细胞,荧光定量PCR法及Western blot检测hnRNP B1基因的表达,MTT法检测该表达质粒转染后对A549细胞生长的影响.结果 针对hnRNP B1 基因构建的重组质粒具有明显的干扰效果,受特异hnRNP B1 siRNA 干扰的A549细胞hnRNP B1 mRNA及蛋白表达下调,细胞生长受到抑制.结论 应用RNA干扰技术可阻止hnRNP B1基因的表达,有望成为肿瘤基因治疗新的研究方向.     

大鼠shRNA-TRPC4重组腺病毒载体的构建及其在EPCs中转染效率的测定

目的 构建大鼠shRNA-TRPC4重组腺病毒载体并观察其在大鼠内皮祖细胞(EPCs)中的转染效率.方法 针对大鼠TRPC4序列设计4个RNA干扰靶点序列并合成双链DNA oligo,连接入干扰载体后转入大肠杆菌感受态细胞,培养后挑取转化子进行PCR鉴定及测序比对.利用Admax包装系统获得重组腺病毒Ad-shRNA-TRPC4小量扩增并测定病毒滴度,检测重组腺病毒对TRPC4表达的影响,最后将获得的重组腺病毒转染EPCs,在荧光显微镜下观察并用流式细胞仪测定其转染效率.结果 4组干扰质粒经培养后的转化子中均有阳性克隆,且阳性克隆与设计的干扰靶点序列一致;4组目的质粒均可抑制TRPC4蛋白的表达,合成的Ad-shRNA-TRPC4病毒滴度为5×1010 ifu/mL;倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测重组腺病毒在大鼠EPCs的转染效率分别为(85.47±2.05)％和(67.27±2.94)％.结论 本实验成功构建Ad-shRNA-TRPC4载体,其在EPCs的转染效率高.     

人IL-24基因重组腺病毒的构建及其在A549细胞中的表达

目的构建含有人IL-24基因的重组腺病毒载体,并转染肺腺癌细胞A549细胞观察其感染能力,为进一步的基因治疗奠定实验基础.方法采用基因工程技术将人IL-24基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用PAdEasy系统进行细菌内同源重组,后通过脂质体将正确重组体包裹并转染293T细胞以包装并扩增病毒.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定, 利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检定;最后采用免疫组化法对IL-24在A549中的表达进行检测.结果酶切和PCR结果证实IL-24基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.2×1010 pfu/ml,能够成功转染A549细胞并在其中进行表达.结论成功构建了有较强感染能力的含人IL-24基因的重组腺病毒载体.     

人分化抑制因子3基因靶向微小分子RNA表达载体的构建及筛选

目的人分化抑制因子3(inhibitor of differentination 3,Id3)基因在A549细胞中的外源性表达能抑制细胞生长并诱导细胞凋亡。文中旨在构建靶向人Id3基因的微小分子RNA(miRNA)表达载体,观察miRNA对A549细胞中Id3表达的下调作用,为进一步探讨Id3基因在A549细胞生长调控中的作用机制提供一定实验依据。方法依据miRNA设计原则,针对人Id3基因的mRNA序列,设计并合成编码miRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆至pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体中,构建含靶向人Id3基因的miRNA表达质粒(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Id3),DNA测序验证后,采用Lipofectamine2000TM脂质体转染技术将该质粒导入A549细胞。荧光倒置显微镜下观察miRNA干扰质粒转染A549细胞后EGFP的表达情况,应用RT-PCR和Western blot方法分别检测miRNA干扰后Id3mRNA及蛋白水平的表达。结果DNA测序表明重组质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Id3构建正确,将其成功导入A549...     

RNA干扰真核表达载体pEGFP-H1介导的血管内皮生长因子shRNA治疗人胶质瘤的实验研究

目的　构建针对血管内皮生长因子(VEGF)的短发夹环RNA(shRNA)质粒(pEGFPH1 /VEGF),观察其在体内和体外对胶质瘤细胞株U251生长的抑制作用。方法　应用PCR构建携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的RNA干扰真核表达载体pEGFP- H1,并利用该载体介导VEGFshRNA。用阳离子脂质体转染U251细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察EGFP的表达,用RT- PCR检测VEGFmRNA的表达,以酶联免疫吸附实验(ELISA)检测培养液中VEGF蛋白的含量。同时筛选转染pEGFP- H1和pEGFP- H1 /VEGF的U251稳定细胞株,制备裸鼠U251细胞移植瘤模型,观察肿瘤生长情况。结果　与空载体转染组相比, pEGFP- H1 /VEGF对VEGF的抑制率达77. 9%。对照组和pEGFP -H1组裸鼠肿瘤重量分别为1 .7g±0 4g和1 .5g±0 .7g,体积分别为1573mm3 ±330mm3 和1430mm3 ±382mm3,两组之间重量和体积差异均无统计学意义(P>0 .05 ),而pEGFP- H1 /VEGF组肿瘤重量为0 .5g±0 .4g,体积为401mm3 ±272mm3,与对照组比较差异有统计学意义(P<0. 01)。结论　pEGFP H1介导的VEGFshRNA能有效抑制U251细胞中VEGF的表达,并在体内抑制肿瘤生长。     

复制缺陷型人TPO重组腺病毒的构建与鉴定

目的:构建并鉴定携带人TPO基因的复制缺陷型重组腺病毒.方法:将含全部编码序列的人TPOcDNA克隆于腺病毒载体穿梭质粒pCA3的CMV启动子下游,然后与含有腺病毒基因组的质粒pBHG10共转染293细胞,经同源重组产生人TPO重组腺病毒(AdCMVTPO);体外转染A549细胞并检测其表达活性.结果:扩增后获得的病毒滴度达4.5×109pfu/ml,经体外转染A549细胞检测到TPO的表达.结论:所构建的重组腺病毒能有效介导人TPO基因的转移,可望用于造血功能重建的基因治疗研究.     

siRNA干扰沉默bFGF基因对肺腺癌A549增殖和凋亡的影响

目的利用小分子RNA干扰沉默碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因的表达,探讨其对肺腺癌A549细胞Oct-4表达、细胞增殖和凋亡的影响。方法将A549细胞分为转染干扰质粒组(干扰质粒组)、转染阴性对照质粒组(阴性对照组)和未转染质粒组(空白对照组)。采用Real-Time PCR检测质粒干扰后A549细胞bFGF基因mRNA表达的变化;Western Blot检测Oct-4蛋白表达的变化;CCK-8比色分析法绘制生长曲线观察细胞增殖能力变化及Annexin-V-PI双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果 Real-Time PCR结果显示质粒干扰后A549细胞中bFGFmRNA表达下降(P<0.01);Western Blot显示干扰组A549细胞Oct-4蛋白表达下降(P<0.01);生长曲线结果显示干扰质粒组细胞增殖活力下降明显(第2～4天P<0.0 5,第6～7天P<0.01);流式细胞仪检测凋亡结果显示细胞凋亡增加(P<0.0 5)。结论靶向bFGF基因的小分子RNA可以抑制bFGF表达;bFGF基因被抑制后下调Oct-4表达,细胞凋亡增加,增殖能力下降。     

Knocking-down of Nogo-A Gene Expression in PC12 Cell Line by Plasmid-based RNAi

To study the inhibitory effect of Nogo-A shRNA on cell line PC12, the Nogo-A shRNA （short hairpin RNA, or shRNA） was designed and synthesized. The annealed shRNA template was inserted into plasmid pGenesil-1 containing enhanced green fluorescent protein （EGFP） gene by gene cloning technique to generate eukaryotic expression vector. The recombinant plasmid was transfected into PC12 cells by lipofecamine2000 and the mRNA and protein expression level of Nogo-A gene was detected by RT-PCR and Western blotting 48 h after the transfection. Gene sequencing showed that that the Nogo-A shRNA eukaryotic expression vector was successfully constructed. No significant change was found in the Nogo-A mRNA and protein expression level in empty vector-transfected group as compared with controls （P〉0.05）, while the expression level in shRNA-transfected group decreased significantly （P〈0.05）. It is concluded that the pGenesil-1/Nogo-AshRNA recombinant plasmid can effectively suppress the expression of Nogo-A gene in PC12 cells.     

大鼠STAT3特异性shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的在已经成功构建4个针对STAT3的shRNA质粒表达载体的基础上,筛选出干扰效果最佳者进行慢病毒包装并鉴定。方法将STAT3的干扰质粒shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4及Control1(空载体对照),Control2(无效shRNA对照)分别转染目的细胞(大鼠肾小球系膜细胞),48h后收集细胞提取mRNA,以RT-PCR检测各组分STAT3表达量。对于筛选所得干扰效果最佳的质粒,采用pPACKH1TM慢病毒载体系统进行病毒包装。利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对感染效率及病毒滴度进行检测。结果 RT-PCR检测结果显示,shRNA3样品受干扰的效果最佳。成功构建了慢病毒载体Lenti-shRNA3,共转染293T细胞24h、48h,荧光显微镜下可见强绿色荧光,细胞生长状态良好,表明病毒包装成功。转染HT1080细胞,收集慢病毒液,测定病毒滴度为3.34×108ifu/ml,适合感染目的细胞。结论成功构建了STAT3基因的shRNA慢病毒表达载体,为进一步应用奠定了基础。     

ODDD调控EGFP基因的乏氧特异表达载体的构建及其意义

［摘 要］ 目的：构建乏氧诱导因子的氧依赖降解结构域（ODDD）调控的乏氧特异性表达荧光报告载体,探索其乏氧调控目的基因表达的可行性。方法：基因重组技术构建含有序列ODDD403-601aa、ODDD549-575aa和其2串联体调控增强型绿色荧光蛋白(EGFP)荧光报告载体。φA细胞中瞬时表达EGFP,应用RT-PCR技术、Western blotting技术和流式细胞术检测ODDD调控EGFP乏氧特异性表达。结果：克隆得到了ODDD/EGFP表达载体,进行细胞转染实验,在细胞中成功表达EGFP。Western blotting检测,ODDD可以调控EGFP乏氧特异性表达。流式细胞术检测,正常氧浓度下细胞转染pEGFP-ODDD401-603、pEGFP-ODDD549-575和pEGFP-ODDD2(549-575)EGFP的荧光强度分别为（6.06±1.97）％、（11.99±1.13）％和（23.16±2.79）％,低于缺氧条件下EGFP的表达量(P<0.05)。结论：ODDD对靶基因对氧的反应性调节受细胞内的蛋白酶影响;ODDD的调控作用发生在翻译后的蛋白水平,且与细胞内蛋白酶系统功能密切相关。     

ASIC3-shRNA干扰慢病毒质粒的构建及其效率的鉴定

目的: 构建酸敏感离子通道3(acid sensing ion channels 3, ASIC3)干扰慢病毒质粒并进行效率鉴定。方法: 利用GenBank获取ASIC3基因序列并合成相应干扰序列,通过T4 DNA连接酶将ASIC3基因片段连接至环状Plko.1 Puro载体,将重组质粒转染293T细胞获取慢病毒,用实时荧光定量PCR(qRT PCR)检测病毒滴度;将包装之后的慢病毒感染PC12、BV2、N2a细胞,分别分为ASIC3 shRNA组和EGFP shRNA组(阴性对照),经慢病毒感染后用qRT PCR和免疫印迹技术分别检测ASIC3 mRNA和蛋白表达。结果： 合成的ASIC3干扰序列成功连接至Plko.1 Puro载体;qRT PCR及DNA测序鉴定结果证实,ASIC3 shRNA质粒构建成功;qRT PCR与免疫印迹结果表明,在PC12、BV2、N2a细胞中,与EGFP shRNA组相比,ASIC3 shRNA组ASIC3 mRNA和蛋白表达量均明显下调(P＜0.05)。病毒滴度约为1×109 IU/mL。 结论： ASIC3 shRNA干扰慢病毒质粒构建成功。     

shRNA介导胰岛素样生长因子Ⅰ类受体基因沉默诱导人肺癌A549细胞凋亡的体内外研究

目的评价RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术对人肺癌A549细胞系中胰岛素样生长因子Ⅰ类受体（IGF-IR）表达的抑制作用及其体内外抑瘤效应。方法将IGF-IR特异shRNA转染人肺癌A549细胞株,检测IGF-IR表达水平和bcl-2及caspase-3的表达变化;MTT法检测体外培养细胞的生长抑制率;流式细胞技术检测细胞增殖周期;Western印迹法分析Akt和ERK磷酸化程度;荷瘤裸鼠肺癌模型中观察瘤内注射的抑瘤效应及凋亡情况。结果IGF-IR表达抑制率达89．8％,bcl-2表达为对照组的46％±6％,caspase-3激活为对照组的156％±8％,Akt、ERK磷酸化分别为对照组的20％和36％±3％;肿瘤细胞活力明显下降;直接瘤内注射后肿瘤体积减少至对照组的40％-50％,并促进肿瘤细胞凋亡。结论运用RNAi技术能有效抑制A549细胞IGF-IR的表达,使细胞增殖能力减弱,凋亡增加,瘤体生长受抑。     

RBM5 基因表达载体构建、稳定转染A549 细胞系的建立及功能的初步研究

目的：通过构建表达载体、建立稳定转染RNA结合基序5(RNA binding motif 5,RBM5)的A549细胞系, 初步研究RBM5基因过表达对A549 细胞增殖以及天冬-谷-丙-组氨酸盒多肽15[DEAH box polypeptide 15,DHX15]表 达的影响。方法：应用分段克隆法构建pcDNA3.1(+)/RBM5真核表达载体;将测序验证后的重组质粒pcDNA3.1(+)/ RBM5转染肺腺癌A549细胞并以G418进行筛选,采用Western印迹鉴定RBM5基因过表达阳性细胞,流式细胞仪分别 检测经pcDNA3.1(+)/RBM5稳定转染的A549细胞[pcDNA3.1(+)/RBM5-A549]及pcDNA3.1(+)空白质粒转染的A549细胞 [pcDNA3.1(+)-A549]的周期分布;运用RT-PCR技术分别检测pcDNA3.1(+)/RBM5-A549和pcDNA3.1(+)-A549细胞中剪 接相关因子DHX15的表达情况。结果：成功构建出pcDNA3.1(+)/RBM5真核表达载体,筛选出RBM5基因稳定转染过 表达阳性细胞株;pcDNA3.1(+)/RBM5-A549较pcDNA3.1(+)-A549细胞处于G1期细胞比例增大、S期细胞比例减小(均 P<0.01);cDNA3.1(+)/RBM5-A549较pcDNA3.1(+)-A549细胞的DHX15表达上调(P<0.01)。结论：成功构建重组质粒 pcDNA3.1(+)/RBM5,并建立了RBM5稳定转染的A549细胞系;初步证实RBM5基因过表达可抑制肺腺癌A549细胞的细 胞周期,并使DHX15表达上调。     

POFUT1对人胃腺癌裸鼠移植瘤微血管生成的抑制作用

目的探讨POFUT1对人胃腺癌裸鼠移植瘤微血管生成的影响及其作用机制。方法制备人胃腺癌BGC823的POFUT1慢病毒低表达及对照组、过表达及对照组细胞模型,分别命名为shRNA-POFUT1-BGC82组、shRNA control-BGC823组、PLV-POFUT1-BGC823组及PLV control-BGC823组。采用皮下成瘤的方法,分别用这4组细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型（每组5只）,观察和测算肿瘤体积。30d后处死裸鼠并取瘤,采用免疫组化方法检测裸鼠瘤组织中VEGF和CD31的表达;Western印迹法检测裸鼠瘤组织中POFUT1和VEGF的表达。结果20只裸鼠全部成瘤,实验过程无死亡。与PLV control组相比,PLV-POFUT1组裸鼠肿瘤体积显著增加（P<0.05）;shRNA-POFUT1较shRNA control组裸鼠肿瘤体积明显偏小（P<0.05）。免疫组化结果显示,与PLV contro1组相比,PLV-POFUT1组瘤组织中VEGF和CD31表达显著增高（P<0.05）;与shRNA control组相比,shRNA-POFUT1组则明显降低(P<0.05)。与shRNA control组相比,shRNA-POFUT1组POFUT1和VEGF蛋白表达水平均显著下调;PLV-POFUT1组较PLV contro1组,其POFUT1和VEGF蛋白水平均显著增强（P<0.05）。结论过表达POFUT1可以显著促进裸鼠移植瘤的增殖和肿瘤微血管形成,低表达POFUT1可抑制裸鼠移植瘤的增殖和肿瘤微血管形成,表明POFUT1在人胃 腺癌裸鼠移植瘤的微血管形成中起着重要的作用,其机制可能与VEGF密切相关。     

泛素连接酶pirh2短发夹状RNA对肺癌细胞生长抑制的实验研究

目的研究pirh2对肺癌生长的影响。方法采用免疫组织化学法检测pirh2在肺癌组织中的表达;构建靶向pirh2基因的短发夹状RNA（shRNA）干扰质粒（psiRNA-Pirh2A和psiRNA-Pirh2B）,并设计阴性对照（psiRNA-Con）组和空质粒（psiRNA-hH1）组,转染A549细胞;实时定量PCR和免疫印迹法分别检测pirh2的mRNA和蛋白的表达。CCK-8法检测A549细胞的增殖;参考CCK-8结果,选取抑制作用较强的一个pirh2干扰质粒进行裸鼠成瘤实验。结果53例肺癌组织中有42例pirh2阳性（79、2％）;psiRNA-pirh2A及psiRNA-pirh2B组细胞生长均慢于正常组（q值分别为6、82、5．63,均P〈0．05）,而psiRNA-Con和psiRNA-hH1组细胞增殖能力差异无统计学意义。正常对照、阴性对照和干扰组裸鼠肿瘤组织重量分别为1．66g±0．21g、1．48g±0.34g和0．59g±0.16g,正常组与阴性对照组之间差异无统计学意义,而干扰组肿瘤重量明显低于正常组,差异有统计学意义（t=6．27,P〈0．05）。结论pirh2过度表达可能是肺癌发生过程中一个重要的环节,成功构建的shRNA表达载体可特异性抑制其在A549细胞中的表达,并在体内外抑制肺癌细胞的生长。     

转染EGFRL858R的肺腺癌细胞中IL-6和VEGF表达水平及其意义

目的: 探讨肿瘤细胞癌基因表皮生长因子受体(EGFR)L858R型突变与肺腺癌恶性转移患者癌细胞中白细胞介素6(IL-6)和血管内皮生长因子(VEGF)表达水平的关系及其意义。方法: 将含EGFRL858R全长基因质粒的载体转染EGFR野生型肺腺癌细胞系H460(EGFRL858R-H460组),空载体转染H460细胞作为对照组(Vec-H460组),QRT-PCR法检测2组细胞中IL-6和VEGFmRNA表达水平。将含IL-6siRNA的载体转染带有EGFRL858R型突变的细胞系H1975(IL-6siH1975组),转染空载体的H1975细胞作为对照组(Vec-H1975组),QRT-PCR法检测2组细胞中IL-6和VEGFmRNA表达水平,Western blotting法检测2组细胞中VEGF蛋白表达水平。结果: 与Vec-H460组比较,EGFRL858R-H460组细胞中IL-6和VEGFmRNA表达水平明显升高(P<0.01);与Vec-H1975组比较,IL-6siH1975组细胞组IL-6和VEGFmRNA表达水平明显降低(P<0.01),VEGF蛋白表达强度明显降低。结论: 肺腺癌细胞系中EGFRL858R型突变可升高肺腺癌患者癌细胞中IL-6和VEGFmRNA表达水平,其中IL-6mRNA水平升高可能是VEGFmRNA表达水平升高的原因,这些变化可能是EGFRL858R型突变参与肺腺癌恶性转移进程的途径之一。